劉艷華 王若 楊秉芬 曹志紅 翟斐 孫雯娜 蘇瑾文 俞珊 程小星

解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心結(jié)核病醫(yī)學(xué)部1全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2結(jié)核科（北京 100091）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引發(fā)的慢性傳染性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。2020年WHO全球結(jié)核病報(bào)告顯示我國(guó)是30 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病發(fā)病例數(shù)居全球第三位，結(jié)核病是我國(guó)需要重點(diǎn)防控的重大傳染?。?］。

人類感染M.tb 后，多數(shù)呈現(xiàn)帶菌生存狀態(tài)，并不會(huì)發(fā)展為結(jié)核病，稱為潛伏感染者（latent tuberculosis infection，LTBI）；約5%～10%的LTBI會(huì)繼續(xù)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核?。╝ctive tuberculosis，ATB）。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，基于γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IFN-gamma release assay，IGRA）得出的M.tb感染率大約在20%～30%之間，即全國(guó)約有3～4 億人為M.tb 感染者［1］，數(shù)目龐大的無(wú)臨床癥狀的LTBI 是ATB 的重要來(lái)源。此外，由于LTBI 的預(yù)防性治療方案與ATB 的抗癆治療方案顯著不同。因此，如何實(shí)現(xiàn)LTBI 與ATB 的早期鑒別診斷至關(guān)重要。

常用的M.tb 感染診斷方法包括傳統(tǒng)的結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)（TST）以及IGRAs，TST 方法容易受到卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌的干擾，MTB 感染診斷不夠明確，更無(wú)法區(qū)別LTBI 和ATB。新近推行的IGRAs 方法，雖然能夠檢測(cè)MTB 感染，但無(wú)法區(qū)分LTBI 和ATB。近年來(lái)雖然陸續(xù)出現(xiàn)了一些先進(jìn)的基于核酸擴(kuò)增的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)（如XpertMTB/RIF assay），但由于受到儀器設(shè)備和診斷費(fèi)用的限制，以及假陽(yáng)性率偏高等問(wèn)題，還無(wú)法全面推廣。因此，現(xiàn)行的結(jié)核病診斷方法或輔助診斷手段都無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速有效的LTBI 和ATB 鑒別診斷，使得臨床上面臨嚴(yán)重的治療延誤以及過(guò)度治療等問(wèn)題?；谏鲜霈F(xiàn)狀，尋找新的TB 特異標(biāo)志物，鑒別診斷LTBI 和ATB，已經(jīng)成為結(jié)核病臨床診斷中一項(xiàng)亟待解決的難題［1］。

我們前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)ATB 和健康人外周血中PRDM1 和GATA2 基因mRNA 表達(dá)存在顯著差異。PRDM1 是轉(zhuǎn)錄因子blimp-1 的編碼基因，blimp-1 能調(diào)控包括B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK 細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化。PRDM1 的基因多態(tài)性與多種自身免疫疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸?。┖土馨土龅陌l(fā)生密切相關(guān)［2-4］。GATA2 是轉(zhuǎn)錄因子GATA2 的編碼基因，GATA2 基因突變導(dǎo)致的GATA2 蛋白功能缺陷是造成MonoMAC 綜合征、原發(fā)性淋巴水腫伴有骨髓異常增生綜合征（emberger syndrome）、樹(shù)突、單核和B/NK 淋巴細(xì)胞缺乏征（DCML）和家族聚集性骨髓增生異常綜合癥/急性淋巴細(xì)胞白血?。∕DS/AML）的遺傳原因［5-6］。

