段麗珍，郭莉莉，柏根基

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院影像中心，江蘇 淮安 223300

膠質(zhì)瘤是成人最常見且惡性程度較高的原發(fā)性腦腫瘤［1-2］。膠質(zhì)瘤很少被治愈，低級別膠質(zhì)瘤的中位生存期為11.6年，而高級別膠質(zhì)瘤患者的中位生存期不足3年［3-6］。超順磁性氧化鐵納米顆粒（su?perparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIO）是一種具有良好生物相容性的納米粒子，作為磁共振成像（magnetic resonance image，MRI）陰性對比劑在實驗研究中具有重要地位［7-8］。而具有靶向性能的MRI 分子探針，因其可以反映體內(nèi)特定生物分子的特征，評價組織的微結(jié)構(gòu)變化，對于實現(xiàn)疾病的定性診斷具有重要意義［9］。

P53基因參與調(diào)解細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，其突變產(chǎn)物P53蛋白高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞癌變，并加快癌細(xì)胞的生長發(fā)育，加重惡變程度［10］。多項研究表明腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞存在P53蛋白的過表達(dá)，是腦膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵生物標(biāo)志物［11-12］。本研究設(shè)計了P53標(biāo)記的靶向超順磁性氧化鐵納米顆粒SPIO?PLA?P53，用于腦膠質(zhì)瘤的特異性MRI，為腦膠質(zhì)瘤的診斷提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（長沙豐暉生物科技有限公司），SPIO（中科雷鳴北京科技有限公司），聚乳酸?聚乙二醇?羧酸（PLA?PEG?COOH）（西安瑞禧生物科技有限公司），氯仿、2?（N?嗎啡啉）乙磺酸［2?（n?morphorphine）ethanesulfonic acid，MES］、1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1?（3?dimeth?ylaminopropyl）? 3?ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），N?羥基琥珀酰亞胺（N?hydroxysuccinimide，NHS，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），P53（1C12）Mouse mAb（上海超研生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 C6細(xì)胞表面P53抗原檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面及內(nèi)部P53蛋白的表達(dá)情況。

1.2.2 靶向分子探針的合成

SPIO?PLA 分子探針的合成：向裝有30 g PLA?PEG?COOH粉末的離心管中加入1 mL氯仿，超聲波溶解，隨后加入10 mg 的SPIO溶液混勻，注入10 mL水乳化攪拌過夜。待有機溶劑揮發(fā)完全后，洗滌PLA?PEG?COOH 4 次，將樣品4 ℃保存?zhèn)溆?。計算所得樣品的鐵濃度。

SPIO?PLA?P53 分子探針的合成：取2 mg 的SPIO?PLA 置于超濾管中，用MES 緩沖溶液（pH=5.51）洗滌2 次，稀釋至2 mL，分別加入0.3 mg EDC和0.6 mg NHS活化，超濾2次，加入260 μg的P53抗體，混合、攪拌過夜。將所得樣品超濾4次。最后測試鐵濃度，將其稀釋至1 mg/mL。

1.2.3 納米探針的物理性質(zhì)檢測

透射電鏡掃描SPIO?PLA?P53分子探針：取2 μL混合均勻的SPIO?PLA?P53 溶液滴于300 目的銅網(wǎng)上，自然干燥30 min，除去多余液體，置于透射電鏡下觀察納米粒子的大小及形態(tài)。

分子探針的動態(tài)散射及Zeta 電勢測定：分別用超聲波清洗劑將1%SPIO?PLA及1%SPIO?PLA?P53溶液分散均勻，過濾后加入石英比色皿中，在波長633 nm 的He/Ne激光下對樣品進(jìn)行測定。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及荷瘤大鼠模型構(gòu)建

