朱寫譯，黃金路，李欣燕*

1上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；2上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 200233

國際疼痛研究學(xué)會（International Association for the Study of Pain，IASP）于2020 年對疼痛的定義進行了更新，將疼痛定義為一種與實際存在或潛在的組織損傷相關(guān)的令人不快的感覺和情感體驗，或與其相似的經(jīng)歷［1-2］。按照病程分類，疼痛可分為急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛為新近產(chǎn)生的、持續(xù)時間較短的疼痛，與明確的損傷或疾病有關(guān)，有著急性警告的功能。慢性疼痛被認為是持續(xù)超過正常愈合時間的疼痛，通常當疼痛持續(xù)或復(fù)發(fā)超過3～6 個月時可被視為慢性疼痛，其嚴重損害患者的身心健康［3］。在中國，約30%的人口受到慢性疼痛的困擾，其中大部分是年長患者，尤其是65 歲以上的老年人，有80%～85%的人患有疼痛相關(guān)疾?。?］。當患者處于長期疼痛難忍的狀態(tài)下，不僅會影響患者的身體功能，通常還會伴隨有焦慮、抑郁等心理疾病的發(fā)生，嚴重影響患者的正常生活。同時，長期的疼痛治療也會給患者和社會造成巨大經(jīng)濟負擔。目前，臨床上治療疼痛的藥物主要有非甾體類抗炎藥、阿片類藥物以及一些輔助性鎮(zhèn)痛藥物。然而這些藥物在臨床上使用時，在安全性和有效性方面存在一定局限性，因此對新型鎮(zhèn)痛藥存在緊迫的需求。

生長分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF?15），又稱巨噬細胞抑制性細胞因子1（macro?phage inhibitory cytokine?1，MIC?1）、NSAID激活基因?1（NSAID activated gene?1，NAG?1）、胎盤轉(zhuǎn)化生長因 子?β（placental transformation growth factor?β，PTGFB）或前列腺衍生因子（prostate derived factor，PDF）［5］，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF?β）超家族成員。它是由Bootcov等［6］于1997 年首次從人骨髓單核細胞系U937 的cDNA 文庫中分離并鑒定出，由308個氨基酸組成，在N端含有29個氨基酸的信號肽，成熟肽的長度為195～308個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)GDF?15在細胞內(nèi)以多種形式存在：GDF?15前體單體（40 kDa）、GDF?15前體二聚體（80 kDa）以及成熟的GDF?15 二聚體（30 kDa）［5］。GDF?15受體膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族α樣受體（glial cell?line derived neurotrophic factor receptor alpha?like，GFRAL）是膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）的成員。在功能上，GDF?15與多種疾病相關(guān)，目前已報道的有肥胖［7］、糖尿?。?］、心衰和心肌梗死［9］、慢性阻塞性肺疾?。?0-11］、癌癥及惡病質(zhì)［12］以及炎癥［13］。然而，GDF?15 在疼痛中的作用目前研究很少，機制尚不十分清楚。因此，本研究采用經(jīng)典的福爾馬林誘導(dǎo)雙相疼痛模型探討了GDF?15 對疼痛的作用，并在此基礎(chǔ)上初步探究了GDF?15的鎮(zhèn)痛作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

重組人GDF?15 蛋白（His 標簽）（貨號：10936?H07Y，北京義翹神州有限公司）；Anti?GFRAL 兔多克隆抗體（貨號：ab235111，Abcam公司，美國）；神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）鼠單克隆抗體、離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium bind?ing adapter molecule 1，Iba?1）鼠單克隆抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鼠單克隆抗體（Millipore 公司，德國）；Alexa?555?標記的羊抗兔二抗、Alexa?488 標記的羊抗小鼠二抗（Invitrogen 公司，美國）；TRIzol（Thermo Fisher 科技公司，美國）；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo 有限公司，日本）；Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（上海翌圣生物科技股份有限公司）。

激光共聚焦顯微鏡SP8 型、恒溫冰凍切片機切片（Leica公司，美國）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（Bio?Rad Labo?ratories 公司，美國）；熒光實時定量PCR 儀（Eppen?dorf有限公司，德國）。

