梅雪嬌，閆翔宇，嚴(yán)相平

1 江蘇省藥物研究所有限公司 藥學(xué)部，南京 211816；2 南京科技職業(yè)學(xué)院，南京 210044

鹽酸氨溴索是一種祛痰劑，能促進呼吸道表面活性物質(zhì)的形成，從而改善氣道炎癥；同時能夠促進呼吸道纖毛運動，促使分泌物排出，減少黏液滯留[1]。該藥在臨床上應(yīng)用廣泛，可用于有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急慢性呼吸道疾病，例如慢性支氣管炎急性發(fā)作、喘息型支氣管炎、支氣管擴張、支氣管哮喘、難治性肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病[2，3]。

在對鹽酸氨溴索注射液進行強制降解試驗時發(fā)現(xiàn)，在堿破壞條件下較穩(wěn)定，在酸破壞條件下產(chǎn)生相對主峰保留時間約0.8 處的雜質(zhì)峰，結(jié)合《中國藥典》2020 版及歐洲藥典（EP）10.0 版所列的鹽酸氨溴索的雜質(zhì)譜，該雜質(zhì)為反式-4-（6，8-二溴-1，4二氫喹唑啉-3（2H）基）環(huán)己醇（EP 命名雜質(zhì)B）[4-6]。在光照和氧化強制破壞條件下產(chǎn)生了未知降解產(chǎn)物，經(jīng)查閱文獻尚未有相關(guān)報道。

本研究采用高效液相色譜法和質(zhì)譜法，對鹽酸氨溴索注射液在光照和氧化條件下降解的雜質(zhì)進行收集和結(jié)構(gòu)推測，同時對其雜質(zhì)來源和產(chǎn)生途徑進行研究，為鹽酸氨溴索注射液的工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（Waters 2695配備Waters Quattro Micro API 檢測器）；BSA224S型分析天平（德國賽多利斯公司）；YSEI 藥品強光照射試驗箱；N-EVAP 型氮吹儀。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氨溴索注射液（廠家A，批號201153）；30%雙氧水、磷酸氫二銨為分析純；磷酸、乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：VisionHT C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.01 mol·L-1磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 至7.0）-乙腈（50∶50）；檢測波長：248 nm；流速：1.0 mL·min-1。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式（ESI+），電噴霧電壓3.5 kV；源溫為120 ℃；霧化氣流量為400 L·h-1；錐孔電壓為20 V；氣簾氣流量為50 L·h-1；碰撞能量10 V；碰撞室真空3.5×10-3mbar。

2.3 強制降解雜質(zhì)的制備

2.3.1 光照破壞 取鹽酸氨溴索注射液，以透明量瓶分裝，置于5500 Lx 條件下照射14 天。

2.3.2 氧化破壞 取鹽酸氨溴索注射液與30%雙氧水1∶1 混合，60 ℃水浴上30 min。

由于有關(guān)物質(zhì)檢測所用流動相含磷酸鹽，不宜直接進行在線LC-MS/MS 分析，故將強制降解溶液按《中國藥典》2020 版“鹽酸氨溴索注射液有關(guān)物質(zhì)檢查法”進樣，收集主要雜質(zhì)出峰時的流分，以氮吹儀濃縮吹干，以50%的乙腈溶液復(fù)溶，注射泵直接注入質(zhì)譜儀進行分析。

2.4 氧化破壞雜質(zhì)結(jié)構(gòu)定性

氧化破壞主要雜質(zhì)相對主峰保留時間約為0.5，其余在相對保留時間約0.35、0.8、1.2、1.9 處產(chǎn)生較多雜質(zhì)。逐一進行解析，色譜圖見圖1。

圖1 鹽酸氨溴索注射液氧化破壞的色譜圖

相對保留時間約0.5 的雜質(zhì)，在m/z 391、393、395 顯示出一簇溴同位素峰（豐度1∶2∶1），為分子離子峰。根據(jù)反應(yīng)機理，該雜質(zhì)質(zhì)譜與結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 相對保留時間約0.5 的雜質(zhì)

此雜質(zhì)為氨溴索在雙氧水作用下的氮氧化產(chǎn)物，仲氮化合物這一反應(yīng)較易產(chǎn)生，產(chǎn)物的極性顯著增強，與色譜行為一致。分子離子峰為仲氮上孤對電子被轟擊產(chǎn)生，其主要碎片為m/z 295。產(chǎn)生的裂解路徑見圖3，裂解規(guī)律與結(jié)構(gòu)吻合。

圖3 相對保留時間約0.5 的雜質(zhì)的裂解途徑

相對保留時間約0.35 的雜質(zhì)，同樣在m/z 391、393、395 顯示出一簇溴同位素峰（豐度1∶2∶1），為分子離子峰。根據(jù)反應(yīng)機理推測，該雜質(zhì)為氨溴索在雙氧水作用下，仲氮氧化成羥胺產(chǎn)物，其質(zhì)譜與結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 相對保留時間約0.35 的雜質(zhì)