C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞在RPMI 1640 培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。選取9只Wistar雄性大鼠（6～8周，體重200～250 g），本研究獲得淮安市第一人民醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn)（編號：DW?P?2021?014?01）。大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水，備皮，麻醉，消毒，鋪巾。俯臥位將大鼠固定于立體定儀內(nèi)，以兩側(cè)內(nèi)眥連線中點為起點，切開頭皮，于前囟中點前l(fā) mm，中線右旁開3 mm，用圓頭牙科鉆孔，有落空感時立刻停止，用微量注射器抽取10 μL 單細(xì)胞懸液（1×106個/mL），沿骨孔緩慢垂直進(jìn)針，約至硬腦膜下6 mm處停止，停針約5 min（擴容），再退回1 mm，隨后緩慢均勻注射10 min（1 μL/min），注射完畢停留5 min，結(jié)束后緩慢拔針，用EC膠封住骨孔，縫合消毒。

1.2.5 細(xì)胞毒性實驗

用CCK?8 法檢測C6 細(xì)胞活力。將C6 細(xì)胞以2×104個/孔接種于96 孔板上。分成3 組，第1 組不做任何處理，第2 組用200 μg/mL 的SPIO?PLA 納米探針溶液替換培養(yǎng)基，第3 組用200 μg/mL 的SPIO?PLA?P53納米探針溶液替換培養(yǎng)基，將上述3組細(xì)胞于培養(yǎng)箱中孵育48 h 后加入培養(yǎng)基及10 μL CCK?8液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后用酶標(biāo)儀測量光密度值并記錄細(xì)胞活性。

1.2.6 分子探針檢測體外血腦屏障通透性

常規(guī)培養(yǎng)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（RCMEC），隨機分為3 組，1 組為對照組，另外2 組作為實驗組。實驗組分別在培養(yǎng)皿中加入200 μg/mL 的SPIO?PLA及SPIO?PLA?P53納米探針溶液，對照組不作特殊處理，孵育48 h。隨后制備單細(xì)胞懸液并置于EP管中并進(jìn)行MRI T2WI成像。采用7.0 T小動物專用磁共振儀及配套線圈采集圖像。掃描參數(shù)如下：TR：3 000 ms；TE：36 ms；FOV：3.2 cm×3.2 cm；層厚：1 mm；層間距：1 mm；矩陣大?。?56×256。

1.2.7 MRI成像及評估

MRI 成像：對9只荷瘤大鼠進(jìn)行MRI，隨機選取3只作為SPIO?PLA組（對照組），6只作為SPIO?PLA?P53組（實驗組）。兩組大鼠依次進(jìn)行MRI平掃及增強掃描。平掃獲取T1WI、T2WI圖像后進(jìn)行T2WI增強掃描：對照組尾靜脈緩慢注射SPIO?PLA分子探針溶液（1 mg/mL），劑量為每100 g體重1.5 mL，實驗組尾靜脈緩慢注射相同劑量SPIO?PLA?P53 分子探針溶液，24 h 后進(jìn)行增強掃描。T1WI 掃描參數(shù)：TR：331.6 ms；TE：8.5 ms；T2WI掃描參數(shù)：TR：3 000 ms；TE：36 ms；FOV：3.2 cm × 3.2 cm；層厚：1 mm；層間距：1 mm；矩陣大?。?56×256。T1WI 及T2WI 掃描總時長約12 min。

MRI 圖像評估：使用ITK?SNAP 軟件（version 3.8.0）（http：// www.itksnap.org）依次打開圖像序列，找到病灶顯示的最佳斷面，避開血管及液化壞死區(qū)，使用畫圖工具選取病灶實性部分、同層面左側(cè)基底節(jié)區(qū)及咬肌的感興趣區(qū)（region of interest，ROI），測量平掃及增強的T2WI信號值，每個病灶至少選取兩處ROI，取平均值。計算腫瘤組織/咬肌平掃及增強T2WI信號比值和同層面左側(cè)基底節(jié)區(qū)/咬肌平掃及增強T2WI信號比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.8 腦組織普魯士藍(lán)染色

