陳海紅 胡慶蘭 蔣學(xué)風(fēng) 羅志峰 劉海紅

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是來源于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤。每年有接近20萬的新發(fā)病例，占全世界女性癌癥病例的近5%，死亡人數(shù)的占比超過2%，是導(dǎo)致死亡的第三大常見婦科惡性腫瘤。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率、病死率上升，呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅女性身體健康[1-2]。子宮內(nèi)膜樣腺癌是EC中最常見的病理類型，探索其致病機(jī)理，尋找預(yù)防、治療子宮內(nèi)膜樣腺癌的新方法具有重要的臨床意義。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對于腫瘤細(xì)胞的作用是很重要的[3]。在Dong等[4]子宮內(nèi)膜癌研究中，Kruppel樣因子17（KLF17）通過反激活TWIST1來調(diào)節(jié)啟動EMT而發(fā)揮致癌作用，KLF17在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。

轉(zhuǎn)錄輔助因子退變樣蛋白4（VGLL4）是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子（TEAD）的新伙伴，在子宮內(nèi)膜腺上皮組織中有表達(dá)且起到腫瘤抑制作用[5]?；诖?，本試驗(yàn)通過免疫組化法了解KLF17、VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)情況，分析KLF17、VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的病理差異性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年6月-2020年4月，從清遠(yuǎn)市婦幼保健院婦產(chǎn)科收集91例標(biāo)本的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后經(jīng)病理檢查確診；（2）術(shù)前未進(jìn)行化療、放療或生物靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）艾滋病等累及免疫功能的疾病。其中22例為正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，28例經(jīng)病理診斷為子宮內(nèi)膜單純性增生組織標(biāo)本，41例為子宮內(nèi)膜樣腺癌組織標(biāo)本。41例的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織標(biāo)本中，年齡35～72歲，中位年齡52歲。根據(jù)病理分化程度，高分化18例，中分化14例，低分化9例。根據(jù)2019年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類：34例Ⅰ、Ⅱ期和7例Ⅲ、Ⅳ期。肌層浸潤深度＜1/2者30例，≥1/2者11例。包括：6例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，35例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。28例子宮內(nèi)膜單純性增生組織標(biāo)本中，年齡30～69歲，中位年齡49歲，病程3～8個月，平均（5.64±0.61）個月；22例正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中，年齡36～70歲，中位年齡55歲。以上石蠟切片及病理標(biāo)本均由2名病理專家重新閱片、復(fù)核證實(shí)。本研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并通過清遠(yuǎn)市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

儀器：光學(xué)顯微鏡（XSP-C204）；成像系統(tǒng)；全自動LEICA免疫組化染色系統(tǒng)等。試劑：Rabbit anti-KLF17 antibody（ 武 漢 三 鷹 ）、Rabbit anti-VGLL4 antibody（abclonal）、免疫組織化學(xué) S-P 檢測試劑盒（servicebio）及DAB顯色試劑盒（servicebio）。選取石蠟標(biāo)本，連續(xù)切成厚4 μm的切片，所有切片均予防脫載玻片撈取標(biāo)本，置于60 ℃烤片機(jī)烤片40 min以上，以防止脫片。嚴(yán)格按照試劑盒的說明，采用免疫組化學(xué)SP法進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、加一抗、孵育、加二抗、復(fù)染、閱片等步驟。試驗(yàn)陰性結(jié)果：PBS液代替一抗所得出的結(jié)果。試驗(yàn)的陽性對照：睪丸組織中KLF17陽性表達(dá)，胎盤組織中VGLL4陽性表達(dá)結(jié)果，顯色為棕黃色。

1.3 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

KLF17、VGLL4主要表達(dá)于細(xì)胞核中；對每張載玻片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野，觀察染色強(qiáng)度并計(jì)分：分為0分（不存在）、1分（淺黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）。計(jì)數(shù)染色陽性細(xì)胞占比及得分：分為0分（＜5%）、1分（5%～25%），2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。IRS是染色強(qiáng)度得分和陽性染色細(xì)胞得分的總和（范圍 0～7分），0～2分：-；3～4分：+；5～6分：++；7分：+++。其中 KLF17的IRS≥5分是高（陽性）表達(dá)，IRS≤4分是低（陰性）表達(dá)；VGLL4的IRS≥4分是高（陽性）表達(dá)，IRS≤3分是低（陰性）表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的歸納整理，本研究相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果是運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，臨床指標(biāo)比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料采用秩和檢驗(yàn)，比較KLF17與VGLL4表達(dá)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)及Spearman分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是α=0.05；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLF17與VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜單純性增生及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

