陳玲娟 許世錦 胡文林 謝鳳嬌

廣東天益生物科技有限公司 廣東湛江 524300

紅曲色素是藥食兩用微生物紅曲霉菌(Monascus spp)的次生代謝產(chǎn)物,產(chǎn)生的天然色素是經(jīng)人類世代食用證明的安全色素。紅曲色素具有良好的著色性、熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性和氧化還原劑穩(wěn)定性。作為食品添加劑，紅曲色素被廣泛應(yīng)用于肉制品、調(diào)味品、酒類、腌制蔬菜以及面制品中。紅曲色素是一種屬于聚酮類色素的混合色素[1]，紅曲色素中已經(jīng)探明結(jié)構(gòu)的有10種，其中6種為醇溶性色素，4種為水溶性色素。醇溶性色素有紅斑素、紅曲紅素、紅曲素、紅曲黃素、紅斑胺和紅曲紅胺等[2]。

錢俊青[3](2010)等研究得出提高紅曲色素水溶性的方法，用4mg/mL海藻酸鈉溶液和紅曲色素乙醇提取液以1∶3體積混合，60℃水浴回流40min可以提高紅曲色素的水溶性且對酸的穩(wěn)定性。有研究報(bào)道溶多糖單加氧酶AoAA13能夠促進(jìn)淀粉水解作用提高淀粉的降解速率，能夠促進(jìn)紅曲霉紅曲色素的產(chǎn)量[4]。從米曲霉中克隆得到AoAA13基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到紅曲霉CICC41233，獲得工程菌株紅曲霉AA13-4。發(fā)酵6d，紅曲霉AA13-4的紅曲色素總色價(jià)相比紅曲霉CICC41233提高了12.9%。張曉偉[5](2013)等研究人員通過研究溫度、pH對紅曲色素的溶解度和穩(wěn)定性的影響，得出溫度升高和pH增大會(huì)使色素的溶解性增大。在30～60℃色素較穩(wěn)定，70～100℃色素的穩(wěn)定性減??；pH值5～9紅曲色素水溶液穩(wěn)定，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境都會(huì)對紅曲色素造成不穩(wěn)定。

已有相關(guān)研究報(bào)告說明氨基酸對于紅曲紅色素的合成代謝是一個(gè)非常重要的影響因子[6]。田園[7](2014)等研究表明通過添加4g/L的酪氨酸不僅有利于紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素，還能降低橘霉素的代謝生成量，其余所選氨基酸都不利于黃色素的合成代謝。張斌[8](2016)等研究表明不同的氨基酸種類和含量能顯著影響紅曲色素的組成和產(chǎn)量。當(dāng)組氨酸添加量為7g/L時(shí)，對紅色素合成的增強(qiáng)作用最顯著，其峰值產(chǎn)量提高了32.7%，但紅色素總色價(jià)才達(dá)到86.5u/mL；當(dāng)酪氨酸添加量為7g/L時(shí)，對黃色素合成的增強(qiáng)作用最顯著，其峰值產(chǎn)量提高了24.8%。而異亮氨酸、蛋氨酸的添加使紅色素和黃色素的合成均受到顯著抑制，其余氨基酸對色素合成則表現(xiàn)出不同程度的抑制或者無顯著影響。因此，篩選出對紅色素的合成具有顯著促進(jìn)作用的氨基酸種類及其添加量，有利于提高紅曲色素的產(chǎn)量和單色色素的分離純化與產(chǎn)品制備，從而提升產(chǎn)品附加值以及開發(fā)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫色紅曲霉菌(M.purpureus)，實(shí)驗(yàn)室保存菌株；

可見分光光度計(jì)，722s型，上海儀電分析儀器有限公司；

單層搖瓶機(jī)，SPH-300D，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平，JJ224BC，常熟雙杰測試儀器廠；

生化培養(yǎng)箱，LRH-150，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

潔凈工作臺(tái)，SJ-CJ-LFD，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；

氨基酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖3%，酵母膏5%，瓊脂1.5%，KH2PO40.1%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水1 000mL，pH自然。

1.2.2 搖床種子培養(yǎng)基

葡萄糖5%，蛋白胨2%，玉米漿0.5%，NaNO30.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值

3.5～5.0。

1.2.3 發(fā)酵液培養(yǎng)基

大米粉5.0%，葡萄糖2.0%，黃豆1.0%，玉米漿0.5%，NaNO30.1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值3.5～5.0。

