李逸飛，周 鐲，曹 園，陳玉根，祁乃喜

1 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，南京 210029；2 南京中醫(yī)藥大學，南京 210023

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)藏象學說的經典理論之一，外邪犯肺累及腸，腸病也會牽連肺，兩者在生理和病理上存在雙向的聯系。肺和腸都是由上皮細胞和固有層組成的黏膜結構，兩者共享相同的免疫調節(jié)機制[1]。與正常人相比，哮喘患者的腸易激綜合征（IBS）發(fā)病率更高[2]。而IBS 和炎性腸?。↖BD）患者患哮喘病的概率會大大增加；此外，大部分IBD 患者存在肺炎或肺功能受損現象，而肺內的高氣道反應性可能會引起腸道炎癥[3]。因此中醫(yī)在治療肺腸疾病時，遵循“肺腸同治”的原則。

烏梅是薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實?！吨袊幍洹?020版述其歸肺、大腸經，具有斂肺澀腸的功效，主治肺虛久咳，久瀉久痢[4]。藥理研究表明[5，6]，烏梅有抗氧化、抗炎、保肝和抗腫瘤等作用，其常與其他藥物配伍治療呼吸道和消化系統的疾病，如哮喘、腹瀉等。

網絡藥理學是以系統生物學理論為基礎，融合藥理學、生物學和現代計算機技術，對中藥成分、作用靶點和作用通路進行全面的可視化分析，從整體性出發(fā)探究藥物與疾病的作用關系[7]。本研究選擇哮喘和腹瀉分別代表肺和腸的疾病，基于網絡藥理學的方法，探究烏梅“斂肺澀腸”功效的作用機制。

1 材料與方法

1.1 烏梅成分信息收集

利用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫收集烏梅成分信息，根據成分的藥物動力學（ADME）參數進行篩選，篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%和化合物類藥性（DL）≥0.18[8]。同時符合以下條件之一的成分也納入候選：①相關文獻報道該成分入血入尿；②TCMSP 數據庫顯示該成分與肺、大腸疾病有相關性；③《中國藥典》2020 版的指標性成分。在TCMSP 數據庫中PubChem 下載上述選取成分的2D 結構，以SDF 格式保存。同時，獲取篩選的有效成分靶點，將靶點信息導入Uniprot（https://www.uniprot.org/）數據庫作統一命名。

1.2 活性成分的靶點預測

登錄Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫，導入烏梅活性成分結構，選定物種為“Homo sapiens”，檢索成分靶點。整合TCMSP 數據庫的靶點信息，去除重復靶點，即得成分-靶點信息。

1.3 成分-靶點圖的構建

將烏梅活性成分和預測靶點導入Cytoscape 3.7.0 軟件，構建成分-靶點網絡圖，見圖1。

圖1 烏梅“成分-預測靶點”網絡

1.4 腹瀉和支氣管哮喘的疾病靶點預測

利用 GeneCards（https://www.genecards.org/）、CTD（https://ctdbase.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫，以“diarrhea”和“asthma”為關鍵詞，檢索“腹瀉”和“哮喘”的相關靶點。Drugbank（https://go.drugbank.com/）數據庫檢索哮喘和腹瀉一線藥物對應的靶點。整合上述靶點信息并去重復，分別得到治療腹瀉和哮喘的靶點。

1.5 篩選核心靶點

利 用 Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平臺將成分-靶點、哮喘-靶點和腹瀉-靶點三者作交集，得到烏梅治療哮喘和腹瀉的共同潛在靶點，將其導入String（https://string-db.org/）數據庫，選擇 “multiple proteins “工具限定物種為“homo sapiens”，獲得蛋白質相互作用信息，并導入Cytoscape 3.7.0 軟件，進行網絡拓撲結構分析，以節(jié)點degree 值反映靶點大小和顏色，構建蛋白互作網絡。

1.6 共有核心靶點的器官定位

利用BioGPS（http://biogps.org/#goto=welcome）數據庫對靶點進行定位，以基因表達大于其在各組織中表達中位數（median）為篩選標準，觀察各基因在肺和大腸的表達情況。