8～12周齡雌性KM小鼠（體重22～25 g左右），購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2003?0003。飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22 ± 2）℃，濕度為（55 ±5）%，光照時間為7：00～19：00，水與食物供應(yīng)充足，可自由攝取。所有動物實驗均經(jīng)上海交通大學(xué)實驗動物倫理與使用委員會批準（批準編號：202201002）。

1.2 方法

1.2.1 福爾馬林誘導(dǎo)雙相疼痛模型的建立與給藥方法

GDF?15鞘內(nèi)注射給藥：16只KM小鼠分2組，每組8 只，分別為溶劑對照組和實驗組。實驗前將小鼠放置于透明有機玻璃制成的觀察籠中30 min以上以適應(yīng)環(huán)境。實驗組鞘內(nèi)注射GDF?15溶液（50 ng，由生理鹽水配制，體積為5 μL），溶劑對照組則鞘內(nèi)注射生理鹽水5 μL。小鼠鞘內(nèi)注射具體方法為：小鼠仰臥位固定，覆蓋其頭部待其冷靜，左手食指與拇指定位小鼠髂骨處，右手食指沿脊柱尋找到髂骨中線處的L5、L6 椎節(jié)間隙并標記，將注射器針頭沿60°夾角插入標記處，當感覺到阻力時，將角度調(diào)整為30°夾角，并將針尖插入L5、L6 椎間隙中，如小鼠出現(xiàn)甩尾或后肢抽動表示操作成功，緩慢將GDF?15溶液或生理鹽水注入蛛網(wǎng)膜下腔，控制注射時間為10～30 s，不可速度過快，注射完成后輕輕旋轉(zhuǎn)針頭拔出，觀察小鼠是否恢復(fù)正常運動功能，恢復(fù)后即可進行后續(xù)實驗。

給藥后立即在小鼠左足部皮下注射濃度為5%的福爾馬林溶液（由0.9%生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用）10 μL，注射后將小鼠放回觀察籠內(nèi)。分別記錄小鼠在注射福爾馬林后0～5 min（Ⅰ相急性疼痛期）和20～40 min（Ⅱ相炎性疼痛期）內(nèi)疼痛反應(yīng)（舔足/咬足）總時長。

GDF?15腹腔注射給藥：32只KM小鼠分4組，每組8只，分別為溶劑對照組和3個不同劑量GDF?15實驗組。實驗前將小鼠放置于透明有機玻璃制成的觀察籠中30 min以上以適應(yīng)環(huán)境，給藥方式為腹腔注射GDF?15 溶液，分為高劑量組（100 μg/kg）、中劑量組（30 μg/kg）和低劑量組（10 μg/kg），均由生理鹽水配制，溶劑對照組腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。給藥后30 min在鼠左足部皮下注射濃度為5%的福爾馬林溶液（由0.9%生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用）10 μL，分別記錄小鼠在注射福爾馬林后0～5 min（Ⅰ相急性疼痛期）和20～40 min（Ⅱ相炎性疼痛期）內(nèi)疼痛反應(yīng)（舔足/咬足）總時長。

1.2.2 蛋白免疫印跡

取小鼠大腦、小腦以及脊髓組織，RIPA 組織裂解液（已含10%的蛋白酶抑制劑PMSF）提取總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度，加入5×SDS 上樣緩沖液后，100 ℃條件下蛋白變性，-20 ℃保存。取等量蛋白進行SDS?PAGE 凝膠電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃一抗孵育過夜，一抗包括GAPDH 抗體（1∶20 000）以及GFRAL 抗體（1∶1 000），TBST 漂洗4次，每次10 min，室溫相應(yīng)二抗孵育1 h，TBST漂洗4 次，每次10 min。用Image J 軟件對蛋白條帶進行掃描分析，以GAPDH 條帶（36 kDa）為內(nèi)參，比較目的蛋白條帶（45 kDa）的表達水平。

