孔鑫靚 劉雁峰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京,100700)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS)是一種以生殖內(nèi)分泌紊亂和代謝失調(diào)為主要特征的婦科常見疾病,在育齡期女性中發(fā)病率為5%～10%[1],且具有逐年上升的趨勢。由于PCOS持續(xù)性無排卵或稀發(fā)排卵的特點,其導(dǎo)致的不孕癥發(fā)病率高達50%～80%[2],同時,PCOS并發(fā)的糖脂代謝異常、高雄激素血癥等疾病嚴重危害女性的身心健康?，F(xiàn)階段主要圍繞調(diào)整月經(jīng)周期、降低雄激素水平、促排卵、預(yù)防并發(fā)癥等方面采用口服藥物、手術(shù)、調(diào)整生活方式等方法進行治療,取得了一定成效。但由于西醫(yī)治療方法具有一定局限性與不良反應(yīng),中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療逐漸成為越來越多PCOS患者的選擇。

在中醫(yī)學(xué)中并無PCOS專篇記載。根據(jù)其癥狀,散見于“閉經(jīng)”“崩漏”“月經(jīng)先后無定期”“不孕”等疾病的描述中。中醫(yī)認為,女性生理節(jié)律由腎-天癸-沖任-胞宮軸所司職,而腎在其中起到了主導(dǎo)作用;同時,“女子以肝為先天”,肝藏血,女子經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)皆以血為用。且肝腎同屬下焦,腎精肝血互生互補,泉源不竭;肝主疏泄,腎主封藏,一藏一瀉,使子宮藏瀉有期,月經(jīng)按時來潮。而針對PCOS患者來說,腎虛是其基本病機,肝郁則是其重要的病機環(huán)節(jié)[3]。腎精虛衰,天癸乏源,肝氣郁結(jié),疏泄失常,而致氣血運行受阻,沖任胞脈空虛失養(yǎng),月事不節(jié)甚至閉經(jīng)。且現(xiàn)代研究表明,情志因素與PCOS發(fā)病關(guān)系密切,而情志不暢多由于肝氣郁結(jié)所致,所以郁被認為是引起及加重PCOS的重要因素之一[4]。導(dǎo)師劉雁峰教授常以補腎解郁調(diào)沖作為治療大法貫穿PCOS患者的治療過程中,取得了良好的效果。補腎解郁調(diào)沖大法中,丹參-郁金是發(fā)揮疏肝解郁、活血化瘀作用的核心藥對。丹參味苦,性微寒,具有活血通經(jīng)、解郁除煩的作用;郁金氣味苦辛,性寒,又入血氣,具有活血化瘀、解郁清心的功效。丹參-郁金具有多種活性成分,而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以篩選出藥物的核心化合物,進而預(yù)測藥物作用于疾病的靶點、參與的通路,更為具象地展現(xiàn)中藥“多成分-多靶點”的作用機制。本研究通過對丹參-郁金核心成分、作用于PCOS的靶點及相關(guān)通路的分析,以期探究其干預(yù)治療PCOS的作用機制,為進一步實驗研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 丹參-郁金活性成分和靶點篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中分別檢索丹參、郁金的化學(xué)成分,以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18的參數(shù)條件進行篩選,收集丹參、郁金的活性成分并將活性成分編號。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)獲得與藥物活性成分相關(guān)的靶點蛋白信息并將其轉(zhuǎn)化為靶點基因,篩選來自人類的靶點基因,最終獲得丹參-郁金藥物靶點基因庫。

1.2 PCOS疾病靶點的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)設(shè)置檢索詞為“polycystic ovary syndrome”,獲取PCOS相關(guān)的疾病靶點信息,選取相關(guān)度Score值≥中位數(shù)的靶點作為PCOS的疾病靶點。在人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)https://www.omin.org/)檢索同上關(guān)鍵詞,將獲取的靶點信息補充至GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取的疾病靶點中,excel去重后獲得最終PCOS疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 藥物-成分-共同靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用R語言將藥物靶點基因庫與PCOS疾病靶點數(shù)據(jù)庫取交集,繪制韋恩圖,得到丹參-郁金治療PCOS的潛在作用靶點,運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-成分-共同靶點圖,節(jié)點為成分和靶點,邊為節(jié)點間關(guān)系。邊表示成分與共同靶點的直接聯(lián)系,度值表示連接該節(jié)點的邊的條數(shù)。成分及靶點在圖上呈現(xiàn)的面積隨度值增加而增大,度值及面積越大表示該節(jié)點與其他節(jié)點的連接越廣泛,可能起到樞紐作用。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中上傳共同靶點,限定屬性為“Homo sapiens”,以置信度分數(shù)score≥0.400(中置信度)為條件進行篩選,隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)節(jié)點,得到共同靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,并在Cytoscape 3.7.2中進行可視化展示。節(jié)點度值越高,節(jié)點直徑越大、顏色越深;節(jié)點間的相互作用越強,邊越粗、顏色越深。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG富集分析 將共同靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能和KEGG通路富集分析。使用條形組合圖對GO功能富集結(jié)果進行可視化展示,使用氣泡圖對KEGG功能富集分析結(jié)果進行可視化展示。