PRDM1和GATA2與結(jié)核病的關(guān)系鮮有報(bào)道［7］。為了進(jìn)一步了解PRDM1 和GATA2 在ATB 中的表達(dá)情況，以及它們作為結(jié)核病診斷標(biāo)志物的價(jià)值，本研究通過(guò)熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法在新的受試者中檢測(cè)這兩個(gè)基因的mRNA 表達(dá)，并利用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析它們單獨(dú)或者聯(lián)合鑒別診斷ATB 和LTBI 的能力。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象納入的ATB 患者為2018年2-7月期間解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心的住院患者，結(jié)核病的診斷依據(jù)為“肺結(jié)核診斷［8］”，包括臨床表現(xiàn)、CT 檢查、抗酸桿菌染色（AFB）、細(xì)菌培養(yǎng)和核酸檢測(cè)等。ATB共計(jì)91例，男57例，女34例，平均年齡為48 歲（21～65 歲）。LTBI 和健康對(duì)照（healthy control，HC）為2018年3-6月期間解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心的體檢人員，兩組受試者均沒(méi)有結(jié)核病史和結(jié)核病臨床表現(xiàn)，X 線檢查正常，IGRA 陽(yáng)性者為L(zhǎng)TBI，IGRA 陰性者為HC。LTBI 共計(jì)31 例，男19 例，女12 例，平均年齡為46 歲（28～59 歲）。HC 共計(jì)31 例，男18 例，女13 例，平均年齡為38 歲（23～56 歲）。三組受試者的年齡和性別組成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入的研究對(duì)象均沒(méi)有肝炎、艾滋病和自身免疫相關(guān)疾病。本研究通過(guò)解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集與處理抽取受試者外周血置于肝素抗凝管中，4～6 h 內(nèi)用Ficoll 分離液（美國(guó)GE）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用RPMI-1640 培養(yǎng)液（美國(guó)Invitrogen）洗滌細(xì)胞2 遍，細(xì)胞沉淀用1 mL 的Trizol（美國(guó)Invitrogen）溶解，然后凍于-80 ℃中備用。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 合成按以前的操作步驟提取細(xì)胞總RNA［9］，按TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物）操作說(shuō)明合成cDNA。

1.2.3 引物序列及qPCR 檢測(cè)利用NCBI 網(wǎng)站Primerblast 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，GATA2 的參照基因序列號(hào)為：NM_001145661，上游引物為“5'-CCTGGCGCACAACTACATGG-3'”，下游引物為“5'-ACATCTGGCCTCCGGTCA-3'”。PRDM1 的參照基因序列號(hào)為：NM_001198，上游引物為“5'-TTAAGCCCATCCCTGCCAAC-3'”，下游引物為“5'-GCTCGGTTGCTTTAGACTGC-3'”。選擇GAPDH為內(nèi)參基因，參照的基因序列號(hào)為：NM_002046，上游引物為“5'-TGTTGCCATCAATGACCCCT-3'”，下游引物為“5'-TCGCCCCACTTGATTTTGGA-3'”。用SYBR GreenⅠ試劑盒（美國(guó)KAPA）進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃3 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。另外設(shè)計(jì)溶解曲線程序進(jìn)行引物特異性檢驗(yàn)。PCR 反應(yīng)在LightCycle?480Ⅱ（Roche）上進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有反應(yīng)的Ct 值均為2 個(gè)復(fù)孔的平均值，PRDM1 或GATA2 基 因mRNA 的 表達(dá)=2-△Ct（PRDM1/GATA2-GAPDH），數(shù)值用（±s）表示。采用Graphpad 5.0 和SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中Mann-Whitney 或Kruskal-Wallis 用于2 組或3 組 數(shù)據(jù)的非參數(shù)檢驗(yàn)，受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）用于線下面積（area under curve，AUC）、診斷靈敏度和特異度分析，取約登指數(shù)最大對(duì)應(yīng)的cut-off 值計(jì)算診斷的靈敏度和特異度。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRDM1 和GATA2 的mRNA 在不同受試者中的表達(dá)分析3 組受試者PRDM1 和GATA2 的mRNA表達(dá)差異，結(jié)果顯示ATB的PBMCs中PRDM1和GATA2 的mRNA 表達(dá)均顯著低于LTBI 和HC（H=69.27，P＜0.000 1；H=37.97，P＜0.000 1）。隨后按AFB 或細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果將ATB 分為菌陽(yáng)組和菌陰組，按結(jié)核發(fā)病部位將ATB分為肺結(jié)核和肺外結(jié)核，分析ATB 各組GATA2 和PRDM1 的mRNA 表達(dá)差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，菌陽(yáng)組和菌陰組ATB、肺結(jié)核和肺外結(jié)核ATB 中GATA2 的mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=1 149，P=0.418；U=1 363，P=0.313 3）。ATB各組中PRDM1的mRNA 在菌陽(yáng)組和菌陰組ATB、肺結(jié)核和肺外結(jié)核的表達(dá)也近似（U=881.5，P=0.314 4；U=1 263，P=0.567 8）。見(jiàn)圖1。

