黃和飛，谷 葉，李佳興，夏躍蓮，何水蘭，代秋瓊，呂小波

昆明和合醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司 實(shí)驗(yàn)室，昆明 650106

類固醇是一類脂溶性小分子激素，是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化而來，其中包括雄激素、雌激素、孕激素和腎上腺皮質(zhì)激素，是身體發(fā)育、性成熟及新陳代謝所必需的。類固醇激素的測定在臨床疾病診治中有著重要作用。人體類固醇激素的升高或者降低與一些臨床疾病如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（CAH）、多囊卵巢綜合癥、腎上腺皮質(zhì)功能不全等相關(guān)[1-3]，許多疾病存在類固醇激素的代謝異常，尤其是下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸疾病，且一種疾病常伴有多種類固醇激素異常。如CAH 即是一組因類固醇激素合成途徑中酶缺陷引起的染色體隱性遺傳病，而21-羥化酶缺乏（21-OHD）為最常見類型，導(dǎo)致皮質(zhì)醇合成不足，前體物質(zhì)17-羥基孕酮（17-OHP）增高[4-7]。

目前，類固醇激素的測定主要采用各種不同免疫分析方法，如放射免疫分析法、熒光免疫分析法和時間分辨熒光免疫分析法等。由于人體血清中類固醇激素水平相對較低，對檢測方法要求很高，上述方法雖然能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度，但仍存在交叉反應(yīng)、基質(zhì)干擾、靈敏度和特異性相對不高等情況，使檢測結(jié)果的假陽性率增加，且每種激素的測定需使用不同試劑盒。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）具有一次性可檢測多種物質(zhì)、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。近幾年，國內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室已將該技術(shù)應(yīng)用到臨床檢驗(yàn)的其他領(lǐng)域，包括藥物濃度監(jiān)測、新生兒遺傳代謝病篩查、毒理學(xué)診斷等。

本研究旨在建立一種能同時檢測且較文獻(xiàn)方法靈敏的人血清中6 種類固醇激素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法，給臨床疾病診斷和治療提供可靠的參考方法和指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與藥品、試劑

8050CL 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS日本島津）；醫(yī)用高速離心機(jī)（湖南湘儀公司）；MD200-2 氮吹儀（杭州奧盛公司）；XA105 十萬分之一天平（梅特勒公司）；多管渦旋振蕩器（杭州米歐儀公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：孕酮（P）、17-羥基孕酮（17-OHP）、皮質(zhì)醇（COL）、脫氫表雄酮（DHEA）、雙氫睪酮（DHT）、硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）及對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，均購自西格瑪公司（Sigma），純度≥99.5%；甲醇為色譜純（Merck）；甲基叔丁基醚（Merck）；屈臣氏蒸餾水；生理鹽水替代空白基質(zhì)血清。

方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中的血清樣本，來自昆明和合醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司2020 年7 月份送檢的生物血清樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱量標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇定容，然后分裝并保存于-80 ℃?zhèn)溆?。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，根據(jù)Mayo、Quest 中臨床報(bào)告參考范圍進(jìn)行6 種類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)曲線配制，稀釋液為甲醇∶水=7∶3。

1.2.2 對照品工作液及內(nèi)標(biāo)工作液配制 分別稱取孕酮、17-羥基孕酮、皮質(zhì)醇、雙氫睪酮及內(nèi)標(biāo)5 mg于5 mL 量瓶中，甲醇∶水=7∶3 定容，分別得到對照品儲備液濃度為990.00、990.00、1000.00、990.00 μg·mL-1，用600 μL 離心管分裝，每管分裝體積400 μL，內(nèi)標(biāo)儲備液濃度均為1000.00μg·mL-1，脫氫表雄酮及內(nèi)標(biāo)、硫酸脫氫表雄酮及內(nèi)標(biāo)均為1 mL 液體，濃度1000.00 μg·mL-1，用200 μL 離心管分裝，每管分裝體積100 μL，-80 ℃保存。