1.6 分子對接驗證 分子對接前,使用Cytoscape中Network Analyze功能對藥物-成分-共同靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析,根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)各個節(jié)點的度值(Degree)、緊密度(Closeness)和介度(Betweenness)確定藥物的主要活性成分及核心靶點蛋白。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載主要化合物數(shù)據(jù)的mol2格式,通過Chem3D對所下載的化合物進行能量最小化,并轉(zhuǎn)化為pdb格式,將小分子化合物導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型,將所有柔性鍵默認可旋轉(zhuǎn),最后保存為pdbqt文件。從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫下載PDB格式文件,采用Pymol 2.3軟件刪除蛋白分子中的無關(guān)小分子后,將蛋白分子導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子、添加氫原子以及設(shè)置原子類型,最后保存為pdbqt文件,作為對接配體。以靶蛋白作為受體,以處理后的化合物作為小分子配體,根據(jù)小分子與靶點的作用位點確定的Grid Box的中心位置以及長寬高,最后通過AutoDock vina和python腳本進行批量對接,對分子對接結(jié)果進行分析,化合物與蛋白的結(jié)合作用可視化采用Pymol軟件。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載19個化合物數(shù)據(jù)的mol2格式,通過Chem3D對所下載的化合物進行能量最小化,并轉(zhuǎn)化為pdb格式,將小分子化合物導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型,將所有柔性鍵默認可旋轉(zhuǎn),最后保存為pdbqt文件。從PDB數(shù)據(jù)庫下載絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PDB ID:6SB0),絲裂原激活的蛋白激酶3(PDB ID:4QTB),絲裂原激活的蛋白激酶1(PDB ID:4QP2),白細胞介素6(PDB ID:2HMH),細胞腫瘤抗原P53(PDB ID:1JSP),血管內(nèi)皮生長因子A(PDB ID:4KZN)的晶體結(jié)構(gòu)PDB格式文件,采用Pymol 2.3軟件刪除蛋白分子中的無關(guān)小分子后,將蛋白分子導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子、添加氫原子以及設(shè)置原子類型,最后保存為pdbqt文件。將處理后的19個化合物作為小分子配體,5種蛋白靶點作為受體,根據(jù)小分子與靶點的作用位點確定的Grid Box的中心位置以及長寬高,最后通過AutoDock vina和python腳本進行批量對接,對分子對接結(jié)果進行分析,化合物與蛋白的結(jié)合作用可視化采用Pymol軟件。

2 結(jié)果

2.1 丹參-郁金活性成分和靶點 收集共收集到丹參、郁金的活性成分共80個,其中丹參活性成分為65個,郁金活性成分為15個。2種藥物各活性成分的作用靶點去重后共獲得157個藥物靶點,對已知作用靶點的活性成分以中藥名首字母進行編號(如丹參中已知作用靶點的活性成分命名為DS1、DS2等,郁金中已知作用靶點的活性成分命名為YJ1、YJ2等)。

2.2 PCOS疾病靶點的篩選 獲得靶點1 847個。

2.3 藥物-成分-共同靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 得到共同靶點93個,即丹參-郁金治療PCOS的潛在作用靶點。見圖1。共有220個節(jié)點、1 007條邊。見圖2?；钚猿煞志幪枮镈S9的luteolin Degree值為56,編號為DS57的tanshinone iia Degree值為41,編號為DS53的salviolone Degree值為38,編號為YJ1的beta-sitosterol Degree值為37,編號為YJ3的naringenin Degree值為37,位于前5位。見表1。

圖1 PCOS與丹參-郁金共同靶點韋恩圖

圖2 丹參-郁金治療PCOS的藥物-成分-共同靶點

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 共有92個節(jié)點,1 481條邊,節(jié)點度數(shù)平均為32.2。AKT1(75)、TP53(69)、IL6(67)、VEGFA(66)、MAPK3(65)、MAPK1(63)為度值最高的前6位,這些節(jié)點可能是丹參-郁金治療PCOS發(fā)揮作用的關(guān)鍵節(jié)點。見圖3。