圖1 PRDM1 和GATA2 的mRNA 表達(dá)Fig.1 The mRNA expression of PRDM1 and GATA2 gene

2.2 PRDM1 和GATA2 的mRNA 對(duì)ATB 和LTBI的鑒別診斷以LTBI 為對(duì)照，用ROC 分析了PRDM1 和GATA2 的mRNA 診斷性能。GATA2 的AUC 為0.806（95%CI：0.717～0.896），診斷靈敏度為82.35%（95%CI：73.55%～89.19%）和特異度為70.97%（95%CI：51.96%～85.78%）。PRDM1的AUC為0.8967（95%CI：0.840～0.953），診斷靈敏度為80.22%（95%CI：70.55%～87.84%）和特異度為87.1%（95%CI：70.17%～96.37%）。GATA2和PRDM1聯(lián)合診斷的性能分析結(jié)果顯示GATA2-PRDM1 的AUC 為0.935（95%CI：0.894～0.976），診斷的靈敏度為76.9%（95%CI：66.68%～84.84%），特異度為100%（95%CI：86.27%～100%）。見(jiàn)圖2。

圖2 PRDM1 和GATA2 的mRNA 單獨(dú)和聯(lián)合診斷ATB 和LTBI 的ROCFig.2 The ROC analysis of mRNA of PRDM1 and GATA2 alone and together distinguishing ATB from LTBI

3 討論

本研究收集ATB、LTBI 和健康人三組受試者外周血，qPCR 檢測(cè)前期篩選出的差異表達(dá)基因PRDM1 和GATA2 的表達(dá)，并分析它們作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值。結(jié)果證實(shí)ATB 外周血中PRDM1和GATA2 基因mRNA 顯著低于LTBI 和健康人，PRDM1 和GATA2 聯(lián)合起來(lái)能較好的鑒別診斷ATB 和LTBI，靈敏度和特異度分別達(dá)到76.9%和100%。本研究之所以納入ATB、LTBI 和健康人三組受試者是因?yàn)樗鼈兎謩e代表了人類三種M.tb 感染狀態(tài)，即感染后發(fā)病、感染后不發(fā)病和未感染。

不同的感染狀態(tài)下，宿主抗M.tb 的免疫應(yīng)答不同，表達(dá)的基因產(chǎn)物也不同，這是差異表達(dá)基因及其產(chǎn)物作為診斷標(biāo)志物的理論基礎(chǔ)。研究者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)ATB 和LTBI 中存在多個(gè)差異基因，并將其作為潛在的診斷標(biāo)志物［10-12］。近年來(lái)研究人員不斷的尋找診斷效果更好的差異基因及其組合［13-23］。比如LAUX DA COSTA 等［13］發(fā)現(xiàn)GBP5、GZMA 和CD64 基 因組合能鑒別ATB 與LTBI，GLIDDON等［14］發(fā)現(xiàn)FCGR1A、ZNF296和C1QB基因組合能鑒別ATB 與LTBI。本研究發(fā)現(xiàn)，與基因組合相比，PRDM1 或GATA2 單一基因的診斷效能較低，PERUMAL 等［15］也證實(shí)GBP1 和IFIT3 單一的診斷效能低于雙基因組合。

ATB 為全身性疾病，相比于肺結(jié)核，肺外結(jié)核的診斷更困難［24-25］，本研究ATB 中納入了18 例肺外結(jié)核（約占納入ATB 病例的1/5），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核和肺外結(jié)核中PRDM1 和GATA2 的平均表達(dá)水平相似，提示這兩個(gè)基因不僅可以用于肺結(jié)核的診斷也可以用于肺外結(jié)核的診斷。此外，菌陰結(jié)核病也是結(jié)核病診斷的難點(diǎn)，本研究按涂片鏡檢的結(jié)果將ATB 分為菌陰和菌陽(yáng)兩組，結(jié)果表明兩組患者PRDM1 和GATA2 的表達(dá)水平?jīng)]有差異，提示PRDM1 和GATA2 也可以用于菌陰結(jié)核病的診斷。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PRDM1 和GATA2 基因的mRNA 聯(lián)合起來(lái)可以用于ATB 和LTBI 的鑒別診斷。但是本研究收集的各組樣本數(shù)較少，PRDM1和GATA2 作為結(jié)核病診斷標(biāo)志物的能力還需要在更大的樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。此外PRDM1 和GATA2 聯(lián)合診斷的靈敏度還有待提高，是否需要聯(lián)合其他的基因（如CD64）還需要進(jìn)一步的研究。