1.2.3 組織免疫熒光

小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，用20 mL 生理鹽水和20 mL 4%的多聚甲醛進行灌注。灌注結(jié)束后取出脊髓置于生理鹽水中，剝離脊髓外膜，將脊髓腰膨大部分置于4%多聚甲醛中過夜，不同濃度蔗糖溶液依次進行脫水，脫水完成后使用OTC 進行包埋，并用Leica 恒溫冰凍切片機切片，附于多聚賴氨酸處理的載玻片上。用含0.5%Triton?X100和5%BSA的PBS室溫封閉60 min，一抗4 ℃孵育過夜，一抗包括GFRAL 抗體（1∶50）、Iba?1 抗體（1∶100）、GFAP 抗體（1∶100）以及NeuN 抗體（1∶100），PBS 漂洗3 次，用相應(yīng)二抗室溫孵育60 min，PBS漂洗4次，并用含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片。Leica激光共聚焦顯微鏡SP8 型進行觀察。

1.2.4 RT?PCR

鞘內(nèi)給藥即中樞給予GDF?15 進行福爾馬林雙相疼痛實驗后，處死小鼠，取出脊髓組織，用TRIzol提取所取組織中的總RNA，按cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟與程序制備cDNA，根據(jù)qPCR SYBR Green Master Mix 兩步法反應(yīng)體系對cDNA 進行擴增。內(nèi)參為β?actin，用2-ΔΔCt法計算RNA表達量。白細胞介素（interleukin，IL）?6、IL?1β、前腦啡肽（proenkeph?alin，PENK）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）?α、強啡肽原（prodynorphin，PDYN）、β?actin引物序列如表1。

表1 RT?PCR引物序列Table 1 RT?PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 7.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均值±標準誤（）表示。兩組之間的比較采用非配對t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），兩兩比較采用SNK?q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中樞給予GDF?15對小鼠福爾馬林誘導(dǎo)雙相疼痛反應(yīng)的影響

在福爾馬林雙相疼痛實驗中，比較0～5 min（Ⅰ相急性疼痛期）以及20～40 min（Ⅱ相炎性疼痛期）內(nèi)舔足和咬足的總時長作為痛閾值，結(jié)果如圖1所示，在Ⅱ相炎性疼痛期，與溶劑對照組相比，GDF?15鞘內(nèi)給藥組小鼠舔足和咬足的總時長顯著降低（P＜0.05）；而兩組小鼠的Ⅰ相急性疼痛期舔足和咬足的總時長差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 鞘內(nèi)注射GDF?15對福爾馬林誘導(dǎo)雙相疼痛的影響Figure 1 Effects of intrathecal injection of GDF?15 pro?tein on formalin induced pain

2.2 系統(tǒng)性給予GDF?15對小鼠福爾馬林誘導(dǎo)雙相疼痛反應(yīng)的影響

在Ⅰ相急性疼痛期，各劑量的GDF?15 腹腔注射組與溶劑對照組相比，福爾馬林Ⅰ相急性疼痛期閾值無顯著性差異（圖2A）；而在Ⅱ相炎性疼痛期，與溶劑對照組相比，各劑量的GDF?15 腹腔注射組小鼠的舔足和咬足的總時長均顯著性降低，且呈劑量依賴性，最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)Emax可達到82.2%，半數(shù)有效量ED50為14.0 μg/kg（圖2B）。

圖2 腹腔注射GDF?15蛋白對福爾馬林雙相疼痛的影響Figure 2 Effects of intraperitoneal injection of GDF?15 protein on formalin induced pain

2.3 GDF?15特異性受體GFRAL的表達部位

GDF?15 的特異性受體GFRAL 在中樞系統(tǒng)的大腦、小腦以及脊髓中均有蛋白表達（圖3A）。而根據(jù)組織免疫熒光結(jié)果（圖3B）顯示，在脊髓背角中，GFRAL蛋白與神經(jīng)元標志物蛋白NeuN存在顯著共染，且不與小膠質(zhì)細胞標志物蛋白Iba?1 共表達，也不與星形膠質(zhì)細胞標志物蛋白GFAP 共表達。

圖3 GFRAL的表達情況Figure 3 Expression of GFRAL

2.4 中樞給予GDF?15對IL?6、IL?1β、TNF?α、PDYN以及PENK的mRNA表達的影響

GDF?15 鞘內(nèi)注射組福爾馬林誘導(dǎo)雙相疼痛模型小鼠的脊髓中IL?6和TNF?α的表達量相較溶劑對照組顯著降低（圖4）。GDF?15處理組脊髓中IL?6的mRNA 表達降低至對照組的54%（P<0.05），TNF?α的mRNA 表達降低至對照組的28%（P<0.005），GDF?15 處理組脊髓中IL?1β、PDYN 以及PENK mRNA 與對照組相比均有不同程度的升高，但兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 鞘內(nèi)注射GDF?15 對福爾馬林小鼠IL?6、TNF?α、PDYN、PENK和IL?1β mRNA表達的影響Figure 4 Effects of intrathecal injection of GDF?15 on the mRNA expression of IL? 6，TNF?α，PDYN，PENK and IL?1β

