左月明，陳林林，張忠立（江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004）

百合科延齡草屬（

Trillium

L.）植物，我國(guó)有3 種，分別為延齡草（

Trillium tschonoskii

Maxim.）、西藏延齡草（

Trillium govanianum

wall.ex Royle）和吉林延齡草（

Trillium kamtschaticum

Pall.ex Puersh）。延齡草藥材又名頭頂一顆珠、芋兒七和獅兒七等，藥用部位為根及根莖，其味甘、性平、有小毒，有延年益壽的功效，主治頭暈、跌打損傷、高血壓病和腦震蕩后遺癥等疾病，為土家族常用藥材。目前已從延齡草屬植物中分離得到100 多個(gè)化合物，分別為甾體皂苷類、倍半萜苷類、黃酮苷類、苯丙素苷類等成分。重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ等甾體皂苷成分為延齡草藥材主要的藥效物質(zhì)，也是中藥重樓的主要藥效成分，具有抗炎、活血、抗心腦缺血和抗阿爾茨海默病等藥理作用。通過(guò)市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)幾大藥材市場(chǎng)流通的延齡草藥材大多來(lái)自湖北、吉林、陜西等地產(chǎn)的延齡草和吉林延齡草，兩者植物形態(tài)可明顯區(qū)分，但藥用部位不易辨認(rèn)。目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道大多針對(duì)延齡草的質(zhì)量控制研究，而對(duì)市場(chǎng)上供應(yīng)量最大的吉林延齡草缺少完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。因此，本文擬采用HPLC 法建立21 批延齡草根莖樣品的指紋圖譜和主成分含量測(cè)定方法，并應(yīng)用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法對(duì)不同產(chǎn)地延齡草根莖樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；CP225D 十萬(wàn)分之一分析天平（北京賽多利斯有限公司）；KQ-700DE 超聲清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市凱航儀器有限公司）。

1.2 試藥

偏諾皂苷元-3-

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅵ（簡(jiǎn)稱Y2T）；偏諾皂苷元-3-

O

-

α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-[

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）]-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱Y3T）；偏諾皂苷元-3-

O-α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-[

O

-

α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）]-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅶ（簡(jiǎn)稱Y4T），均為白色粉末（純度均大于98.0%，實(shí)驗(yàn)室自制）。乙腈、甲醇均為色譜純（德國(guó)默克公司）；純凈水（杭州娃哈哈有限公司）。延齡草根莖藥材樣品S1 ～S10 為延齡草、S11 ～S21 為吉林延齡草，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室左月明教授鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草

Trillium tschonoskii

Maxim.和吉林延齡草

Trillium kamtschaticum

Pall.ex Puersh的干燥根莖。藥材信息見(jiàn)表1。

表1 延齡草根莖藥材樣品信息
Tab 1 Information of rhizomes sample

序號(hào)產(chǎn)地序號(hào)產(chǎn)地S1陜西省寶雞市眉縣（栽培）S12吉林省白山市靖宇縣（栽培）S2陜西省安康市旬陽(yáng)縣（栽培）S13吉林省樺甸市紅石鎮(zhèn)（栽培）S3陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣（栽培）S14吉林省蛟河市（栽培）S4湖北省恩施土家族苗族自治州1（栽培）S15吉林省延邊朝鮮族自治州汪清縣（栽培）S5湖北省宜昌市木魚(yú)鎮(zhèn)4年生（栽培）S16吉林省長(zhǎng)白山保護(hù)區(qū)池北區(qū)5年生（野生）S6甘肅省大別山地區(qū)（野生）S17吉林省長(zhǎng)白山保護(hù)區(qū)池北區(qū)4年生（野生）S7湖北省宜昌市木魚(yú)鎮(zhèn)5年生（栽培）S18吉林省延邊朝鮮族自治州汪清縣（栽培）S8湖北省神農(nóng)架地區(qū)5年生（野生）S19吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣4年生（栽培）S9湖北省神農(nóng)架地區(qū)4年生（野生）S20吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣3年生（栽培）S10湖北省恩施土家族苗族自治州2（栽培）S21吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣5年生（栽培）S11吉林省白山市江源區(qū)灣溝鎮(zhèn)（栽培）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil（2）C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL·min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 ～22 min，5% ～45%A；22 ～37 min，45%A；37 ～42 min，45% ～85%A；42 ～50 min，85%A）。