1.2.4 發(fā)酵液培養(yǎng)基(添加氨基酸)

大米粉5.0%，葡萄糖2.0%，黃豆1.0%，玉米漿0.5%，NaNO30.1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，氨基酸0.2%，pH值3.5～5.0。

1.3 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)方法：使用無菌接種針挑選單菌落并移接至新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。挑選其中菌落較大，顏色較深的單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基，每個(gè)菌落接三支斜面，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，培養(yǎng)時(shí)間約7d。

種子液培養(yǎng)方法：用無菌水輕輕洗脫落斜面培養(yǎng)上的孢子，倒入裝有少許玻璃珠的500mL三角瓶中，搖勻靜置。用無菌的吸管吸取孢子懸浮液到種子培養(yǎng)基上，在搖床上放置培養(yǎng)，溫度30±2℃，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間36～48h。

發(fā)酵培養(yǎng)方法：用無菌吸管按接種量8%～10%，將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30±2℃，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間7～8d。

1.3.1 紅曲色素的檢測

按照GB1886.181-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲紅》標(biāo)準(zhǔn)要求檢驗(yàn)。發(fā)酵液色價(jià)檢驗(yàn)方法:用10mL刻度吸管準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液1mL緩慢放入試管中,再加入9mL(70%)乙醇,搖勻,使之徹底溶解20min,用快速濾紙過濾,按色價(jià)的高低變化稀釋倍數(shù),用722s型可見分光光度計(jì)在波長495～505nm測定吸光值[9]。色價(jià)計(jì)算見公式(1)。

色價(jià)(U/mL)=稀釋倍數(shù)×吸光值

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 六種氨基酸對紫色紅曲霉產(chǎn)紅色素的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的氨基酸是經(jīng)過篩選的6種游離氨基酸(組氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸)，添加量均為0.20%，與未添加氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)基(對照組)做對比，分別檢測紅曲紅色素生成的情況。6種氨基酸合成紅色素色價(jià)對比情況見表1，6種氨基酸在同濃度下合成紅色素色價(jià)對比情況見圖1。

表1 6種氨基酸合成紅色素色價(jià)對比情況

圖1 6種氨基酸在同濃度下合成紅色素色價(jià)對比情況

如表1、圖1所示，與未添加氨基酸的對照組相比，6種添加氨基酸的試驗(yàn)組在紅色素的生成趨勢上呈現(xiàn)一致性，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，紅色素生成量逐漸增加，發(fā)酵到一定時(shí)間，紅色素生成量緩慢或者停滯；添加了天門冬酰胺、天門冬氨酸的試驗(yàn)組中紅色素生成量峰值，明顯高于對照組及其他組，表明這兩種氨基酸的添加，會(huì)加快紅色素合成和積累的速率。特別是在發(fā)酵138h，添加了天門冬氨酸實(shí)驗(yàn)組生成紅色素量比對照組提高60.32%，而天門冬酰胺實(shí)驗(yàn)組生成紅色素比對照組提高60.59%。在發(fā)酵174h時(shí)，對照組和氨基酸組合成紅色素量都處于停滯或者緩慢衰退。綜上所得，發(fā)酵時(shí)長在138～162h間是合成紅色素的最高點(diǎn)，天門冬酰胺和天門冬氨酸這兩種氨基酸較其他氨基酸，更適合用于提高紅曲紅的色價(jià)。有研究提及組氨酸[8]對合成紅色素也有增強(qiáng)作用，從而進(jìn)一步探索這兩種氨基酸與組氨酸在不同濃度下發(fā)酵培養(yǎng)生成紅色素的情況。

2.2 不同濃度的氨基酸對紫色紅曲霉合成紅色素的影響

2.2.1 不同濃度的天門冬酰胺對合成紅色素的影響

通過2.1得知添加0.20%的天門冬酰胺比對照組合成紅色素提高了60.59%，現(xiàn)添加0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.40%、0.50%這7種不同的濃度到發(fā)酵培養(yǎng)基中，篩選出合成紅色素最佳的濃度。天門冬酰胺不同濃度合成紅色素色價(jià)情況見表2，圖2。