3 討論

GDF?15被發(fā)現(xiàn)在多種疾病中明顯上調(diào)，被認為是許多疾病的標志物。本研究創(chuàng)新性地研究了GDF?15 與疼痛之間的關(guān)系。采用了經(jīng)典的福爾馬林誘導(dǎo)疼痛模型，在實驗動物的后足背部皮下注射福爾馬林后可以產(chǎn)生雙相疼痛反應(yīng)：Ⅰ相急性疼痛和Ⅱ相炎性疼痛。Ⅰ相急性疼痛主要是因為初級傷害性傳入神經(jīng)的直接活化而引起的急性疼痛，而Ⅱ相炎性疼痛則涉及炎癥引起的脊髓背角中樞敏化［14］。在本實驗室，福爾馬林模型已被用于多個鎮(zhèn)痛靶點的驗證：D?型氨基酸氧化酶［15］（D?amino acid oxidase，DAAO）、甘氨酸受體［16］（glycine receptor，GlyR）、胰高血糖素樣肽?1受體［17］（glucagon?like pep?tide 1 receptor，GLP?1R）等，同時針對這些靶點在該模型上也篩選了數(shù)十個有鎮(zhèn)痛作用的小分子化合物、中草藥成分、大分子多肽類等，其中小分子化合物有CBIO［15］（DAAO 特異性抑制劑）、鉤吻堿［16］（α3甘氨酸受體激動劑）等，中草藥有京尼平苷［17］、烏頭類生物堿［18］、花椒素［19］等；多肽類有艾塞那肽等。

本研究首先通過中樞給藥方式證明了GDF?15對福爾馬林誘導(dǎo)的Ⅱ相炎性疼痛有顯著鎮(zhèn)痛作用，而對福爾馬林誘導(dǎo)的Ⅰ相急性疼痛未見明顯作用。本研究也對GDF?15在中樞的作用靶點進行了初步探究。GFRAL是GDNF的成員，在2017年被鑒定為GDF?15 的特異性受體，GDF?15 高度特異性地結(jié)合到GFRAL 后，募集Ret 與之結(jié)合，發(fā)揮一系列病理生理作用［8，20-22］。根據(jù)Hsu等［22］報道，GFRAL僅在腦干的最后區(qū)和孤束核中表達。但2005 年我國科學(xué)家在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種GDNF 受體α樣（GDNF receptor?α like，GRAL）基因［23］，其編碼的蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括大腦、小腦和脊髓中表達，氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)GRAL 與GFRAL 為同一蛋白。本研究中通過Western blot 和組織免疫熒光方法確定了GDF?15 特異性受體GFRAL 在大腦、小腦以及脊髓中均存在表達，并首次提出在疼痛產(chǎn)生的關(guān)鍵部位脊髓背角中，GFRAL僅在神經(jīng)元細胞上表達。提示GDF?15 可能通過脊髓背角神經(jīng)元上的GFRAL受體發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用，但此推論需要進一步實驗，如設(shè)計GFRAL 小干擾RNA 和采用電生理技術(shù)等進行驗證。