2.2 延齡草HPLC 指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取延齡草根莖藥材粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約1.0 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱重，回流提取2 h，放冷后稱重，用70%甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)濾，蒸干，甲醇復(fù)溶，定容于10 mL 量瓶中，超聲混勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定Y2T、Y3T和Y4T 對(duì)照品25.00 mg，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，稀釋成系列濃度，即得。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 稱取延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次。以9 號(hào)峰Y3T 為參照峰（該峰的相對(duì)保留時(shí)間變化穩(wěn)定、分離度良好，且其為延齡草藥材的特征性成分），記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

均小于0.089%，相對(duì)峰面積

RSD

均小于3.0%，表明儀器精密度良好。2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣。以9 號(hào)峰為參照峰，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

均小于0.24%，相對(duì)峰面積

RSD

均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備成6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以9 號(hào)峰為參照峰，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

均小于0.15%，相對(duì)峰面積

RSD

均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。2.2.6 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將21 批供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所得21批延齡草根莖藥材色譜圖數(shù)據(jù)依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》軟件，以樣品S20 圖譜為參照指紋圖譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.5 生成對(duì)照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行全譜峰自動(dòng)匹配，見(jiàn)圖1。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的

RSD

均小于1.0%。對(duì)21 批延齡草根莖藥材樣品HPLC 色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果表明S1 ～S21 號(hào)樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度介于0.824 ～0.972（見(jiàn)表2），除樣品S12 的相似度（0.824）和S21 的相似度（0.890）低于0.900 之外，其余樣品化學(xué)成分組成基本相同，差異較小，且栽培品種與野生品種的相似度也達(dá)到0.900 以上，表明本文中不同產(chǎn)地延齡草藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定，野生與栽培品種指紋圖譜無(wú)明顯差異。

表2 21 批延齡草根莖藥材樣品HPLC 指紋圖譜相對(duì)相似度評(píng)價(jià)
Tab 2 Relative similarity evaluation of HPLC fingerprints of 21 batches of rhizomes sample

序號(hào)相似度序號(hào)相似度序號(hào)相似度S10.950 S80.972 S150.952 S20.952 S90.953 S160.953 S30.968 S100.971 S170.951 S40.931 S11 932 S12 945 S130.943 S180.931 S50.0.824 S190.955 S60.0.924 S200.915 S70.924 S140.959 S210.890

圖1 21 批延齡草根莖藥材樣品HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizome sample

2.2.7 指紋圖譜共有峰的指認(rèn)與歸屬 取21 批延齡草根莖藥材樣品色譜圖，共確定10 個(gè)共有峰，通過(guò)保留時(shí)間和紫外圖譜對(duì)照分析，指認(rèn)了3個(gè)共有峰，8 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅶ（Y4T）、9 號(hào)峰為偏諾皂苷元-3-

O

-

α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-[

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）]-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷（Y3T）、10 號(hào)峰為重樓皂苷Ⅵ（Y2T），混合對(duì)照品和延齡草根莖藥材樣品的HPLC 色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品（A）和延齡草根莖藥材樣品（B）的HPLC 圖Fig 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A）and Trillium kamtschaticum rhizomes sample（B）

2.3 延齡草根莖藥材中3 種主要成分的含量測(cè)定

課題組前期在對(duì)延齡草根莖藥材成分的研究中，發(fā)現(xiàn)藥材中甾體皂苷Y4T、Y3T 和Y2T 含量較高，其中Y3T 是延齡草中的專屬性成分，且在203 nm 處有紫外吸收，可以直接用紫外檢測(cè)器進(jìn)行含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，并對(duì)分離得到的3 種對(duì)照品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和解析，確定延齡草HPLC 指紋圖譜中8、9、10 號(hào)色譜峰分別為Y4T、Y3T 和Y2T，均為含量較高的色譜峰，能較好地反映藥材的質(zhì)量。因此，本研究選擇這3 個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 從圖2 可知，延齡草樣品中甾體皂苷Y4T（8 號(hào)峰）、Y3T（9 號(hào)峰）、Y2T（10號(hào)峰）各峰的分離度良好，其保留時(shí)間分別為27.02、27.90 和30.23 min。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液適量，稀釋得最終質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、1.600、3.200、5.000 mg·mL的Y2T、Y3T、Y4T 系列對(duì)照品溶液。經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，分別精密吸取各系列對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以藥物質(zhì)量濃度（