1.7 網絡分析（GO 和KEGG 分析）

將核心靶點導入David（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫，進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，設定閾值P＜0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程。利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/），按P 值大小順序，選取GO 分析結果前10 條，繪制GO 功能富集分析柱狀圖，選取KEGG Pathway分析結果前20 條，繪制通路富集分析氣泡圖。

1.8 分子對接驗證

選取Degree 值排名前五的化合物與排名前三的核心靶點進行分子對接分析。利用Openbabel 軟件將成分結構轉換為mol2 格式，導入Autodock-Tools（v1.5.6）進行加氫、計算電荷、分配電荷、設置可旋轉鍵后保存為“pdbqt”格式。并從PDB（http://www.rcsb.org）數據庫中獲取靶點蛋白結構，去除水分子及原始配體，導入AutoDockTools 進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。運用遺傳算法（Genetic Algorithm）進行對接，計算次數設置為30000，對接完成后，根據結合能值（binding energy）做熱圖，分析結合能大小，使用Py-Mol 軟件對每個蛋白得到的最優(yōu)結合模式繪圖。

2 結果

2.1 化學成分篩選結果

從TCMSP 數據庫檢索到烏梅成分40 個，根據設置條件進行篩選得到活性成分29 個[9-11]，見表1。

表1 烏梅活性成分

2.2 化學成分靶點預測結果

通過Swiss Target Prediction 服務器虛擬篩選，同時整合TCMSP 數據庫的靶點信息，去重復后共得到成分-靶點基因582 個。

2.3 成分-靶點相互作用網絡構建與分析

將其導入Cytoscape 3.7.0 軟件，構建成分-靶點網絡（見圖1）。Degree 值越大，節(jié)點度越大。Dgree值排名前五的化合物分別是WM13（苦杏仁苷）、WM16（三丙酮胺）、WM6（花生四烯酸甲酯）、WM14（槲皮苷）和WM28（Rhamnocitrin 3-rhamnoside）。

2.4 疾病靶點預測結果

以“Athma”為關鍵詞在GeneCard、CTD、TTD 和Drugbank 數據庫檢索，共得到哮喘靶點560 個，以“Diarrhea”為關鍵詞，在上述數據庫進行檢索，共得到腹瀉靶點152 個。

2.5 核心靶點篩選結果

利用Venny 工具將成分-靶點、哮喘-靶點和腹瀉-靶點三者作交集，得到烏梅治療哮喘的潛在靶點160 個，治療腹瀉的潛在靶點42 個，以及治療哮喘和腹瀉共同靶點23 個。將23 個靶點數據導入String 數據庫，將下載的TSV 文件導入Cytoscape 3.7.0 軟件中，以degree 值反映節(jié)點大小和顏色，degree 值越大節(jié)點越大，色調越深，見圖2。

圖2 核心靶點相互作用網絡圖

2.6 核心靶點的器官定位

分別將烏梅治療哮喘、腹瀉及核心靶點導入BioGPS 數據庫，觀察靶點在肺與大腸內的表達（Bio GPS 定位器官沒有大腸，故以定位結腸代替），以基因在肺與大腸內的表達大于其在各組織中表達的中位數為篩選標準。在烏梅治療哮喘的160 個靶點中，大多靶點在結腸中表達顯著（＞中位數），其中LGALS3、PLA2G2A、MYLK、NFKBIA 等靶點在結腸中的表達極為顯著（＞3 倍中位數）；在治療腹瀉的42個靶點中，41 個靶點在肺中的表達顯著，其中MYLK、CES1、TGFB1、MPG 等靶點在肺中表達極為顯著；在治療哮喘和腹瀉的23 個共有核心靶點中，一半以上的靶點在肺與結腸中表達顯著。將23 個核心靶點在肺和大腸中的表達數據作圖，見圖3。

圖3 核心靶點器官定位熱圖

2.7 GO 分析和KEGG 分析

將23 個靶點導入到David 平臺進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，根據P 值確定142 個GO條目（P＜0.05），其中118 個與生物過程相關，主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、免疫反應、對藥物反應、細胞對脂多糖反應、炎癥反應等；10 個與細胞組成（CC）相關，主要涉及細胞外空間、質膜外側、細胞外區(qū)域、細胞表面、質膜組成部分等；14 個和分子功能（MF）相關，主要為細胞因子活性、ATPase 活性（與物質跨膜運動有關）、腫瘤壞死因子受體結合、生長因子活性、異種運輸ATP 酶活性等。見圖4。