此外，諸多研究表明GDF?15 是一種與炎癥相關(guān)的因子［13，24］。當炎癥發(fā)生時，GDF?15起到保護作用。在體內(nèi)實驗中，給予脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠誘導(dǎo)CD45+/CD11b+骨髓細胞中GDF?15表達，而體外實驗中，給予LPS能夠使骨髓來源的巨噬細胞中GDF?15 的表達增加［13］；在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠靜脈給予GDF?15 可阻止LPS 和D?半乳糖胺誘導(dǎo)的炎癥，其機制可能是通過降低IL?6、TNF?α和IL?1β的表達［25］。Kim 等［26］利用NAG?1/GDF?15轉(zhuǎn)基因小鼠證明其減低LPS 的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為NAG?1/GDF?15 轉(zhuǎn)基因小鼠血清炎癥因子（IL?6、MCP?1、TNF等）表達量較野生型降低。本研究通過檢驗中樞給予GDF?15對福爾馬林誘導(dǎo)疼痛模型小鼠脊髓IL?6、IL?1β、TNF?α、PDYN 以及PENK 的mRNA 表達的影響，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，GDF?15 可以降低福爾馬林誘導(dǎo)疼痛模型小鼠脊髓中促炎因子IL?6和TNF?α mRNA 的表達，提示抑制促炎因子IL?6 和TNF?α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有可能是GDF?15 發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機制之一。另外，考慮到GDF?15 的特異性結(jié)合受體GFRAL主要表達于脊髓背角神經(jīng)元上，而脊髓中IL?6 和TNF?α主要由膠質(zhì)細胞分泌，因而鞘內(nèi)給予GDF?15 引起IL?6 和TNF?α減少可能是由于神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞之間存在著相互作用。近年來，越來越多的研究表明在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間存在雙向信息交互，一方面膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)做出反應(yīng)，另一方面又通過釋放影響神經(jīng)元和突觸活動的細胞因子發(fā)揮其作用［27］。有報道稱，在骨癌痛模型中，通過鞘內(nèi)注射能夠阻斷神經(jīng)元活化的c?Fos 反義寡核苷酸探針（c?Fos ASO）后，星形膠質(zhì)細胞的活化也會受到抑制［28］。另有研究表明，慢性疼痛中，脊髓背角神經(jīng)元上的大量膜結(jié)合型趨化因子CX3CL1轉(zhuǎn)變?yōu)闉橛坞x型CX3CL1，與小膠質(zhì)細胞獨有的CX3CR1 受體結(jié)合，促進小膠質(zhì)細胞活化，釋放促炎細胞因子如TNF?α、IL?1β、IL?6等以介導(dǎo)疼痛信息的傳遞，形成神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞之間的相互作用［29］。因而可以推測鞘內(nèi)注射GDF?15 可能作用于脊髓背角神經(jīng)元上的受體GFRAL 繼而通過神經(jīng)元?膠質(zhì)細胞信號通路影響膠質(zhì)細胞的功能，但這一推測尚需要進一步實驗進行論證。

本研究還發(fā)現(xiàn)，通過系統(tǒng)性給藥方式給予GDF?15對福爾馬林誘導(dǎo)Ⅱ相炎性疼痛有顯著鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛作用呈劑量依賴性。根據(jù)Hsu 等［22］的報道，GDF?15 的特異性受體GFRAL 不在外周組織中表達。但有學(xué)者認為在代謝疾病、組織損傷、炎癥和癌癥等病理條件下，GDF?15表達升高所產(chǎn)生的作用是否都依賴于GFRAL仍有待確定，鑒于GDF?15對未檢測到GFRAL的細胞和組織也能產(chǎn)生多種作用［30］，合理推測GDF?15可能存在不依賴GFRAL的作用或可能存在GFRAL 以外的尚未被識別的受體。也有報道支持了此推測，Lin 等［31］研究發(fā)現(xiàn)外周給予GDF?15 可以通過抑制大鼠初級感覺神經(jīng)元中的河豚毒素抗性Nav1.8 鈉通道活性產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。因此，系統(tǒng)性給予GDF?15如何發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，還有待進一步研究。

GDF?15具有豐富的生物多效性，參與多種疾病過程。在心肌梗死期間，GDF?15可抑制心肌細胞凋亡并保護心肌；在腫瘤發(fā)生過程中，GDF?15 水平升高，發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用；GDF?15 也參與代謝過程，并顯示出優(yōu)化代謝的效應(yīng)。這些保護效應(yīng)使得GDF?15備受醫(yī)學(xué)界重視。GDF?15已被公認為一種與心力衰竭、糖尿病、腎病和癌癥等多種疾病狀態(tài)相關(guān)或預(yù)測不良臨床結(jié)果的生物標志物［32］。而本研究結(jié)果則豐富了GDF?15 的生物學(xué)功能，為充分了解GDF?15的作用增加了證據(jù)?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)GDF?15可能是一個有效的鎮(zhèn)痛分子，為疼痛的治療提供了另一個可能途徑。