X

，mg·mL）為橫坐標(biāo)，峰面積值（

Y

）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程，

Y

＝3.675×10

X

＋2.644×10，

r

＝0.9999；

Y

＝3.070×10

X

＋5.073×10，

r

＝0.9999；

Y

＝2.564×10

X

＋3.368×10，

r

＝0.9999（

n

＝9）。結(jié)果表明Y2T、Y3T、Y4T 均在質(zhì)量濃度0.025 ～5.000 mg·mL內(nèi)的質(zhì)量濃度（

X

）與峰面積值（

Y

）呈良好的線性關(guān)系。2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密稱定延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積。計(jì)算Y2T、Y3T、Y4T 峰面積的

RSD

分別為1.6%、1.4%、1.7%，表明儀器精密度良好。2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。計(jì)算Y2T、Y3T、Y4T 各成分峰面積的

RSD

分別為1.8%、1.7%、1.8%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量計(jì)算，計(jì)算Y2T、Y3T、Y4T 含量的

RSD

分別為1.0%、1.6%、1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定延齡草根莖藥材粉末（編號(hào)S20）約1.0 g，按照對(duì)照品量-樣品中含量約1∶1 的比例，加入Y2T、Y3T、Y4T 對(duì)照品，平行制備6 份樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量計(jì)算，并計(jì)算回收率。結(jié)果表明Y2T、Y3T、Y4T 的平均加樣回收率分別為103.0%、98.8%、99.2%，

RSD

分別為1.3%、1.1%、1.9%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.7 含量測(cè)定 取21 批延齡草根莖藥材指紋圖譜測(cè)定用樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中3 個(gè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，不同產(chǎn)區(qū)的延齡草根莖中延齡草皂苷含量不同，Y2T 含量范圍在10.71 ～27.65 mg·g，Y3T 在9.27 ～24.80 mg·g，Y4T 在2.84 ～8.95 mg·g，總皂苷含量在23.96 ～61.40 mg·g，其中S12 號(hào)樣品在3 個(gè)指標(biāo)成分含量和總皂苷含量均為最高，而S10 號(hào)樣品在Y3T、Y4T 和總皂苷含量均為最低。從3 個(gè)指標(biāo)成分在延齡草根莖藥材中的含量分布來(lái)看，21 批樣品中Y2T 含量略高于Y3T 含量，而Y4T 含量相對(duì)較低，且3個(gè)指標(biāo)成分含量的相對(duì)比例存在一定的差異。所以，選擇延齡草中3 個(gè)指標(biāo)成分總含量能較好地控制延齡草根莖藥材的質(zhì)量。

由表3 結(jié)果還可以看出，分別從4 個(gè)主產(chǎn)區(qū)湖北省宜昌市木魚(yú)鎮(zhèn)（S5、S7）和湖北省神農(nóng)架產(chǎn)區(qū)（S8、S9）的延齡草、吉林省長(zhǎng)白山保護(hù)區(qū)池北區(qū)（S16、S17）和吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣（S19、S20、S21）的吉林延齡草共9 批樣品中3 種皂苷總含量分析，5年生藥材3 種皂苷總含量明顯高于4年生藥材，而3年生藥材指標(biāo)成分的累積量遠(yuǎn)達(dá)不到藥用需求，所以綜合考慮栽培成本等因素可確定延齡草藥材最佳采收年限為4年生或5年生。

表3 3 種主要成分含量測(cè)定( ＝3，mg·g)
Tab 3 Content determination of 3 main components ( ＝3，mg·g)

序號(hào)Y2TY3TY4T總含量S114.9613.584.6033.14 S226.7015.375.1947.26 S318.5113.734.4836.72 S410.7110.704.1525.56 S516.1413.865.0935.09 S621.0716.026.0043.09 S722.0115.905.1543.06 S818.7314.624.7238.07 S915.0012.314.0631.37 S1011.85 9.272.8423.96 S1116.1812.884.5733.63 S1227.6524.808.9561.40 S1322.1115.844.8842.83 S1417.7016.235.8139.74 S1518.4313.814.8537.09 S1619.7417.546.1843.46 S1719.6714.394.2838.34 S1819.0215.744.7539.51 S1920.4616.495.4242.37 S2012.1010.274.5426.91 S2127.6222.937.7558.30

