武秀權(quán)，呂偉豪，費曉煒，吳 霜，何 鑫，豆雅楠，郇 宇，賈 博，費 舟

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安710032)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)作為臨床上常見的急危重癥之一，其致死率和致殘率均較高[1]。TBI的核心是神經(jīng)元損傷，大量的神經(jīng)元損傷導(dǎo)致后期神經(jīng)功能缺失。TBI包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷，臨床醫(yī)務(wù)人員的主要任務(wù)是防治繼發(fā)性腦損傷[2]，因而，針對繼發(fā)性損傷防治的新方法一直是研究的熱點。

鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)的一種獨特的細胞死亡模式，不同于凋亡、壞死及自噬性死亡，該過程沒有核形態(tài)變化、DNA片段化和胱天蛋白酶活化，也不能被其他細胞死亡抑制劑所逆轉(zhuǎn)[3]。研究證實，鐵死亡與神經(jīng)退行性疾病和急性神經(jīng)損傷背景下的神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[45]。然而，有關(guān)TBI后神經(jīng)元鐵死亡信號改變及作用的報道較少，相關(guān)機制有待進一步闡明。

Parkin是與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)的一個蛋白質(zhì)分子，其突變會導(dǎo)致早發(fā)性帕金森病，本質(zhì)是一種E3泛素連接酶，廣泛參與細胞內(nèi)線粒體自噬、蛋白降解及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程[6]。研究表明，Parkin可在急性缺血性卒中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]，而其與TBI的關(guān)系尚未闡明。因此，本研究利用小鼠原代皮層神經(jīng)元機械性損傷模型，探究傷后Parkin的表達、作用及其對鐵死亡信號的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6孕鼠(孕15～16 d)32只由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于23～25 ℃恒溫環(huán)境中，光照條件為12 h黑暗/12 h光照連續(xù)循環(huán)，給予小鼠充足水和食物。處理動物嚴(yán)格遵守空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心制定的實驗動物使用指南。

1.2 方法

1.2.1 原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 取孕15～16 d C57BL/6小鼠1只，脫臼處死后，嚴(yán)格無菌操作，逐層小心剪開皮膚皮下組織、腹膜，分離胎盤胎鼠，收集胎鼠腦組織。顯微鏡下去除腦膜，分離皮層，并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷培養(yǎng)基中。用虹膜剪剪碎皮層，加入適量2.5 g/L胰酶溶液，混勻后放置于細胞孵箱，消化20～25 min，每隔5 min搖動培養(yǎng)皿1次。將消化過的皮層組織與適量培養(yǎng)基混勻，并通過75 μm細胞篩網(wǎng)，收集細胞懸液。調(diào)整細胞密度，種板。4～6 h后，用含B27的Neurobasal培養(yǎng)基給神經(jīng)元換液，并每隔2～3 d換液。7 d后待神經(jīng)元成熟，做相應(yīng)處理。

1.2.2 機械性神經(jīng)元損傷模型和分組 本研究在MUKHIN等[8]建立的離體神經(jīng)元機械性損傷模型基礎(chǔ)上，進一步改進和完善相關(guān)流程。以10 μL的微量移液器槍頭于培養(yǎng)皿內(nèi)劃割，造成機械性損傷，劃傷道寬度為1.2 mm，兩相鄰劃傷道間隔3.5 mm。依據(jù)預(yù)先在培養(yǎng)皿底面畫好的標(biāo)記線(16培養(yǎng)皿)劃割神經(jīng)元，標(biāo)記線均勻分布在培養(yǎng)皿底面，保證細胞損傷程度和范圍一致。實驗分為對照組、損傷組、損傷+Parkin過表達慢病毒組及損傷+對照病毒組，每組使用8只小鼠。

1.2.3 免疫熒光 3 mL/L的Triton X-100溶液破膜10 min，破膜后各組加適量驢血清封閉1 h。PBS漂洗細胞爬片，洗3～5遍，每遍持續(xù)3～5 min，洗完后各組加適量一抗(Parkin：Gennetex公司，貨號為GTX39745，稀釋比例為1∶200)，濕盒置于4 ℃過夜孵育。PBS漂洗細胞爬片，洗3～5遍，每遍持續(xù)3～5 min，洗完后各組加適量二抗，室溫孵育2～3 h。PBS漂洗細胞爬片，洗3～5遍，每遍持續(xù)3～5 min。洗完后用DAPI染液襯染細胞核，染色6～10 min。PBS漂洗、封片，激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4 Western blotting 按照配膠試劑盒說明書要求，配制80～120 g/L分離膠及60 g/L濃縮膠。加樣孔中分別加入預(yù)染Marker及蛋白樣品，每孔20～40 μg，電泳時設(shè)置上層膠恒壓90 V、下層膠恒壓120 V，直至藍色線條下降至玻璃板底端。電泳結(jié)束后，將夾子置于預(yù)冷轉(zhuǎn)膜液中，向夾子黑面上依次放置海綿襯墊、雙層濾紙、電泳凝膠、聚偏二氟乙烯膜、雙層濾紙、海綿襯墊，建立轉(zhuǎn)膜條件，設(shè)置恒壓100 V，轉(zhuǎn)膜90 min。然后將條帶置于裝有封閉液的平皿中，搖床設(shè)定50～60 r/min，封閉1 h。封閉結(jié)束后，用一抗稀釋液稀釋一抗(Parkin：Gennetex公司，貨號為GTX39745，稀釋比例為1∶500；GPX4：CST公司，貨號為52455S，稀釋比例為1∶800；ACSL4：Abcam公司，貨號為ab155282，稀釋比例為1∶300；GAPDH：Abcam公司，貨號為ab8245，稀釋比例為1∶1 000)，并將抗體稀釋液及條帶裝入封膜袋中，4 ℃冰箱過夜。冰箱取出封膜帶后，將條帶取出并置于裝有吐溫磷酸緩沖液的平皿中，搖床設(shè)定70～80 r/min，洗3～4遍。然后用二抗稀釋液稀釋二抗，將條帶置于裝有二抗稀釋液的抗體孵育盒中，搖床設(shè)定50～60 r/min，避光孵育1 h。孵育結(jié)束后進行發(fā)光檢測，利用Image J圖像處理軟件進行灰度統(tǒng)計分析。