MRI結(jié)束后立即處死大鼠，分離腦組織，福爾馬林固定，石蠟包埋。將2%亞鐵氰化鉀溶液和20%鹽酸溶液等比例混合成普魯士藍(lán)染液，石蠟切片脫蠟至蒸餾水，切片入染液中染色30 min，蒸餾水洗2遍，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8 軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用獨立樣本t檢驗分析每組平掃與增強掃描腫瘤組織/咬肌T2WI 信號比值的改變，并進(jìn)行SPIO?PLA 組及SPIO?PLA?P53 組的比較。同時，測量兩組同一層面左側(cè)基底節(jié)區(qū)/咬肌T2WI 信號比值改變情況，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Boot?strap 方法對實驗組數(shù)據(jù)進(jìn)行小樣本抽樣分析，得到實驗數(shù)據(jù)抽樣分析的均值及置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測C6細(xì)胞P53抗原

C6 細(xì)胞表面P53 表達(dá)率僅為0.8%，幾乎不表達(dá)。C6 細(xì)胞經(jīng)破膜處理后P53 的表達(dá)率達(dá)90.8%（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測C6細(xì)胞P53抗原表達(dá)Figure 1 The expression rate of p53 in C6 cells detected by flow cytometry

2.2 納米顆粒的形態(tài)及物理性質(zhì)

2.2.1 SPIO?PLA?P53探針透射電鏡圖

透射電鏡下SPIO?PLA?P53 呈球形殼?核結(jié)構(gòu)，大小較均勻，納米探針內(nèi)核直徑約10 nm（圖2）。

圖2 SPIO?PLA?P53分子探針透射電鏡圖Figure 2 SPIO?PLA?P53 molecular probe detected by transmission electron microscope

2.2.2 動態(tài)光散射儀測試

動態(tài)光散射儀測量結(jié)果顯示，SPIO?PLA平均水合粒徑約為109.8 nm，SPIO?PLA?P53平均水合粒徑約為121.8 nm（圖3）。

圖3 SPIO?PLA（A）與SPIO?PLA?P53（B）分子探針平均水合粒徑圖Figure 3 Average hydrated particle size of SPIO?PLA（A）and SPIO?PLA?P53（B）molecular probes

2.2.3 Zeta電位檢測

SPIO?PLA納米粒子的平均Zeta電位為-30.3 mV左右，經(jīng)過P53 修飾后，合成的SPIO?PLA?P53 納米粒子的平均Zeta電位為-26.3 mV（圖4）。

圖4 SPIO?PLA（A）與SPIO?PLA?P53（B）分子探針的Zeta電位圖Figure 4 Zeta potential map of SPIO?PLA（A）and SPIO?PLA?P53（B）molecular probes

2.3 細(xì)胞毒性試驗

SPIO?PLA 及SPIO?PLA?P53納米探針與細(xì)胞共孵育后與對照組相比，3 組細(xì)胞活力均保持在80%以上（圖5）。

圖5 SPIO?PLA 及SPIO?PLA?P53 納米探針與C6 細(xì)胞共孵育后的細(xì)胞活性（n=3）Figure 5 Viability of C6 cells after co?incubation of SPIO?PLA and SPIO?PLA?P53 nanoprobes（n=3）

2.4 分子探針血腦屏障通透性分析

A 管為RCMEC 單細(xì)胞懸液，B 管為SPIO?PLA探針共孵育后RCMEC 細(xì)胞懸液，C 管為SPIO?PLA?P53 探針共孵育后RCMEC 細(xì)胞懸液。通過MRI T2WI 掃描，A 管為高信號，B 管、C 管為明顯低信號（圖6）。此結(jié)果表明SPIO?PLA 和SPIO?PLA?P53 納米探針可進(jìn)入RCMEC細(xì)胞內(nèi)，縮短橫向弛豫時間。