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 聚類分析（CA）以21 批延齡草根莖藥材樣品共有峰的峰面積為變量，使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行聚類分析。利用Z-得分進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用ward 聚類方法和歐氏距離進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)圖3。當(dāng)歐氏距離為20 時(shí)，21 個(gè)產(chǎn)地聚為兩類：S12、S19 和S21 聚成一類，其他聚為一大類；當(dāng)歐氏距離為15 時(shí)，21 個(gè)產(chǎn)地聚為三類：S12 為一類，S19 和S21 聚成一類，其他聚為一大類；當(dāng)歐氏距離為10 時(shí)，21 個(gè)產(chǎn)地聚為四類：S12 為一類，S19 和S21 聚成一類，S4、S20、S11 和S18 聚為一類，其他的聚為一類，說(shuō)明S12、S21 和S19 號(hào)藥材與其他組藥材共有峰峰面積含量差異相對(duì)較大，其余不同產(chǎn)地的延齡草根莖藥材樣品間差異相對(duì)較小。

圖3 21 批延齡草根莖藥材樣品聚類樹(shù)狀圖Fig 3 Dendrogram of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

2.4.2 主成分分析（PCA） PCA 是多元統(tǒng)計(jì)分析中使用最廣泛的數(shù)據(jù)降維算法，它能夠在降維模式下利用代表數(shù)據(jù)特征的不相關(guān)變量來(lái)描述樣本，在無(wú)監(jiān)督模式下根據(jù)數(shù)據(jù)主要成分特征進(jìn)行分析。為更好地客觀反映延齡草根莖藥材之間的差異性，將21 批延齡草根莖藥材樣品共有峰的峰面積結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，進(jìn)行PCA。采用UV 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，自動(dòng)擬合PCA 模型，得到21 批延齡草藥材的PCA 得分圖，見(jiàn)圖4。模型驗(yàn)證結(jié)果

R

X

（累計(jì)解釋能力參數(shù)）＝0.965，

Q

（預(yù)計(jì)能力參數(shù)）＝0.635，

P

＜0.05，說(shuō)明模型擬合能力較好，預(yù)測(cè)能力良好。通過(guò)PCA 分析可知，21 批樣品明顯可歸為四類：S12 和S21 歸為一類，S19 歸為一類，S18 和S11 歸為一類，其他的歸一類，由主成分分析結(jié)果可見(jiàn)其與聚類分析結(jié)果具有一定相似性。

圖4 21 批延齡草根莖藥材樣品的PCA 得分圖Fig 4 PCA score of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

2.4.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）為了更好地篩選21批延齡草根莖樣品組間差異性代表成分峰，本研究在PCA 分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA 分析，選擇OPLSDA 模型分析是因其能夠在PCA 基礎(chǔ)上增強(qiáng)組間分離情況，因?yàn)镺PLS-DA 模型在為樣品組間的差異提供最相關(guān)變量方面具有更大的可靠性。以21 批延齡草根莖藥材指紋圖譜的10 個(gè)共有峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行OPLSDA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。模型驗(yàn)證結(jié)果

R

X

＝0.706，

R

Y

＝0.825，

Q

＝0.722，

P

＜0.05， 說(shuō)明模型擬合能力較好，預(yù)測(cè)能力良好。結(jié)果顯示21 批樣品主要被分為兩類，S12、S16、S17、S19和S21 產(chǎn)于吉林的吉林延齡草被t[1]軸分為同一類，其他的被分為一類，這與PCA 分析結(jié)果較為一致，通過(guò)VIP 篩選出導(dǎo)致延齡草根莖藥材樣品間差異的標(biāo)志性成分，結(jié)果見(jiàn)圖6，以VIP ＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)記出6 個(gè)差異較大的成分，差異大小依次為4、3、9、8、2、10 號(hào)色譜峰。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)出其中的8 號(hào)峰為Y4T、9 號(hào)峰為Y3T、10 號(hào)峰為Y2T，其結(jié)果與含量測(cè)定所選用的3 個(gè)主要指標(biāo)成分互為驗(yàn)證，即延齡草中3 個(gè)指標(biāo)成分總含量能較好地反映延齡草根莖藥材的質(zhì)量。