圖3 92個共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 獲得生物過程(Biological Process,BP)分析199個條目,細胞組分(Cellular Component,CC)分析26個條目,分子功能(Molecular Function,MF)分析43個條目,KEGG通路121個條目。在BP分析中,主要參與的功能過程有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、DNA模版轉(zhuǎn)錄調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控、對γ輻射的反應(yīng)等;在CC分析中,主要包含胞質(zhì)、細胞核、細胞外間隙、質(zhì)膜外側(cè)、樹突軸、膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細胞質(zhì)核周區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、梭形小體10個條目;在MF分析中,主要參與的功能過程有蛋白質(zhì)同源二聚活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、類固醇結(jié)合、細胞因子活性、藥物結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、相同蛋白結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性,配體激活序列特異性DNA結(jié)合等。見圖4。前10個條目見圖5。經(jīng)分析,富集通路主要是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路(HIF-1信號通路、FoxO信號通路、PI3K-AKT信號通路、T細胞受體信號通路等)、疾病通路(癌癥信號通路、乙型肝炎、子宮內(nèi)膜癌等)等。大多數(shù)基因主要富集在癌癥信號通路、肝炎信號通路、PI3K/AKT信號通路。

圖4 GO功能富集分析各部分前10個條目

圖5 KEGG通路富集分析前20個條目

2.6 分子對接 分子對接前,根據(jù)拓撲學(xué)分析篩選出丹參-郁金的19種核心成分,分別是木犀草素、丹參酮、柚皮素、β谷甾醇、4-亞甲基米松、二氫氰酸鹽、異胰淀素、隱丹參酮、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、丹參新醌、丹參新酮、表丹參螺縮酮內(nèi)脂、異安息香酮Ⅱ、丹參螺內(nèi)酯等。根據(jù)拓撲學(xué)分析,PPI網(wǎng)絡(luò)中心度值(Degree)中位數(shù)2倍值為63、結(jié)構(gòu)中心性(Betweenness Centrality)中位數(shù)為0.003 403 625、接近中心性(Closeness Centrality)中位數(shù)為0.596 727 725,滿足上述參數(shù)值的靶點有AKT1(Degree=75)、TP53(Degree=69)、IL-6(Degree=67)、VEGFA(Degree=66)等6個靶點。見表2。

表2 核心靶點蛋白拓撲學(xué)參數(shù)信息

核心作用靶點與其親和力最強的化合物的分子對接結(jié)果見表3。丹參-郁金核心作用靶點蛋白與其親和力最強的化合物結(jié)合能均大于4.25 kcal/mol(1 cal=4.184 J)。

表3 丹參-郁金核心作用靶點蛋白與其親和力最強的化合物的分子對接

通結(jié)合性最強的是丹參螺旋縮酮內(nèi)酯與IL-6。二者結(jié)合能為-6.68 kcal/mol,潛在的結(jié)合位點包括PRO-115,SER-110,TYR-127,GLN-105等氨基酸殘基。丹參螺旋縮酮內(nèi)酯的羰基以及五元環(huán)上的氧均可以與氨基酸形成氫鍵,如羰基與TYR-127的酚羥基形成的氫鍵,距離為2.3 ?,五元環(huán)上的氧與SER-110形成氫鍵,距離均為2.7 ?。進一步分析發(fā)現(xiàn),部分氨基酸與化合物可形成弱氫鍵,如五元環(huán)上的氧與TYR-127殘基苯環(huán)上的質(zhì)子形成弱氫鍵,氫鍵距離為2.2 ?,殘基GLN-105的羰基與化合物苯環(huán)上面的質(zhì)子形成弱氫鍵,氫鍵距離為2.4 ?。見圖6。

圖6 核心作用靶蛋白與其親和力最強的化合物的分子結(jié)合模式

3 討論

3.1 核心成分 丹參-郁金藥對中含有的核心化合物主要為二萜類化合物、黃酮類化合物、內(nèi)酯類化合物、甾醇類化合物等。其中二萜類化合物以丹參酮類二萜為主,丹參酮Ⅰ及隱丹參酮對卵巢器官的生殖內(nèi)分泌有調(diào)節(jié)作用[5],能夠抑制人類肝臟中細胞色素P450酶系的活性[6],而PCOS患者常表現(xiàn)出P450芳香化酶功能異常;黃酮類化合物主要包括木犀草素及柚皮素,木犀草素可以通過抑制促炎性信號通路及依靠AMPK-SIRT1信號通路調(diào)節(jié)脂肪細胞對葡萄糖的利用改善胰島素抵抗[7-8],柚皮素可顯著提高PCOS大鼠體內(nèi)活性氧清除酶過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平,并可防止體質(zhì)量增加。柚皮素治療PCOS大鼠能顯著降低其血糖水平,使雌二醇和睪酮水平恢復(fù)正常,并維持卵巢的正常解剖結(jié)構(gòu)[9]。