表2 天門冬酰胺不同濃度合成紅色素色價(jià)情況

圖2 天門冬酰胺不同濃度合成紅色素色價(jià)(u/mL)情況

如表2、圖2所示，隨著天門冬酰胺濃度的提高，試驗(yàn)組中紅色素生成趨勢呈一致性，紅色素產(chǎn)量在各發(fā)酵時(shí)期均隨之增加；當(dāng)天門冬酰胺添加濃度達(dá)到0.3%，138h紅色素生成量達(dá)到659u/mL，峰值比對照組提高了80.05%，增幅最顯著；當(dāng)天門冬酰胺添加濃度繼續(xù)提高至0.40%時(shí)，紅色素合成量略有下降，不再繼續(xù)增加。

2.2.2 不同濃度的天門冬氨酸對合成紅色素的影響

通過2.1得知添加0.20%的天門冬氨酸比對照組合成紅色素提高了60.32%，現(xiàn)添加0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.40%、0.50%這7種不同的濃度到發(fā)酵培養(yǎng)基中，篩選出合成紅色素最佳的濃度。天門冬氨酸不同濃度合成紅色素色價(jià)情況見表3，圖3。

表3 天門冬氨酸不同濃度合成紅色素色價(jià)情況

圖3 天門冬氨酸不同濃度合成紅色素色價(jià)(u/mL)情況

如表3、圖3所示，隨著天門冬氨酸濃度的提高，試驗(yàn)組中紅色素生成趨勢呈一致性，紅色素產(chǎn)量在各發(fā)酵時(shí)期基本隨之增加；有4個(gè)不同濃度的最高點(diǎn)都出現(xiàn)在138h，且差距較小。當(dāng)添加濃度為0.25%，138h紅色素生成量達(dá)到623u/mL，比其余3組偏高一點(diǎn)，比對照組提高了66.13%，增幅最顯著；當(dāng)添加濃度繼續(xù)提高至0.50%或者降低到0.10%，紅色素合成量明顯下降。

2.2.3 不同濃度的組氨酸對合成紅色素的影響

通過2.1得知添加0.20%的組氨酸比對照組合成紅色素提高了0.087%，基本不明顯，參考已知的文獻(xiàn)得知組氨酸在添加量為0.70%時(shí)，合成紅色素的量最顯著?，F(xiàn)添加0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.70%、0.80%這7種不同的濃度到發(fā)酵培養(yǎng)基中，篩選出合成紅色素最佳的濃度。隨著組氨酸添加濃度的提高，試驗(yàn)組中紅色素生成趨勢呈一致性隨之增加；當(dāng)組氨酸添加濃度達(dá)到0.70%時(shí)，138h紅色素生成量峰值比對照組提高了38.3%，增幅最顯著；當(dāng)組氨酸添加濃度繼續(xù)提高至0.80%時(shí)，紅色素合成量呈大幅度下降，甚至低于對照組。其原因可能是添加組氨酸抑制了蘋果酸的積累，從而增強(qiáng)了紅色素的產(chǎn)生[10]；隨著添加組氨酸濃度的提高，抑制蘋果酸積累的效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)添加量超過0.80%，出現(xiàn)反饋抑制，紅色素產(chǎn)量不再增加，甚至出現(xiàn)大幅度下降。結(jié)果見表4。

表4 組氨酸不同濃度合成紅色素色價(jià)情況

3 結(jié)論

在紫色紅曲霉菌液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加不同種類的氨基酸，用低濃度進(jìn)行首輪篩選合成紅色素較高的氨基酸，再進(jìn)行濃度梯度篩選。在6種氨基酸中，天門冬酰胺和天門冬氨酸的試驗(yàn)組中，紅色素生成量峰值明顯高于對照組及其他組；說明在發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加這兩種氨基酸會(huì)加快紅色素合成和積累的速率。添加了0.25%天門冬氨酸實(shí)驗(yàn)組在138h紅色素生成量達(dá)到623u/mL，比對照組提高66.13%；添加0.30%天門冬酰胺在138h紅色素生成量達(dá)到659u/mL，峰值比對照組提高了80.05%。而組氨酸添加濃度達(dá)到0.70%，紅色素生成量峰值最高比對照組提高了38.3%，還是略低于天門冬酰胺和天門冬氨酸合成紅色素的速率。而其他氨基酸則不利于紅色素的合成。

研究結(jié)果將為探究紫色紅曲霉菌液態(tài)發(fā)酵紅曲色素合成機(jī)制，以及構(gòu)建紅曲紅色素的高產(chǎn)發(fā)酵體系提供有益借鑒。