KLF17在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜單純性增生、正常子宮內(nèi)膜中陽性率分別占80.5%（33例）、25.0%（7例）、18.2%（4例），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜單純性增生、正常子宮內(nèi)膜中陽性率分別占24.4%（10例）、71.4%（20例）、77.3%（17例），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 KLF17和VGLL4在不同組織內(nèi)膜中的表達(dá)

2.2 KLF17和VGLL4的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

KLF17在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率在不同年齡組間、FIGO分期（Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ）、肌層浸潤深度是否小于1/2、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)陽性率在不同年齡組、FIGO分期（Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ）、肌層浸潤深度是否小于1/2、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與分化程度有相關(guān)性，分化程度越高，表達(dá)越強(qiáng)（P＜0.05），見表2。

表2 KLF17和VGLL4的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 VGLL4表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌分化程度的相關(guān)性分析

在人子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，提示VGLL4表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌分化程度存在正相關(guān)（r=0.346，P＜0.05），見表 3。

表3 VGLL4表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌分化程度的相關(guān)性分析（例）

2.4 KLF17與VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

在人子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，KLF17表達(dá)與VGLL4表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性（r=-0.437，P＜0.05），見表4。

表4 KLF17與VGLL4在子宮內(nèi)膜樣腺癌中表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是惡性上皮性腫瘤，高危因素有早初潮和晚絕經(jīng)、不孕和不育、年齡增長、肥胖等。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展是由多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及基因異常相互作用的結(jié)果，是一組異質(zhì)性的疾病[6-7]。KLF17作為激活劑或抑制劑發(fā)揮作用，取決于與不同的啟動子及相互作用的結(jié)合蛋白，對腫瘤起到雙向調(diào)節(jié)的作用，KLF17是子宮內(nèi)膜癌上新發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)EMT的因子。VGLL4可抑制EMT[8]。KLF17能夠通過其鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合在靶基因富含G/C序列的啟動子區(qū)，進(jìn)而啟動或抑制下游基因的表達(dá)[9]。本研究得出，KLF17與年齡、FIGO分期、肌層浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有研究中指出KLF家族的成員可以根據(jù)細(xì)胞和啟動子環(huán)境來選擇充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的激活劑或阻遏劑，或兩者兼有[8]。KLF17的作用功能取決于啟動子的功能及啟動子所處的微環(huán)境。本研究中提示，KLF17在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中明顯表達(dá)上調(diào)。KLF17作為跨膜絲氨酸蛋白酶corin（CRN）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，表達(dá)上調(diào)后參與妊娠子宮的調(diào)節(jié)和生理。因KLF17有反式激活的能力，在子宮內(nèi)膜癌中是表達(dá)上調(diào)的。本研究與Dong等[4]研究中發(fā)現(xiàn)相一致，在KLFs家族中，KLF（1、4、5、10、13、16和17）在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中顯著上調(diào)，KLF（2、7、8、9、11、12、14和15）表達(dá)下調(diào)。KLF17通過結(jié)合TWIST1啟動子反激活TWIST1。被激活的TWIST1通過直接抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白致多梳狀蛋白-1（BMI-1）表達(dá)上調(diào)或TWIST1直接上調(diào)BMI-1的表達(dá)來促進(jìn)EMT[10-11]。在Shen等[12]研究中指出：TWIST1的陽性表達(dá)：正常＜不典型增生＜Ⅰ型EC。與本文研究提示KLF17的陽性率呈遞增趨勢相一致。子宮內(nèi)膜腺癌中高表達(dá)的TWIST1與KLF17結(jié)合，促進(jìn)癌癥的發(fā)生及發(fā)展。KLF17下調(diào)的情況在乳腺癌[13]、口腔癌[14]等研究中提示與癌組織TNM分期呈負(fù)相關(guān)，提示預(yù)后不良。本研究與臨床病理特征無相關(guān)性，或許KLF17單純的參與子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生，或許是試驗(yàn)樣本中病理類型較單一，子宮內(nèi)膜樣腺癌的預(yù)后良好，細(xì)胞分化良好，弱化其與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性，而標(biāo)本數(shù)量相對較少及晚期病例不足等引起。

