孟繁榮 雷杰 牛群 王楠 吳玲 楊瑜 謝貝 李華 高俊文 傅紅梅 劉志輝

1廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所（廣州 510095）；2廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科（廣州 510095）

利福平是目前臨床用于抗結(jié)核治療的重要一線藥物，在結(jié)核病超短程化療［1］與潛伏性感染的預(yù)防性治療中［2］也具有至為關(guān)鍵的作用。研究［3-4］表明90%左右的利福平耐藥結(jié)核為耐多藥結(jié)核病，對(duì)利福平的耐藥性判定成為臨床制定結(jié)核病化療方案和進(jìn)行預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵因素。已有研究［4-6］證實(shí)約95%的結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥是由于其rpoB 基因突變所致，且多為507-533 位點(diǎn)的利福平耐藥決定區(qū)（rifampin resistance-determining region，RRDR）突變，目前檢測(cè)利福平藥物敏感性的分子生物學(xué)方法多以此區(qū)域的特定突變位點(diǎn)作為靶標(biāo)。然而因?yàn)檫x擇壓力、遺傳背景或耐藥背景等因素的影響，不同地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌菌株在變異類型、發(fā)生頻率與分布特征等方面具有差異?，F(xiàn)有分子診斷學(xué)方法依靠rpoB 基因幾個(gè)特定位點(diǎn)作靶標(biāo)，難以盡數(shù)診斷利福平耐藥結(jié)核病。因此，本文選取廣東地區(qū)分枝桿菌菌種保藏庫(kù)中具有不同耐藥表型的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，研究rpoB 基因變異的分子特征，為新型診斷技術(shù)的研發(fā)和結(jié)核病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源373 株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于廣東地區(qū)分枝桿菌菌種保藏庫(kù)的保存菌株，包括107 株對(duì)4 種一線抗結(jié)核藥物異煙肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）、鏈霉素（S）全敏感的菌株（Q 株），95 株R 敏感H 耐藥株（RSHR 株），32 株R 耐藥H 敏感株（RRHS 株）和139 株耐HR 株（MDR 株）。

1.2 試劑與儀器通用基因組DNA 提取試劑盒（上海生物工程有限公司），溶菌酶（上海生物工程有限公司），米氏7H10 培養(yǎng)基（美國(guó)BD 公司），DR001B PCR 擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa 生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖凝膠（Agorose BIO BASIC 有限公司），Gold View NucleicAcid Stain（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司），100 bp DNA Ladder（TaKaRa 生物技術(shù)有限公司），C1000TM Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD公司），AllegraTM 64R 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司），DNA水平電泳儀（美國(guó)BIO-RAD 公司），Gel DocTM XR+ ImagineSystem 凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD 公司），Nano Drop one 超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo fisher 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCR 擴(kuò)增引物以結(jié)核分枝桿菌H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)株rpoB 基因序列為參考，設(shè)計(jì)包含rpoB 基因利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）在內(nèi)的產(chǎn)物長(zhǎng)度約333 bp的擴(kuò)增引物，分別為：上游5'-CGTACGGTCGGCGAGCTGATC-3'，下游5'-AGGGGTTTCGATCGGGCACATC-3'。由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)總體積為50 μL，包括TaKaRa Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各2 μL，滅菌蒸餾水35.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s～1 min，循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物各取4 μL 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.3.3 DNA 序列測(cè)定與分析經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后合格的PCR 產(chǎn)物交由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。后利用DNAMAN、CHORMAS 及DNASTAR 軟件，將測(cè)序結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以Excel 表格公式計(jì)算各突變類型出現(xiàn)的頻率，以SPSS 26.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析不同耐藥表型間rpoB 基因突變率的差異以及不同耐藥表型間單位點(diǎn)與雙位點(diǎn)變異出現(xiàn)頻率的差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌rpoB基因變異總體特征373株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株樣本中，192 株檢測(cè)到rpoB 基因變異，共發(fā)生225 個(gè)變異40 種突變種類，其中221 個(gè)變異為氨基酸編碼位點(diǎn)的堿基置換突變，占比98.22%（221/225），尤以531、526、511、516、533、515 位點(diǎn)突變最為常見，占比分別為43.11%（97/225）、20.89%（47/225）、10.22%（23/225）、8%（18/225）、4.44%（10/225）、4%（9/225）。堿基缺失與堿基插入變異則分別占比1.33%、0.44%。225個(gè)變異中，97.78%（220/225）發(fā)生在利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）。見表1。

表1 192 株結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因變異株的基因變化總特征Tab.1 192 Total Changes of rpoB Gene Variable Strain

2.2 結(jié)核分枝桿菌rpoB基因變異分布特征192例rpoB 突變株中，159 株僅發(fā)生單位點(diǎn)突變，33 株發(fā)生雙位點(diǎn)突變，其中D516V（13/44）、H526L（6/44）、H526D（5/44）、H526R（5/44）、S531W（6/44）等14 種突變種類只在單位點(diǎn)突變中出現(xiàn)，為單位點(diǎn)特有變異，M515T（5/37）、H526Q（5/37）、D516G（3/37）、M515V（3/37）、E541A（3/37）等21 種突變種類只在雙位點(diǎn)突變中出現(xiàn)，為雙位點(diǎn)特有變異，S531L（90/144）、L511P（21/144）、H526Y（18/144）、L533P（10/144）、H526N（5/144）為單雙位點(diǎn)共有變異，不存在3 個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)變異。見表2。

