陳海燕，隨家寧，黃婉清，農(nóng)麗惠，馮婷，李芳嬋*，蔣林，2，3*（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200；3.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530200）

三方益子方由三個(gè)古代經(jīng)典名方加減化裁而來，由鹽益智、鹽補(bǔ)骨脂、烏藥、金櫻子、酒覆盆子、酒黃精、枸杞子、桑葚、芡實(shí)、酒蓯蓉和炙甘草11 味藥組成，具暖腎祛寒、溫脾養(yǎng)肝、縮尿止遺的功效。方中益智仁能溫腎暖脾、固精縮尿，補(bǔ)骨脂能溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉，鹽炙能緩和辛竄濕燥之性，并可引藥入腎，增強(qiáng)補(bǔ)腎健脾之功效，兩者共為君藥。烏藥能行氣止痛、溫腎散寒，能除膀胱和腎間冷氣、止小便頻數(shù)，為臣藥。肉蓯蓉能補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸道，為佐藥。甘草益氣補(bǔ)中、調(diào)和藥性，為使藥。

在選擇含量測(cè)定對(duì)象時(shí)，要全面且科學(xué)，按君臣佐使選擇重點(diǎn)質(zhì)量標(biāo)志物，文獻(xiàn)表明，5-羥甲基糠醛是食品和藥品中普遍存在的共性成分，具有保肝、改善學(xué)習(xí)記憶、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗氧化等多種功效，且可促進(jìn)甘草酸的代謝，加強(qiáng)抑制腫瘤、抗炎、降低血中膽固醇的作用，本方中鹽益智、黃精、枸杞子、桑葚、酒蓯蓉、炙甘草均含有該成分，覆蓋君臣佐使藥。方中鹽益智、金櫻子、桑葚、枸杞子均含有原兒茶酸，該化合物可通過抗氧化應(yīng)激活性發(fā)揮保肝作用。單體松果菊苷為肉蓯蓉中的保肝活性成分，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂中的主要活性成分之一，甘草中的甘草酸具改善腎功能的作用。為提升和完善三方益子膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保臨床用藥的安全，本研究擬采用薄層色譜法對(duì)三方益子膏中鹽益智、鹽補(bǔ)骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草5 味藥材進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相法測(cè)定有效成分5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和甘草酸含量，為三方益子膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；超純水儀一體機(jī)Direct-Q5UV（廣西南寧市博美生物科技有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；DZF-6090 真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-4 恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；AR204E 千分之一電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]。

1.2 試藥

甲醇（批號(hào)：2020102902）、乙醇（批號(hào)：2019121602）、乙酸乙酯（批號(hào)：2020081101）、冰醋酸（批號(hào)：2018081301）、 硫酸（批號(hào)：2018082901）、正丁醇（批號(hào)：2019032201）、石油醚（批號(hào)：2020072701）（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；36%醋酸（上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司）；甲酸（批號(hào)：2019040802，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；正己烷（批號(hào)：2020080501）、環(huán)己烷（批號(hào)：2019071802）（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；色譜級(jí)乙腈[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；分析級(jí)磷酸（批號(hào)：20190606，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；蜂蜜（湖南藥圣堂中藥科技有限公司）；阿斯帕坦（南寧市越前食品添加劑有限責(zé)任公司）；對(duì)照藥材益智仁（批號(hào)：121590-202003）、 補(bǔ)骨脂（批號(hào)：121056-201605）、烏藥（批號(hào)：121096-201907）、肉蓯蓉（批號(hào)：121101-201603）、甘草（批號(hào)：120904-202021）； 對(duì)照品原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906）、松果菊苷（批號(hào)：110749-201919）、補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：111525-201912）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：110736-201943）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)：110629-201919）（含量＞98%，中國食品藥品檢定研究院）；對(duì)照品甘草酸（批號(hào)：RP190517，含量：99.34%，成都麥德生科技有限公司）；薄層樣品（批號(hào)：20201001、20201002、20201003），S1 ～S10 號(hào)樣品（批號(hào)：20210301，20210302，20210303，20210304，20210305，20210306，20210307，20210308，20210309，202103010）（由廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程中心實(shí)驗(yàn)室自制，規(guī)格：180 g/瓶）。

2 三方益子膏的制備

按處方量稱取鹽益智、鹽補(bǔ)骨脂、烏藥、金櫻子、酒覆盆等11 味藥材，加14 倍量水提取2 次，每次2 h，濾過，濃縮至相對(duì)密度為1.40 ～1.45（80 ～90℃），添加輔料蜂蜜∶阿斯帕坦（10∶0.1）適量，攪拌均勻，分裝，滅菌，即得（1 g 膏滋相當(dāng)于1.842 g 生藥量）。