圖6 分子探針共孵育后RCMEC細(xì)胞懸液的T2WI掃描結(jié)果Figure 6 T2WI scans of cell suspension of RCMEC after co?incubation with molecular probes

2.5 MRI成像

根據(jù)大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及成瘤效果，選取荷瘤14 d大鼠進(jìn)行MRI。SPIO?PLA組SPIO?PLA分子探針增強前后T2WI對比圖顯示，腫瘤T2WI信號值分別約37.90 ±1.43、37.35±1.11，瘤體T2WI 信號下降率約1.5%。SPIO?PLA?P53組SPIO?PLA?P53分子探針增強前后T2WI對比圖顯示，腫瘤T2WI信號值分別約36.49±1.75、31.75±1.28，瘤體T2WI 信號下降率約13.0%，可見SPIO?PLA?P53組信號下降較明顯（圖7）。

圖7 SPIO?PLA組及SPIO?PLA?P53組分子探針增強前后T2WI序列掃描圖像對比Figure 7 Comparison of T2WI sequence scan images before and after molecular probe enhancement in SPIO?PLA group and SPIO?PLA?P53 group

2.6 MRI圖像評估

SPIO?PLA 組及SPIO?PLA?P53組大鼠平掃與增強掃描左側(cè)基底節(jié)區(qū)/咬肌T2WI信號比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表1），同時兩組平掃與增強掃描左側(cè)基底節(jié)區(qū)/咬肌T2WI 信號比值組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表1）。兩組大鼠在分別注射SPIO?PLA分子探針及SPIO?PLA?P53分子探針后，正常腦組織T2WI信號無明顯改變。

表1 SPIO?PLA組與SPIO?PLA?P53組平掃與增強掃描左側(cè)基底節(jié)區(qū)信號值與同層面咬肌信號比值比較Table 1 Comparison of the signal value of the left basal ganglia region and the masseter muscle signal ratio at the same level between the SPIO?PLA group and the SPIO?PLA?P53 group on plain and enhanced scans

SPIO?PLA組大鼠在平掃與增強掃描腫瘤組織/咬肌T2WI信號比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表2）；SPIO?PLA?P53 組平掃與增強掃描腫瘤組織/咬肌T2WI 信號比值下降較明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表2）。兩組平掃腫瘤組織/咬肌信號比值組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表2），增強掃描腫瘤組織/咬肌信號比值組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表2）。

表2 SPIO?PLA?P53組與SPIO?PLA?P53組平掃與增強掃描腫瘤組織信號值與同層面咬肌信號比值比較Table 2 Comparison of the signal value of the tumor tissues and the masseter muscle signal ratio at the same level between the SPIO?PLA group and the SPIO?PLA?P53 group on plain andenhanced scans

本研究為小樣本數(shù)據(jù)，其概率特征值很難確定，導(dǎo)致分析結(jié)果與實際結(jié)果可能存在偏差。因此采用Bootstrap 方法來解決小樣本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計問題，得到SPIO?PLA?P53 組平掃腫瘤組織/咬肌的T2WI信號比值95%CI：3.594 2～3.736 7，均值3.453 3，增強掃描腫瘤組織/咬肌的T2WI 信號比值95%CI：3.251 4～3.378 3，均值3.155 0（圖8）。

圖8 SPIO?PLA?P53組增強前后腫瘤組織/咬肌T2WI信號比值Bootstrap方法參數(shù)分布圖Figure 8 Bootstrap parameter distribution of T2WI signal ratio of tumor tissue/masseter muscle before and after enhance?ment in SPIO?PLA?P53 group

2.7 腦組織普魯士藍(lán)染色

對SPIO?PLA組及SPIO?PLA?P53組大鼠腦組織進(jìn)行普魯士藍(lán)染色（圖9），SPIO?PLA 組細(xì)胞核呈淺紅色，細(xì)胞間隙見少許鐵離子顯色，SPIO?PLA?P53組見彌漫分布的藍(lán)色鐵顆粒，分布于細(xì)胞內(nèi)部及間隙。