圖4 核心靶點GO 功能富集分析

利用David 平臺進行KEGG 通路富集分析，共富集43 條信號通路（圖5 為前20 條通路信息），主要為IBD、結核、百日咳、瘧疾、阿米巴病等。

圖5 核心靶點KEGG Pathway 富集通路分析

2.8 分子對接驗證

將Degree 值排名前五的化合物（苦杏仁苷、三丙酮胺、花生四烯酸甲酯、槲皮苷和Rhamnocitrin 3-rhamnoside）與排名前三的核心靶點TNF（PDB ID：5UUI）、IL-1B（PDB ID：4GAI）和IL-6（PDB ID：1ALU）進行分子對接。一般認為，當分子對接的結合能小于0 時，受體可與配體自發(fā)性結合，若結合能≤-5.0 kJ·mol-1，表明配體有較好的活性[12]。分子對接結果顯示，苦杏仁苷、三丙酮胺、花生四烯酸甲酯、槲皮苷和Rhamnocitrin 3-rhamnoside 五個化合物與TNF、IL-1β、IL-6 結合能均小于0（見圖6），即能與這三個靶點自由結合。利用PyMol 軟件對每個蛋白得到的最優(yōu)結合模式進行繪圖，見圖7，槲皮苷占據了TNF 由氨基酸殘基甘氨酸（GLY）、亮氨酸（LEU）、異亮氨酸（ILE）、丙氨酸（ALA）、天冬酰胺（ASN）、天冬氨酸（ASP）構成的活性腔，其3’-羥基和4’-羥基分別與ASP 形成氫鍵，5-羥基與GLY形成氫鍵，糖基的醇羥基分別與LEU、ILE、ALA、ASN 形成氫鍵；Rhamnocitrin 3-rhamnoside 的酚羥基分別與IL-1β 的GLY、GLN 和LYS 形成氫鍵；苦杏仁苷的腈基和糖基的醇羥基分別與IL-6 的氨基酸殘基GLN、絲氨酸（SER）形成氫鍵。有研究證明，槲皮苷能抑制結腸腺癌細胞Caco-2 單層膜中TNFα 誘導的促炎因子IL-1β、IL-6 的分泌水平和mRNA 表達水平[13]；苦杏仁苷能降低肺心病大鼠血清中TNF-α 水平[14]，并能下調椎間盤炎性退變細胞模型的IL-1β mRNA 水平[15]。

圖6 分子對接結合能熱圖

圖7 烏梅活性成分與靶點蛋白的最佳接合模式

3 討論

烏梅作為臨床常用中藥，它與其他中藥配伍治療呼吸道和消化道疾病，如哮喘、潰瘍性結腸炎、腹瀉等。《本草綱目》述其“斂肺澀腸,治久嗽瀉痢”，現代藥學研究表明，烏梅所含甾醇類具有胃黏膜保護作用，在抗?jié)兎矫姘l(fā)揮重要作用，其中β-谷甾醇能促進結腸癌細胞凋亡；黃酮類化合物具有抗氧化和治療哮喘的作用；其含有的有機酸，起到抑菌作用。

本研究通過網絡藥理學方法，篩選出烏梅治療腹瀉和哮喘的核心成分、核心靶點及通路?；瘜W成分研究表明，苦杏仁苷、三丙酮胺、花生四烯酸甲酯、Rhamnocitrin 3-rhamnoside 和槲皮苷是烏梅發(fā)揮藥效的潛在關鍵成分。研究表明，苦杏仁苷通過調節(jié)哮喘大鼠白三烯B4（LTB4）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-K-PGF1α）和組胺（HIS）水平發(fā)揮止咳平喘的作用[16]；此外，苦杏仁苷對不同大鼠潰瘍模型起治療作用[17]。李欽等[18]研究發(fā)現，槲皮苷能減輕大鼠潰瘍性結腸炎的病變程度并降低MDA、MPO 的水平，以發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。