3 薄層鑒別

3.1 益智仁的薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號(hào)：20201001、20201002、20201003），加純水20 mL，用石油醚萃取2 次，每次40 mL，合并石油醚層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取益智仁對(duì)照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加入石油醚30 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，即得對(duì)照藥材溶液。按處方比例稱取除益智仁外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，再同法制得缺益智仁陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，各吸取供試品溶液和陰性樣品溶液15 μL，益智仁藥材溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱5 min，置日光燈下檢視。結(jié)果如圖1。

圖1 益智仁薄層色譜圖Fig 1 TLC of Alpiniae Oxyphyllae Fructus

3.2 補(bǔ)骨脂的薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號(hào)：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超聲15 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。取補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加20 mL 乙酸乙酯，超聲15 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 乙酸乙酯使溶解，即得補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材溶液。取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 各含2 mg 的混合溶液。稱取除補(bǔ)骨脂以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液和補(bǔ)骨脂藥材溶液2 μL，對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鈉乙醇溶液，吹干，置紫外光燈下（365 nm）下檢視。結(jié)果如圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂薄層色譜圖Fig 2 TLC of Psoraleae

3.3 烏藥薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號(hào)：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液揮干，用10 mL 純水溶解，再用氯仿萃取3 次，每次20 mL，合并氯仿層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取烏藥對(duì)照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液揮干，用10 mL 純水溶解，再用氯仿萃取3 次，每次20 mL，合并氯仿層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，即得烏藥對(duì)照藥材溶液。稱取除烏藥以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各12 μL，烏藥藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶1.5∶0.1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱5 min，置紫外光燈下（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖3。

圖3 烏藥薄層色譜展開圖Fig 3 TLC of Lindera Radix

3.4 酒蓯蓉薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號(hào)：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲提取30 min（功率200 W，頻率40 kHz），過濾，濾液揮干，用25 mL 純水溶解，再用水飽和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取肉蓯蓉對(duì)照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲提取30 min（功率200 W，頻率40 kHz），過濾，濾液揮干，用25 mL 純水溶解，再用水飽和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，制得毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為1.045 mg·mL的對(duì)照品溶液。稱取除肉蓯蓉以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各7 μL，肉蓯蓉藥材溶液2 μL，毛蕊花糖苷對(duì)照品液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以醋酸乙酯-甲醇-9%醋酸溶液（15∶3∶2）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，吹干，置日光下檢視。結(jié)果見圖4。

圖4 肉蓯蓉薄層色譜圖Fig 4 TLC of Cistanches Herba

3.5 炙甘草薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號(hào)：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，用40 mL 水溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，用40 mL 水溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。稱取除甘草以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各13 μL，甘草對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（18∶7∶1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱5 min，置日光下檢視。結(jié)果見圖5。

圖5 炙甘草薄層色譜圖Fig 5 TLC of Grilled Glycyrrhiza

4 三方益子膏中有效成分含量的測(cè)定

4.1 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脫（0 ～5 min，5%B；5 ～12 min，7%B；12 ～26 min，15%B；26 ～35 min，40%B；35 ～45 min，50%B；45 ～60 min，85%B）；切換波長檢測(cè)（0 ～15 min，260 nm；15 ～30 min，330 nm；30 ～60 min，252 nm）；柱溫35℃；流速1.0 mL·min；進(jìn)樣量10 μL。

4.2 供試品溶液的制備

稱取三方益子膏（批號(hào)：20201002）3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），放冷至室溫，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，即得供試品溶液。

4.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和甘草酸對(duì)照品各適量，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.263、0.017、0.098、0.038、0.049、0.078 mg·mL的混合對(duì)照品溶液。

4.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取相應(yīng)藥材，按制備工藝制成膏滋。稱取各膏滋適量，按“4.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液A（缺鹽益智、黃精、枸杞子、桑葚、酒蓯蓉、炙甘草），陰性樣品溶液B（缺鹽益智、金櫻子、桑葚、枸杞子），陰性樣品溶液C（缺補(bǔ)骨脂），陰性樣品溶液D（缺肉蓯蓉）及陰性樣品溶液E（缺甘草）。

4.5 方法學(xué)考察

4.5.1 專屬性考察 分別取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果樣品中色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品相應(yīng)的色譜峰保留時(shí)間一致，各峰分離度、對(duì)稱性較好，各陰性樣品對(duì)測(cè)定無影響，理論塔板數(shù)以原兒茶酸計(jì)不低于10 000，色譜圖見圖6。

圖6 三方益子膏專屬性試驗(yàn)HPLC 圖譜Fig 6 HPLC chromatogram of specificity test for SanfangYizi ointment

4.5.2 線性關(guān)系考察 取“4.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，稀釋成系列濃度混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（