表2 192 株結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因變異株基因變化特點(diǎn)分析Tab.2 Gene variation characteristics of 192 Mycobacterium tuberculosis rpoB gene variants

2.3 結(jié)核分枝桿菌不同耐藥表型rpoB 基因突變情況Q 株、RSHR株、RRHS株和MDR 株的rpoB 基因突變率分別為4.67%（5/107）、28.42%（27/95）、90.62（29/32）、94.24%（131/139），除RRHS株與MDR 株間突變率不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外（P＞0.05），Q株/RSHR株、Q 株/RRHS株、Q 株/MDR 株、RSHR株/RRHS株、RSHR株/MDR 株間rpoB 基因突變率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.001）。不同耐藥表型間單位點(diǎn)與雙位點(diǎn)突變的變異出現(xiàn)頻率不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3 不同耐藥表型結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因突變情況Tab.3 rpoB gene mutation of Mycobacterium tuberculosis with different drug resistance phenotypes

3 討論

利福平耐藥已成為初步判定耐多藥結(jié)核的重要標(biāo)志［7-9］，超過90%的利福平耐藥菌株存在rpoB基因突變［5-7］。在我們的研究中，96.89%的變異發(fā)生在rpoB 基因RRDR 區(qū)，最常見的531 位點(diǎn)突變率43.11%，低于巴西（61.8%）［10］、印度（59.4%）［11］、剛果（53.1%）［12］、埃塞俄比亞（64.1%）［13］等其他結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家以及我國(guó)大部分地區(qū)［14-17］；其次為526（20.89%）位點(diǎn)，突變率略高于我國(guó)江西（16.56%）［14］、河北（15.45%）［15］、江蘇（18.3%）［18］、北京（16.67%）［19］、徐州（1.74%）［20］等地，低于浙東（29.7%）［21］、吉林（25.1%）［22］、青海（40.0%）［23］、河南（21.5%）［24］、云南（26.7%）［25］等地區(qū)。本次研究中突變率排在前3 位的突變位點(diǎn)分別是531、526和511，不同于以往研究報(bào)道的531、526、516 位點(diǎn)，且突變率總和僅占rpoB 基因變異的74.22%，低于大量報(bào)道的86%左右［26-28］。同時(shí)，共檢測(cè)到40 種類型的rpoB 基因突變，包括堿基置換、缺失與插入突變，發(fā)生率分別為98.18%、1.33%和0.44%，堿基缺失與插入突變發(fā)生比率高于我國(guó)平均水平［16］。說明廣東地區(qū)結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因突變分布相對(duì)分散，突變種類與分布頻度呈現(xiàn)地方特異性。

40 個(gè)突變種類中，有22 個(gè)突變種類僅在雙位點(diǎn)突變中出現(xiàn)，說明rpoB 基因這些位點(diǎn)的突變類型可能不能夠獨(dú)立導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥，它們或是以一種補(bǔ)償性變異［29］的形式來彌補(bǔ)其他位點(diǎn)突變對(duì)結(jié)核分枝桿菌造成的適應(yīng)性下降，或是與其他位點(diǎn)的變異一起構(gòu)成RNA 聚合酶空間構(gòu)象的變化從而導(dǎo)致結(jié)核桿菌對(duì)利福平的耐藥，然而具體機(jī)制目前尚不明晰。

本研究中，11 株利福平耐藥株未檢測(cè)到rpoB基因變異，我們推測(cè)這些菌株可能存在RRDR 之外的基因變異或其他導(dǎo)致利福平耐藥的機(jī)制［30-31］。MDR 株與RRHS株均有90%以上的rpoB 基因變異，說明具有利福平耐藥背景的結(jié)核分枝桿菌擁有穩(wěn)定的rpoB 突變率，亦可說明編碼RNA 聚合酶亞基的rpoB 基因突變是導(dǎo)致利福平耐藥的主要原因。107 株全敏感菌株中4.67%存在rpoB 突變，與前期關(guān)于我國(guó)敏感結(jié)核桿菌rpoB 基因沉默突變的流行情況的報(bào)告相符合［32］。值得注意的是，95 株異煙肼耐藥背景的利福平敏感株（RSHR）中，rpoB 基因突變率高達(dá)28.42%。究其原因，一方面可能是結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的耐藥從分子水平影響了其rpoB 突變的機(jī)制［25］，這些突變可能是異煙肼耐藥株從對(duì)利福平敏感獲得利福平耐藥性的一個(gè)中間過渡狀態(tài)；另一方面，rpoB L511P 突變被WHO 認(rèn)為是與利福平低水平耐藥相關(guān)的可信度比較低的突變［33］，王少華等人的研究也表明L511P、L533P、D516Y、H526N 位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因型與利福平藥敏表型不一致的主要原因［34-35］，而L511P 與L533P 位點(diǎn)突變正是本研究中RSHR 株的主要突變類型。

表4 rpoB 基因各突變種類代碼Tab.4 The simple code of rpoB gene mutation type

總而言之，廣東地區(qū)結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因變異具有地域性特征，雖然90%以上的突變發(fā)生在RRDR 區(qū)，但仍不能忽視RRDR 外區(qū)域的位點(diǎn)以及其他分子機(jī)制在利福平耐藥檢測(cè)中的作用，同時(shí)亦應(yīng)重視不同耐藥表型對(duì)rpoB 基因突變或利福平耐藥產(chǎn)生的影響。