根據(jù)上述對照品及內(nèi)標(biāo)母液濃度分別配制6 種類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度分別為孕酮：3.915、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1；17-OH 孕酮：0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL-1；皮質(zhì)醇：3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1；雙氫睪酮：0.08、0.16、0.32、0.63、1.25、2.505.00、10.00 μg·mL-1；脫氫表雄酮：1.17、2.34、4.69、9.39、18.75、37.50、75.00、150.00 μg·mL-1；硫酸脫氫表雄酮：31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00、2000.00、4000.00 μg·mL-1，稀釋液為甲醇∶水=7∶3。類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表1。

表1 類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

1.2.3 樣本前處理 移液槍分別移取10 μL 內(nèi)標(biāo)和100 μL 血清樣本至1.5 mL 離心管，加入甲基叔丁基醚800 μL，振蕩混勻5 min 后離心10 min，取上清液700 μL 用氮?dú)獯蹈?，再用甲?00 μL 復(fù)溶，振蕩混勻1 min，高速離心10 min，最后取上清液90 μL 進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：安捷倫C18（100mm×2.1mm，1.8μm）；流動相A 為純水，流動相B 為甲醇（0.1%FA）（梯度洗脫，見表2）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

表2 液相色譜流動相洗脫程序

1.2.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離（ESI）源，MRM掃描模式，霧化氣流速3 L·min-1，加熱氣流速10 L·min-1，接口溫度300 ℃，DL 溫度300 ℃，加熱塊溫度400 ℃，干燥器流量10 L·min-1。類固醇質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表3 類固醇激素的MRM 質(zhì)譜檢測條件

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS 條件優(yōu)化

為了得到更加穩(wěn)定且靈敏度高的目標(biāo)物響應(yīng)值，采用MRM 模式對化合物離子對（Q1、Q3）進(jìn)行監(jiān)測。首先是質(zhì)譜方法建立和條件優(yōu)化，在儀器已經(jīng)檢定校準(zhǔn)條件下，經(jīng)過3 個步驟：第1 步，Q1 SCAN 確定母離子的質(zhì)荷比；第二步，通過母離子找到產(chǎn)物離子，即子離子；第三步，根據(jù)母、子離子構(gòu)成MRM 離子對，進(jìn)行MRM 電壓和碰撞能優(yōu)化，從中找到最佳電壓參數(shù)。其次，對離子源參數(shù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，以保證目標(biāo)物達(dá)到最佳響應(yīng)強(qiáng)度。最后，優(yōu)化色譜條件，連接LC-MS，并接色譜柱進(jìn)行平衡，設(shè)置流動相比例，使目標(biāo)物類固醇激素與雜質(zhì)干擾峰分離。檢測結(jié)果見圖1～圖12。

圖1 孕酮色譜圖

圖2 孕酮質(zhì)譜圖

圖3 17-OH 孕酮色譜圖

圖4 17-OH 孕酮質(zhì)譜圖

圖5 皮質(zhì)醇色譜圖

圖6 皮質(zhì)醇質(zhì)譜圖

圖7 脫氫表雄酮色譜圖

圖8 脫氫表雄酮質(zhì)譜圖

圖9 雙氫睪酮色譜圖

圖10 雙氫睪酮質(zhì)譜圖

圖11 硫酸脫氫表雄酮色譜圖

圖12 硫酸脫氫表雄酮質(zhì)譜圖

2.2 內(nèi)標(biāo)法定量

利用儀器軟件“LabSolutions”中“Quant Broswer”瀏覽器建立校準(zhǔn)曲線，并分別計(jì)算出血清中6 種物質(zhì)的濃度，以信噪比（S/N）等于3 時所對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為方法的檢測限（LOD），以信噪比（S/N）等于10 時所對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為方法的定量限（LOQ）。類固醇激素的線性擬合、檢測限、定量限結(jié)果見表4。

表4 6 種類固醇激素的線性擬合、檢出限和定量限結(jié)果

2.3 精密度試驗(yàn)

按照“1.2.3”的前處理方法分別進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)，同一臺儀器，日內(nèi)精密度需一天內(nèi)，在不同時間段處理3 批次樣本（低、中、高濃度），每個濃度樣本5 個進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。日間精密度需3 天完成，每天處理一批次樣本（低、中、高濃度），每個濃度樣本5 個進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終分別計(jì)算日內(nèi)、日間低、中、高樣本濃度的平均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（CV）值。6 種類固醇激素精密度結(jié)果見表5。