Y

）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（

X

，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得各成分的回歸方程，5-羥甲基糠醛：

Y

＝2832.16

X

＋43.45，

r

＝0.9999；原兒茶酸：

Y

＝3129.93

X

＋3.78，

r

＝0.9999；松果菊苷：

Y

＝1196.98

X

＋5.68，

r

＝0.9999；補(bǔ)骨脂素：

Y

＝5847.81

X

＋11.45，

r

＝0.9999；異補(bǔ)骨脂素：

Y

＝5404.57

X

＋18.96，

r

＝0.9999；甘草酸：

Y

＝804.76

X

＋2.79，

r

＝0.9999；5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸分別在0.526 ～2.63 μg、0.034 ～0.17 μg、0.196 ～0.98 μg、0.076 ～0.38 μg、0.098 ～0.49 μg、0.156 ～0.78 μg 與峰面積線性關(guān)系良好。4.5.3 精密度試驗(yàn) 取“4.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄相應(yīng)的峰面積。結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸峰面積的

RSD

分別為0.10%、0.13%、0.080%、0.080%、0.090%、0.060%， 顯示儀器精密度良好。4.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取三方益子膏（批號(hào)：20201002）6 份，各3 g，精密稱定，按“4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸的平均含量分別為2.121、0.167、0.843、0.295、0.432、0.658 mg·g，

RSD

分別為0.50%、1.1%、0.57%、0.38%、0.48%、0.37%，表明該方法的重復(fù)性良好。4.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“4.2”項(xiàng)下方法制備三方益子膏（批號(hào)：20201002）供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸含量的

RSD

分別為1.0%、0.84%、1.4%、0.77%、0.76%、0.96%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。4.5.6 加樣回收試驗(yàn) 稱取三方益子膏（批號(hào)：20201002）1.5 g，共6 份，分別加入適量的5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸對(duì)照品，制備成供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸的平均加樣回收率為101.75%、97.54%、101.90%、97.82%、96.56%、99.11%，

RSD

分別為1.2%、2.4%、1.9%、1.6%、1.0%、1.8%。

4.6 樣品含量測(cè)定

取S1 ～S10 樣品各3 g，按“4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表1。10 批三方益子膏中5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸的平均含量分別為0.863、0.187、2.323、0.145、0.185、0.631 mg·g。按照制劑含量測(cè)定范圍不得低于80%計(jì)算，10 批三方益子膏中5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、甘草酸的含量分別不得低于0.690、0.149、1.858、0.116、0.147 和0.504 mg·g。

表1 10 批樣品的含量測(cè)定結(jié)果(mg·g)
Tab 1 Content determination of 10 batches of samples (mg·g)

樣品5-羥甲基糠醛原兒茶酸松果菊苷補(bǔ)骨脂素異補(bǔ)骨脂素甘草酸S11.004 0.171 2.178 0.139 0.185 0.606 S20.802 0.171 2.215 0.137 0.180 0.544 S30.904 0.212 2.501 0.150 0.194 0.681 S40.808 0.213 2.292 0.135 0.162 0.671 S50.883 0.184 2.265 0.153 0.184 0.641 S60.791 0.204 2.557 0.154 0.182 0.675 S70.898 0.189 2.348 0.159 0.198 0.611 S80.853 0.190 2.049 0.147 0.187 0.589 S90.802 0.158 2.454 0.147 0.197 0.639 S100.889 0.176 2.374 0.134 0.180 0.653平均值0.863 0.187 2.323 0.145 0.185 0.631

5 討論

本研究建立了三方益子膏的薄層鑒別方法，在鹽益智、鹽補(bǔ)骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草薄層鑒別的過程中，分別考察了濕度、溫度、不同展開劑以及不同薄層板對(duì)樣品展開的影響，發(fā)現(xiàn)環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶1）、正己烷-乙酸乙酯（4∶1）、苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶1.5∶0.1）、醋酸乙酯-甲醇-9%醋酸溶液（15∶3∶2）、三氯甲烷-甲醇-水（18∶7∶1）作為鹽益智、鹽補(bǔ)骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草的鑒別展開劑，斑點(diǎn)均明亮清晰、分離效果均較好，并且無拖尾現(xiàn)象。在含量測(cè)定方法中，分別考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液4 種流動(dòng)相，結(jié)果在以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)的峰形與分離度均良好。

本研究對(duì)三方益子膏中鹽益智、鹽補(bǔ)骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草5 味藥材進(jìn)行薄層色譜法系統(tǒng)研究，覆蓋處方的君臣佐使藥，建立了合理、有效的三方益子膏主要成分的薄層鑒別方法；所建立的HPLC 方法，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可作為三方益子膏的定量分析方法，為三方益子膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。