3.2 核心靶點及信號通路 通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、MAPK3、MAPK1是丹參-郁金治療PCOS的核心蛋白。IL-6基因編碼一種細胞因子,在炎癥反應(yīng)和B細胞成熟過程中發(fā)揮作用。研究顯示IL-6基因啟動子區(qū)174G/C多態(tài)性、-124位啟動子區(qū)堿基多態(tài)性與IR有關(guān)[10]。在PCOS患者中,PCOS合并IR者血清白細胞介素-6水平明顯高于單純PCOS患者[11]。以上發(fā)現(xiàn)均提示白細胞介素-6與PCOS及胰島素抵抗發(fā)病機制密切相關(guān)。白細胞介素-6通路以抗炎/促炎為主要特征,由白細胞介素-6與白細胞介素-6R結(jié)合2個gp130分子啟動,啟動PI3K或MAPK信號通路[12]。隸屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族的促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)3、MAPK1參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、凋亡、生長因子等諸多生理活動,而MAPK通路對PI3K通路負反饋調(diào)節(jié)也會導(dǎo)致導(dǎo)致PCOS患者胰島素抵抗的形成,從而加重PCOS患者病情[13]。

PI3K/AKT信號通路主要為被PI3K激活的AKT通過磷酸化作用于下游蛋白,調(diào)節(jié)細胞生長、增殖活動[14]。其磷酸化異?？赡苁窃斐蒔COS患者胰島素抵抗、高雄激素血癥的重要原因。有研究顯示,敲除AKT1基因的小鼠會出現(xiàn)高胰島素血癥[15];PI3K的P85α亞單位的met326多態(tài)性被認為可以調(diào)節(jié)PCOS患者血清17-OHP或游離睪酮的濃度[16]。除此之外,PCOS患者子宮內(nèi)膜增生被認為與細胞增殖失調(diào)與凋亡減少有關(guān),而雌激素介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路可能在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用[17]。PCOS患者子宮內(nèi)膜中觀察到生存蛋白蛋白激酶B和Ras蛋白以及細胞周期調(diào)節(jié)因子P27和周期蛋白依賴激酶2的表達增加[18]。叉頭框O(Forkhead Box O,FOXO)轉(zhuǎn)錄因子是PI3K/AKT信號通路的下游因子之一,PI3K/AKT/FOXO信號通路是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要途徑。哺乳動物中的FOXO家族有4位成員:FOXO1、F0XO3a、F0XO4和F0XO6。F0XO3a是PI3K/AKT信號通路對生長因子等細胞內(nèi)刺激信號反應(yīng)的下游靶點,在卵泡顆粒細胞的增殖和分化中起到重要作用。有研究證實,在豬卵巢早期閉鎖的卵泡顆粒細胞表面,F0XO3a蛋白呈強陽性表達,與細胞凋亡相一致,推測可能由于F0XO3a的過表達,導(dǎo)致了某些凋亡因子上調(diào),最終導(dǎo)致卵泡閉鎖[19]。

缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible Factor，HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物的一種轉(zhuǎn)錄因子,其α亞基決定了生理學(xué)功能。研究表明,血管內(nèi)皮生長因子是HIF-1α主要的下游靶基因,一些研究評估了不同人群中PCOS患者的血管內(nèi)皮生長因子基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮生長因子基因+405G/C多態(tài)性、-583T>C和-634G/C多態(tài)性都與PCOS發(fā)病及疾病進展密切相關(guān)[20-21]。HIF-1α被激活能夠引起血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)錄、表達增強,促進血管生成[22]。卵巢內(nèi)異常血管生成會改變卵巢血流,并進一步影響卵泡發(fā)育,而PCOS患者卵巢中存在血管生成異常[23],可能是造成稀發(fā)排卵的原因之一。血管內(nèi)皮生長因子作為PCOS患者卵巢中最能描述血管生成改變的因子,其表達增強所致的異常血管生成很可能是由于HIF-1通路異常引起的。

由此可見,HIF-1信號通路、FoxO信號通路、PI3K/AKT信號通路等在PCOS的發(fā)病、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,同時有證據(jù)證實丹參-郁金藥對中有效成分可以通過以上通路干預(yù)病情進展、起到治療作用。在PCOS小鼠模型的卵巢組織中發(fā)現(xiàn),隱丹參酮可以調(diào)節(jié)受損的PI3K/AKT信號通路功能,從而達到改善糖代謝的作用[24]。有研究證實丹酚酸B對HIF-1α具有抑制作用,故丹酚酸B可能通過抑制HIF-1α以及血管內(nèi)皮生長因子拮抗異常血管生成,從而減緩PCOS的病情發(fā)展[25]。

綜上所述,丹參-郁金可通過“多成分-多靶點-多途徑”治療PCOS,從改善糖代謝、拮抗異常血管生成、調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌軸等方面發(fā)揮作用。后續(xù)可根據(jù)預(yù)測所得主要活性成分、作用靶點、信號通路進行實驗驗證,為中藥治療PCOS提供依據(jù)。