圖9 SPIO?PLA組和SPIO?PLA?P53組大鼠腦組織普魯士藍(lán)染色Figure 9 Prussian blue staining of rat brain tissues in SPIO?PLA group and SPIO?PLA?P53 goup

3 討論

隨著納米材料及分子影像的發(fā)展，在微觀分子水平上的顯像技術(shù)及治療方法被用于腫瘤的診療［13-15］。靶向MRI 分子探針可使對比劑在感興趣部位實現(xiàn)特異性積聚，以提高診斷準(zhǔn)確性及靈敏度［16-17］。分子探針與靶點的結(jié)合是對比劑蓄積的關(guān)鍵。靶點通常與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，靶向分子的特異性結(jié)合決定了顯影的特異性。本研究成功用P53抗體標(biāo)記了Fe3O4納米顆粒合成特異性SPIO?PLA?P53納米分子探針，并證明所獲得的靶向納米粒子能夠有效對大鼠膠質(zhì)瘤進(jìn)行特異性分子顯影。

SPIO是一種新型磁共振對比劑，廣泛應(yīng)用于分子影像基礎(chǔ)實驗中［18］。SPIO 優(yōu)異的磁性是其作為T2加權(quán)MRI對比劑的主要條件，掃描時可明顯縮短組織橫向弛豫時間，使T2 值減低。許多研究表明，各種化合物及探針包被的SPIO 在動物實驗中都表現(xiàn)出了良好的生物相容性［19-21］。在本研究中，細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示與探針溶液共孵育后，細(xì)胞的存活率達(dá)80%以上，證明目標(biāo)探針無明顯毒性作用，可安全進(jìn)行動物實驗。

眾多學(xué)者對SPIO 在膠質(zhì)瘤的示蹤及治療效能方面進(jìn)行了大量研究。由于腦膠質(zhì)瘤的微血管受到損害，Shen等［22］發(fā)現(xiàn)靜脈注射含有藥物的超順磁性氧化鐵納米粒子（SPIO?NPs），有效載荷藥物高，同時可以聯(lián)合MRI 追蹤藥物分布映射治療效果。Maritim 等［23］制備了具有活體熒光和MRI 性能的納米粒子SPIO@DSPE?PEG/DOX/ICG，用于評估膠質(zhì)瘤治療效果。本研究將P53 蛋白作為靶點，聯(lián)合SPIO 構(gòu)建SPIO?PLA?P53 納米分子探針，作為腦膠質(zhì)瘤MRI特異性對比劑，對荷瘤大鼠進(jìn)行顯像，MRI顯示瘤體在注射靶向納米探針后T2WI 信號減低（P＜0.05），病理結(jié)果證實瘤體內(nèi)大量鐵離子沉積，客觀驗證了靶向SPIO?PLA?P53納米分子探針的診斷效能，為腦膠質(zhì)瘤的特異性顯像和治療提供了新的靶點。

由于研發(fā)資金和時間的限制，本研究是小樣本數(shù)據(jù)，分析結(jié)果與實際結(jié)果不可避免地存在差異。因此采用Bootstrap 方法來解決小樣本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計問題［24-25］。本研究選取了實驗組T2WI 信號值作為樣本進(jìn)行評估。獲得SPIO?PLA?P53 組平掃腫瘤組織/咬肌的T2WI信號比值95%CI為3.594 2～3.736 7，增強掃描腫瘤組織/咬肌的T2WI信號比值95%CI為3.251 4～3.378 3，即所得數(shù)據(jù)在置信區(qū)間均可視為合理。

膠質(zhì)瘤是最常見的腦部惡性腫瘤。本研究以SPIO 為載體制成膠質(zhì)瘤靶向分子探針SPIO?PLA?P53，對腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織進(jìn)行檢測，明確大鼠膠質(zhì)瘤的定位，將為腦膠質(zhì)瘤診斷提供新思路。