1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 本實驗所需的過表達慢病毒載體均委托上海吉凱化學(xué)基因公司構(gòu)建，慢病毒分別于細胞培養(yǎng)第7日感染神經(jīng)元，感染指數(shù)為10，感染72 h后予以換液，培養(yǎng)第10日予以造模處理。

1.2.6 細胞活力檢測 細胞活力檢測基于CCK-8測定法，并采用細胞增殖與毒性檢測試劑盒(七海公司，中國上海)進行檢測。96孔板接種細胞懸液(200 μL/孔)，并進行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，各孔加入20 μL反應(yīng)液，混勻。并設(shè)置空白對照組及背景對照組。在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測各處理組A450 nm值，并計算各組相對細胞活力。

1.2.7 活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測 配制2,7二氯二氫熒光素乙酰乙酸(2′,7′-dichlorodihydro fluorescein diacetate，H2DCFDA)(賽默飛公司，中國蘇州)儲存液(2 mmol/L)，溶劑為二甲基亞砜；配制H2DCFDA工作液(5 μmol/L)，溶劑為常規(guī)培養(yǎng)基。吸除各處理組培養(yǎng)基，加入適量H2DCFDA工作液，細胞培養(yǎng)箱中避光孵育1 h。吸除工作液，PBS洗3遍。熒光酶標(biāo)儀檢測各組熒光強度(激發(fā)波長480 nm,發(fā)射波長530 nm)，并計算ROS含量。

1.2.8 脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation，LPO)水平檢測 本實驗采用測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)及4羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)相對含量檢測LPO水平，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進行實驗(MDA檢測試劑盒：碧云天公司，中國上海；4-HNE試劑盒：西唐公司，中國上海)，使用酶標(biāo)儀測定各組A值，并利用試劑盒所提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各實驗組MDA及4-HNE相對含量。

1.2.9 Fe2+水平檢測 加裂解液裂解各處理組細胞，置于搖床裂解2 h后，把細胞刮下待用；按照Fe2+檢測試劑盒(普利萊公司，中國北京)步驟檢測各組細胞Fe2+水平。

1.2.10 總谷胱甘肽(total glutathione，GSH)檢測 PBS洗滌各處理組細胞，用細胞刮刀把細胞刮下，離心收集細胞，棄上清；按照GSH試劑盒(碧云天公司，中國上海)的步驟檢測各組細胞內(nèi)GSH水平。

2 結(jié)果

2.1 機械性損傷后神經(jīng)元內(nèi)Parkin表達上調(diào)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組Parkin表達水平較低(圖1A)，機械性損傷24 h后，Parkin表達增加(圖1B)。進一步通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，機械性損傷后Parkin表達上調(diào)，在傷后24 h出現(xiàn)峰值(圖2A～B)?？紤]到Parkin表達水平在傷后24 h水平最高，后續(xù)實驗均以此時間點作為條件。

A：對照組；B：損傷 24 h組。標(biāo)尺為20 μm。圖1 機械性損傷后神經(jīng)元Parkin免疫熒光染色

A：Western blotting檢測；B：Parkin表達水平定量結(jié)果。aP<0.05 vs 對照組。圖2 機械性損傷后神經(jīng)元Parkin的Western bloting檢測

2.2 Parkin減輕機械性損傷導(dǎo)致的細胞活力下降及氧化應(yīng)激

通過檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，損傷組細胞活力下降；與損傷+對照病毒組相比，Parkin可減輕損傷所導(dǎo)致的細胞活力下降(P<0.05，圖3A)。進一步ROS檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，損傷組ROS水平增加；與損傷+對照病毒組相比，Parkin可減輕損傷所導(dǎo)致的ROS增加(P<0.05，圖3B)。