分子離子峰為M+H 峰，與結(jié)構(gòu)吻合，其主要碎片m/z 295，產(chǎn)生的裂解路徑見圖5。

圖5 m/z 295 的裂解途徑

其分子量及裂解規(guī)律與氮氧化產(chǎn)物一致，但存在羥基，極性大于氮氧化產(chǎn)物，因此，保留時間較氮氧化產(chǎn)物更短。

相對主峰保留時間約0.8 的為已知雜質(zhì)，雜質(zhì)B。產(chǎn)生的途徑為：在氧化下，注射液中的有機物會產(chǎn)生微量甲醛，甲醛與氨溴索加成環(huán)合產(chǎn)生該雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)見圖6。

圖6 相對保留時間約0.8 的雜質(zhì)

氧化破壞，主峰后保留時間約1.2 的雜質(zhì)，在m/z 373、375、377 顯示出一簇分子離子峰（M+H，同位素峰），根據(jù)反應(yīng)機理，推測其結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜見圖7。

圖7 相對保留時間約1.2 的雜質(zhì)

環(huán)己醇上的羥基被雙氧水氧化成羰基，極性弱于氨溴索，在主峰后出峰，與色譜行為一致。對m/z 375 的碎片作進一步轟擊，主要的碎片為m/z 277，其質(zhì)譜圖與產(chǎn)生的裂解途徑見圖8。裂解規(guī)律與結(jié)構(gòu)吻合。

圖8 m/z 277 的質(zhì)譜圖與裂解途徑

相對主峰保留時間約1.9 的雜質(zhì)，在m/z 387、388、389、391 顯示出一簇分子離子峰（M+H，同位素峰），根據(jù)反應(yīng)機理，推測結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜圖見圖9。

圖9 相對保留時間約1.9 的雜質(zhì)

該雜質(zhì)為雜質(zhì)B（結(jié)構(gòu)見圖6），作進一步氧化，是環(huán)己醇上的羥基被氧化成羰基產(chǎn)生的雜質(zhì)，從結(jié)構(gòu)上看，沒有游離羥基，且成六元環(huán)，其極性應(yīng)顯著低于氨溴索，在反向色譜中保留時間較長，與結(jié)構(gòu)吻合。對m/z 387 的碎片作進一步轟擊，產(chǎn)生的主要碎片為m/z 291、262，其質(zhì)譜圖與產(chǎn)生的裂解途徑見圖10。裂解規(guī)律與結(jié)構(gòu)吻合。

圖10 m/z 為291、262 的質(zhì)譜圖與裂解途徑

2.5 光照破壞雜質(zhì)結(jié)構(gòu)定性

光照破壞主要產(chǎn)生相對主峰保留時間約為0.8、0.9、1.9 的雜質(zhì)。逐一進行解析，色圖譜見圖11。

圖11 鹽酸氨溴索注射液光照破壞的色譜圖

相對保留時間約0.8 的雜質(zhì)為已知雜質(zhì)，是雜質(zhì)B。產(chǎn)生的途徑與氧化破壞相似，在光照下該注射液中的有機物會產(chǎn)生微量甲醛，會與氨溴索加成環(huán)合產(chǎn)生該雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)見圖6。

相對保留時間約0.9 的雜質(zhì)，在m/z 299 顯示出分子離子峰（M+H），同位素峰顯著減弱。根據(jù)反應(yīng)機理推測，該雜質(zhì)質(zhì)譜圖與結(jié)構(gòu)見圖12。

圖12 相對保留時間約0.9 的雜質(zhì)

該雜質(zhì)為氨溴索在光照條件下脫溴產(chǎn)物，與氨溴索比對，苯環(huán)上少一個溴，極性略有加大，保留時間略短于氨溴索，與結(jié)構(gòu)吻合。對m/z 299 的碎片作進一步轟擊，產(chǎn)生的主要碎片m/z 199，其質(zhì)譜圖與產(chǎn)生的裂解途徑見圖13。裂解規(guī)律與結(jié)構(gòu)吻合。

圖13 m/z 199 的質(zhì)譜圖與裂解途徑

相對保留時間約1.9 的雜質(zhì)，氧化破壞也產(chǎn)生該雜質(zhì)，該雜質(zhì)質(zhì)譜圖的碎片與氧化破壞相應(yīng)雜質(zhì)的碎片一致。對m/z 387 的碎片進行轟擊，裂解情況也與氧化破壞所產(chǎn)生的相應(yīng)保留時間的雜質(zhì)一致，產(chǎn)生的主要碎片為m/z 291、262。由此判斷，該雜質(zhì)為與氧化破壞相對保留時間約1.9 的雜質(zhì)一致，結(jié)構(gòu)見圖9。

3 討論

氧化和光照破壞的雜質(zhì)，產(chǎn)生途徑明確，結(jié)構(gòu)均與氨溴索相關(guān)，從結(jié)構(gòu)上判斷，不具備遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)。由于發(fā)色母核均完好保存，因此這些雜質(zhì)的響應(yīng)可與主成分相當(dāng)，有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件可有效檢出這些降解產(chǎn)物。本研究為鹽酸氨溴索注射液的工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。