YAP作為原癌基因與TEAD結(jié)合，在Hippo通路中起到致癌作用。VGLL4作為體內(nèi)YAP蛋白的抑制劑，競爭性結(jié)合TEAD，形成VGLL4-TEADs復(fù)合物，作用于Hippo途徑的末端靶向轉(zhuǎn)錄機(jī)制，調(diào)控Hippo信號通路，達(dá)到有效地抑制腫瘤的形成和發(fā)展。有研究指出，VGLL4和YAP在調(diào)節(jié)腫瘤免疫中起到核心作用[15]。另外，VGLL4還作為人類胚胎干細(xì)胞存活的正調(diào)節(jié)因子[16]。基于上述理論基礎(chǔ)，VGLL4在多種腫瘤中表達(dá)普遍下調(diào)，本試驗(yàn)研究通過免疫組化法檢測VGLL4的表達(dá)，結(jié)果分析得出，VGLL4在10例（24.4%）病例中呈陽性，子宮內(nèi)膜樣腺癌組中VGLL4的陽性表達(dá)低于子宮內(nèi)膜單純性增生組，低于內(nèi)膜正常組織中的表達(dá)。VGLL4陽性表達(dá)率與患者年齡、FIGO分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比較無相關(guān)性，與腫瘤的分化程度有關(guān)，分化程度越高，表達(dá)越強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.346，P＜0.05），這與Kim等[17]研究相似，Kim等[17]的研究中指出VGLL4在164例（55.6%）結(jié)直腸癌患者中呈陽性，腫瘤體積大小、pT分級高低、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與其相關(guān)。有研究指出，YAP在子宮內(nèi)膜癌中過表達(dá)與細(xì)胞增殖、侵襲和遷移顯著相關(guān)[18]。TEAD在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中高表達(dá)[19]。在子宮內(nèi)膜腺癌中，VGLL4表達(dá)下調(diào)，YAP表達(dá)上調(diào)，TEAD表達(dá)上調(diào)。下調(diào)的VGLL4的拮抗作用減弱，機(jī)體中YAP-TEADs復(fù)合物形成增多，同時(shí)VGLL4抑制YAP-TEADs復(fù)合物活性的作用減弱，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，與本研究結(jié)果相一致。有研究指出，VGLL4mRNA異常水平與胃腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[20]，與本研究結(jié)果不相符，可能與本研究中晚期及復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移的標(biāo)本量太少有關(guān)。VGLL4作為腫瘤抑制基因，在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)。在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜單純性增生、子宮內(nèi)膜樣腺癌三組組織中，VGLL4的表達(dá)呈逐漸下降趨勢，可能與內(nèi)膜病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

隨著子宮內(nèi)膜樣腺癌的相關(guān)研究越來越多，疾病的發(fā)生逐漸年輕化[21]。EMT是腫瘤發(fā)生過程中有重要作用。E-鈣黏蛋白的喪失在EMT發(fā)生的不可或缺的事件之一。VGLL4過表達(dá)增加E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平并降低β-catenin的表達(dá)水平，部分可通過負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑抑制EMT，抑制癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移[22]。而TWIST1作為KLF17結(jié)合的啟動子，直接抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)EMT促進(jìn)癌癥的發(fā)生及發(fā)展。E-鈣黏蛋白的水平高低影響EMT的發(fā)生及發(fā)展。本試驗(yàn)結(jié)果表明：在33例KLF17陽性表達(dá)的人子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本中，有28例VGLL4表達(dá)陰性；在31例VGLL4表達(dá)陰性的人子宮內(nèi)膜樣腺癌樣本中，有28例KLF17樣本表達(dá)陽性，兩者呈負(fù)相關(guān)性。兩者在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的作用有可能是相反的，這或許是相互作用，又或許是獨(dú)立存在的因子。本試驗(yàn)研究顯示，KLF17的表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜單純性增生、子宮內(nèi)膜樣腺癌三組組織中呈上調(diào)趨勢，VGLL4的表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜單純性增生、子宮內(nèi)膜樣腺癌三組組織中呈下調(diào)趨勢，這表明在癌變的過程中，內(nèi)膜組織中KLF17、VGLL4發(fā)生變化。但本試驗(yàn)只反映出其變化的趨勢，不排除有某種調(diào)節(jié)機(jī)制：KLF17、VGLL4對E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平的影響，從而影響子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生過程，這只是其中一個方面，是否還有多個方面或機(jī)制聯(lián)系KLF17、VGLL4參與子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生，其具體變化需進(jìn)一步完善更全面的試驗(yàn)和綜合分析。在后續(xù)的試驗(yàn)研究中將加大臨床病例數(shù)，搜集子宮內(nèi)膜伴有不典型增生組織，增設(shè)試驗(yàn)分組，以及定量檢測KLF17、VGLL4的表達(dá)水平，具體了解其在正常子宮內(nèi)膜-子宮內(nèi)膜單純性增生-子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生軸中是否存在量的變化趨勢，從而研究KLF17和VGLL4的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜病變程度之間的關(guān)系。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜樣腺癌中，KLF17表達(dá)的上調(diào)和VGLL4表達(dá)的下調(diào)共同參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，二者可能與內(nèi)膜病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。