A：神經(jīng)元機械性損傷24 h后細胞活力檢測；B：神經(jīng)元機械性損傷24 h后ROS檢測。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 損傷+對照病毒組。圖3 細胞活力和ROS檢測

2.3 Parkin減輕LPO

通過檢測LPO標(biāo)志物MDA和4-HNE發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，損傷組LPO水平增加(P<0.05，圖4)；與損傷+對照病毒組相比，Parkin可減輕損傷所導(dǎo)致的LPO水平增加(P<0.05，圖4)。

A：神經(jīng)元機械性損傷24 h后MDA檢測；B：神經(jīng)元機械性損傷24 h后4-HNE檢測。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 損傷+對照病毒組。圖4 LPO檢測

2.4 Parkin通過GPX4/ACSL4途徑抑制胞內(nèi)鐵死亡信號

通過檢測細胞內(nèi)Fe2+水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，損傷組Fe2+增加；與損傷+對照病毒組相比，Parkin可減輕損傷所導(dǎo)致的Fe2+增加(P<0.05，圖5A)。進一步GSH檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，損傷組GSH水平減少；與損傷+對照病毒組相比，Parkin可增加神經(jīng)元內(nèi)GSH水平(P<0.05，圖5B)。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，損傷組ACSL4表達增加、GPX4表達減少；與損傷+對照病毒組相比，Parkin可緩解損傷所導(dǎo)致的ACSL4表達增加和GPX4表達減少(P<0.05，圖5C～E)。

3 討論

TBI是臨床上常見的急性腦損傷之一，其致病機制復(fù)雜，除外力導(dǎo)致的原發(fā)性損傷外，炎癥、缺氧、缺血、離子紊亂等引起的繼發(fā)性腦損傷是目前防治的關(guān)鍵[9]。繼發(fā)性腦損害最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進而引起神經(jīng)功能喪失，因此，尋找內(nèi)源性神經(jīng)保護因子變得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，Parkin作為一種重要的神經(jīng)保護蛋白分子可有效減輕機械性神經(jīng)元損傷，其保護機制與鐵死亡信號通路密切相關(guān)。

本研究首先發(fā)現(xiàn)，Parkin在損傷后表達水平上調(diào)，這與文獻[10]報道一致，表明Parkin可能是神經(jīng)元抵抗多種損害的一種內(nèi)源性神經(jīng)保護機制。本研究同時也發(fā)現(xiàn)，機械性損傷24 h后Parkin出現(xiàn)峰值，該時間點與WU等[11]的研究結(jié)果類似。另有研究發(fā)現(xiàn)，用解偶聯(lián)劑處理膠質(zhì)細胞，Parkin在傷后6 h出現(xiàn)表達高峰[12]，這提示在不同的損傷模型和不同的細胞模型下，Parkin發(fā)揮的作用可能存在差別，具體機制仍需進一步深入研究。

A：神經(jīng)元機械性損傷24 h后Fe2+檢測；B：神經(jīng)元機械性損傷24 h后胞內(nèi)GSH檢測；C～E：神經(jīng)元機械性損傷24 h后Parkin對鐵死亡信號通路調(diào)控分子GPX4和ACSL4蛋白表達水平的影響。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 損傷+對照病毒組。圖5 神經(jīng)元鐵死亡信號通路檢測

本研究還發(fā)現(xiàn)，Parkin可通過減輕氧化應(yīng)激和LPO起神經(jīng)保護作用，這與前期研究結(jié)果一致[1314]。上述調(diào)控作用可能與Parkin的E3泛素連接酶性質(zhì)以及靶向降解或修飾參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝的關(guān)鍵分子(ATF4、MFN2等)有關(guān)。此外，Parkin也是線粒體自噬經(jīng)典途徑PINK1-Parkin通路上的樞紐分子，而線粒體自噬與神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)，Parkin可通過調(diào)控ACSL4/GPX4鐵死亡信號軸減輕機械性神經(jīng)元損傷。鐵死亡與TBI密切相關(guān)，ACSL4廣泛參與腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元損害[15]，但Parkin究竟如何調(diào)控ACSL4仍需進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，Parkin可調(diào)控GPX4和GSH代謝，而GSH是神經(jīng)元內(nèi)重要的一類抗氧化物質(zhì)，但這種調(diào)控是直接還是間接，仍需要進一步研究。至今尚未有研究公開報道Parkin與鐵死亡之間的調(diào)控關(guān)系，但鐵死亡與自噬關(guān)系密切，前期研究發(fā)現(xiàn)自噬通路樞紐分子如Beclin 1參與調(diào)控鐵死亡進程[16]，而Parkin作為自噬關(guān)鍵調(diào)控分子之一，因此，自噬可能在Parkin與鐵死亡間發(fā)揮“紐帶作用”。

本研究存在以下不足：第一，本研究主要利用小鼠原代皮層神經(jīng)元開展離體研究，證據(jù)說服力有待通過在體動物研究進一步加強；第二，本研究主要通過過表達Parkin開展分子機制研究，而敲低Parkin或敲除Parkin對神經(jīng)元的影響仍不得而知，研究有待進一步完善。