圖5 21 批延齡草根莖藥材樣品的OPLS-DA 得分圖Fig 5 OPLS-DA score of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

圖6 延齡草根莖藥材HPLC 指紋圖譜中10 個(gè)共有峰的VIP 得分圖Fig 6 VIP score of 10 common peaks in HPLC fingerprint of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

3 討論

因延齡草藥材須根成分含量和根莖有明顯差異，有學(xué)者建議分開(kāi)使用，本研究組前期研究也證實(shí)兩個(gè)藥用部位的質(zhì)量差異性，故本文均統(tǒng)一選用延齡草根莖來(lái)進(jìn)行分析。在樣品提取過(guò)程中，試驗(yàn)分別比較了不同提取方法（加熱回流和超聲）、不同濃度提取溶劑（30%甲醇、70%甲醇、100%甲醇），考察了料液比（1∶25 和 1∶50）、藥材用量（1.0 g 和2.0 g）對(duì)提取結(jié)果的影響。結(jié)果表明，選用1.0 g 藥材用量、1∶50 料液比、70%甲醇回流提取120 min 時(shí)，可得到指紋圖譜中色譜峰最多且峰面積最大的樣品信息。同時(shí)，色譜條件的選擇，分別對(duì)不同波長(zhǎng)和流動(dòng)相比例進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)延齡草皂苷類成分紫外吸收較弱，但在203 nm 附近有明顯的紫外吸收，故選用203 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。比較甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)分離效果較好，洗脫時(shí)間為50 min。

目前對(duì)延齡草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法主要有含量測(cè)定和指紋圖譜方法，而綜合分析的質(zhì)量控制體系還不完善，尤其對(duì)于市場(chǎng)供應(yīng)量最大的吉林延齡草。本文建立了延齡草根莖樣品的指紋圖譜結(jié)合主成分含量測(cè)定方法，綜合分析評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。從藥材HPLC 指紋圖譜分析可知，9 號(hào)峰Y3T 是延齡草根莖藥材的主要化學(xué)成分和特征性成分，該峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，分離度良好，因此選擇9 號(hào)峰作為參照峰。標(biāo)定了10 個(gè)共有峰，用對(duì)照品指認(rèn)了其中3 個(gè)主要色譜峰，并采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)21 批延齡草根莖藥材的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相似度為0.824 ～0.972。結(jié)果表明，S8 號(hào)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度最高，而S12、S21 與其他樣品存在一定差異。對(duì)延齡草根莖藥材指紋圖譜共有峰峰面積進(jìn)行CA 和PCA 分析，除產(chǎn)自吉林的兩批（S12、S21）延齡草根莖藥材與其他產(chǎn)區(qū)樣品略有差異外，大部分產(chǎn)區(qū)的延齡草根莖藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定。此外，OPLS-DA 分析結(jié)果顯示4、3、9、8、2 和10 號(hào)色譜峰是影響延齡草根莖藥材差異的主要標(biāo)志性成分，目前本試驗(yàn)未獲得峰4、3、2 的化合物信息，有待進(jìn)一步開(kāi)展研究，因此對(duì)8、9 和10 號(hào)色譜峰進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示3 種皂苷總含量最高的為S12 號(hào)樣品（吉林靖宇），S21 僅次于S12（這也是S12 和S21 相似度較其他產(chǎn)地低的原因），含量最低的為S10 湖北省恩施苗族自治州的藥材。在對(duì)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)9 個(gè)不同年份樣品中3 種皂苷總含量定量分析發(fā)現(xiàn)，皂苷含量5年生＞4年生＞3年生，所以綜合考慮栽培成本等因素可確定延齡草藥材最佳采收年限為4年生或5年生。

綜上，不同產(chǎn)區(qū)及不同采收期延齡草根莖藥材中甾體皂苷的含量存在一定差異，以吉林延齡草根莖藥材中3 種皂苷總含量相對(duì)較高，也反映了市場(chǎng)上主流藥材商品吉林延齡草的品質(zhì)較好。同時(shí)本文建立的延齡草根莖藥材HPLC 指紋圖譜和含量測(cè)定方法重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于延齡草藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。