表5 6 種類固醇激素的精密度結(jié)果

2.4 回收率試驗(yàn)

隨機(jī)選取一份患者血清樣本，避開溶血、乳糜及黃疸不合格標(biāo)本，其中1 份不加標(biāo)準(zhǔn)品，其它3份分別加入低、中、高3 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以“1.2.3”的前處理步驟進(jìn)行處理并重復(fù)測定3 次，計(jì)算回收率。6 種類固醇激素加標(biāo)回收率結(jié)果見表6。

表6 6 種類固醇激素的回收率結(jié)果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍考察

在規(guī)定范圍內(nèi)測定線性關(guān)系：經(jīng)精密稱量，制備一系列供試樣品進(jìn)行測定，制備5 份標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別經(jīng)“1.2.3”的前處理后上樣檢測，以測得的目標(biāo)物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積作為被測物濃度的線性方程。結(jié)果見表7。

表7 6 種類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)線性方程

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

設(shè)計(jì)原則：取6 份來源不同的基質(zhì)樣本（基質(zhì)樣本要求是不同性別、不同年齡段），在同一份高濃度（濃度≥10×基質(zhì)樣本中濃度）的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同基質(zhì)比例的樣本（90%、80%、60%、40%、20%、10%、0 的基質(zhì)），每個基質(zhì)樣本考察7 個不同比例條件，按照《中國藥典》2020 年版四部“9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)方法進(jìn)行，比較待測物峰面積及內(nèi)標(biāo)峰面積比值。之后的操作步驟同“1.2.3”的血樣前處理一致。

6 種類固醇激素在6 批次基質(zhì)血樣所對應(yīng)的7個不同比例條件中，變異系數(shù)均小于15%，結(jié)果表明該方法的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分別考察質(zhì)控樣本4 ℃放置（3、6、15、24、48、72 h）、-20 ℃和-80 ℃放置（1、7、30、90、180、360 d）的穩(wěn)定性，在每個條件下，每份樣本平行制備3 份。17-OH 孕酮、皮質(zhì)醇、孕酮、脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、雙氫睪酮質(zhì)控樣本4 ℃放置72 h、-20 ℃和-80 ℃放置360 天均穩(wěn)定。

3 討論

因免疫法靈敏度低、基質(zhì)干擾大等缺點(diǎn)，為了提高分析檢測的靈敏度，降低基質(zhì)效應(yīng)，目前有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用柱前衍生化法、固相萃取法（SPE）、蛋白沉淀（PPT）結(jié)合固相萃取法（SPE）進(jìn)行前處理提??；但因其存在衍生化法耗時長、固相萃取法成本費(fèi)用高等缺點(diǎn)[8，9]，因此，本研究建立了HPLC-MS/MS 同時測定人血清中6 種類固醇激素濃度的檢測方法。該方法前處理采用簡單經(jīng)濟(jì)的液液萃取，將6個目標(biāo)化合物完全提取后經(jīng)LC-MS/MS 進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，結(jié)果顯示，血清中6 種類固醇激素檢出限（LOD，以S/N≥3 為標(biāo)準(zhǔn)）為0.03～1.25 ng·mL-1；定量限（LOQ，以S/N≥10 為標(biāo)準(zhǔn)）為0.05～2.50 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）≥0.995 0；低濃度樣本日內(nèi)精密度為2.4%～6.2%；中濃度樣本日內(nèi)精密度為2.3%～5.7%；高濃度樣本日內(nèi)精密度為1.3%～5.4%。低濃度樣本日間精密度為0.4%～2.6%；中濃度樣本日間精密度為0.3%～3.9%；高濃度樣本日間精密度為0.2%～4.7%。加標(biāo)回收率為86%～106%。因此，該檢測方法的精密度、回收率完全滿足血清中6 種類固醇激素的定量分析?？梢越o臨床激素相關(guān)的疾病診斷和治療提供可靠的參考方法和指導(dǎo)意義。