靶點篩選結果顯示，TNF、IL-6、IL1β、CXCL8 等具有較大的度值，提示這些靶點可能是烏梅發(fā)揮“斂肺澀腸”的核心靶點。腫瘤壞死因子（TNF）家族主要包括TNF-α 和TNF-β。作為一種促炎性細胞因子，TNF-α 在多種炎性反應中起作用。盡管TNFα 引起哮喘氣道炎癥的作用機制尚不清楚；但是能在哮喘患者的呼吸道中檢查出TNF-α mRNA 和增加相關蛋白質含量。同時給予哮喘患者TNF-α 能夠直接引起呼吸道應激[19]。此外，離子轉運體與感染性腹瀉的病理生理過程密切相關。在潰瘍性結腸炎中，TNF-α 能引起上皮細胞鈉離子通道（ENaC）的表達下降。同時，在人類腸上皮細胞中，TNF-α 激活核因子NF-κB，進而通過p65 與DRA（Down-regulated in adenoma）啟動子的直接結合降低DRA 的表達[20]。IL-6 由慢性或急性炎癥部位產生，研究表明，IL-6的釋放能引起呼吸道中緩激肽受體數量的增加，從而引發(fā)呼吸道炎癥反應[21]。在腸易激綜合癥患者中，特別是存在腹瀉的患者，促炎性因子IL-6 的表達會顯著的增加，而IL-1β 也可能是引起腸易激綜合癥發(fā)病的一大誘因[21]。同時，在慢性阻塞性肺疾病、呼吸系統感染和中性粒細胞哮喘的患者的患者中，會出現IL-1β 炎性反應，經研究發(fā)現，哮喘患者中性粒細胞氣道炎癥、疾病嚴重程度與類固醇抵抗及IL-1β 表達相關[22]。CXCL8 是一種趨化因子，通過兩個G 蛋白偶聯受體CXCR1 和CXCR2 介導其作用，其編碼的蛋白質白細胞介素-8（IL-8）是CXC 趨化因子家族的一員，是炎癥反應的主要介質。CXCL8 與哮喘及炎性腸病等炎癥疾病的發(fā)病機制相關，哮喘患者氣道上皮細胞CXCL8 表達增加；而在胃腸道環(huán)境中，炎性應激反應會觸發(fā)核苷酸的釋放而引發(fā)組織炎癥，并通過激活P2Y6 受體產生CXCL8/IL-8[23]。

在烏梅治療哮喘和腹瀉的23 個共同靶點中，絕大部分的靶點能在肺與結腸中顯著表達。其中，LGALS3、PLA2G2A、TGFB1、MYLK 等與炎癥反應相關。TGFB1 是炎性因子，它與哮喘免疫性炎癥通路相關，而且在與哮喘相關的氣道重塑中起到關鍵作用，在潰瘍性結腸等炎性腸病中，TGFB1 的表達增加[24]。MYLK 基因編碼的蛋白參與炎癥反應，與氣道高反應性和哮喘相關的活動有關，也是胃腸道運動所必需的蛋白質[25]。

GO 富集分析提示，烏梅可能通過一氧化氮生物合成中的正調控、免疫反應、炎癥反應等生物過程發(fā)揮作用。一氧化氮是細胞內遞質，有調節(jié)細胞功能、參與組織炎癥與損傷的作用，是哮喘、潰瘍性結腸炎等疾病的重要促炎因子。研究表明，患者呼出的一氧化氮水平與哮喘的臨床癥狀、嗜酸性粒細胞增多癥和嗜酸性粒細胞活化標志物相關。在消化道潰瘍患者病變黏膜中，NO 濃度與炎癥程度正相關[26]。而哮喘和多種炎性腸病均與免疫反應、炎癥反應等多種因素相關。KEGG 富集分析揭示，核心基因與多個呼吸道和消化道疾病相關通路高度相關，包括IBD、結核、百日咳、瘧疾、阿米巴等通路。以上結果都印證了烏梅“斂肺澀腸”功效的生物學機制。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法對其潛在活性成分、作用靶點、分子網絡以及靶點的器官定位進行了探索性研究，結果顯示，烏梅通過多成分、多靶點、多途徑的方式發(fā)揮“斂肺澀腸”的功效。