李 瑩 郭經(jīng)奇 趙立群

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南,250014; 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,濟(jì)南,250014)

心絞痛是心血管內(nèi)科常見(jiàn)病變,多發(fā)生于中老年人,主要由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,致使血管管腔狹窄、堵塞，或者勞動(dòng)、情緒激動(dòng)、寒冷刺激等引起冠狀動(dòng)脈痙攣,導(dǎo)致心肌急性、暫時(shí)性缺血缺氧,以發(fā)作性心前區(qū)疼痛或胸部不適為典型臨床表現(xiàn)[1-2]。中醫(yī)將其歸為胸痹心痛范疇,其主要病機(jī)為氣滯、血瘀。中醫(yī)運(yùn)用辨證論治和整體觀念,對(duì)于心絞痛的治療有著明顯優(yōu)勢(shì)。丹參飲由丹參、檀香、砂仁三味中草藥組成,首見(jiàn)于《時(shí)方歌括》卷下,其上記載丹參飲具有治療心痛、胃脘痛的功效[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,丹參飲對(duì)于治療心絞痛等心血管疾病有明確療效,其可通過(guò)降低血脂水平、影響細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因表達(dá)以及抑制血小板聚集等以改善微循環(huán)、治療心肌缺血[4-8]。

較西藥治療而言,中藥復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),在心絞痛的治療上有一定的優(yōu)勢(shì),但中藥復(fù)方制劑的實(shí)驗(yàn)研究多來(lái)自于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),其作用于人體的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制尚不完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過(guò)多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,通過(guò)建立可視化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,對(duì)藥物活性成分、作用靶點(diǎn)以及疾病的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)其作用機(jī)制,以填補(bǔ)現(xiàn)代藥理學(xué)研究的不足之處[9]。因此,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建丹參飲成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,以探究其物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制為中醫(yī)藥的發(fā)展、臨床應(yīng)用及藥理學(xué)研究提供新的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 丹參飲活性成分的收集篩選 通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)以得到丹參飲中丹參、檀香、砂仁的所有活性成分,將口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)設(shè)為>30%,類藥性(Drug Likeness,DL)設(shè)為>0.18以篩選及統(tǒng)計(jì)出丹參飲的主要活性成分。

1.2 丹參飲主要靶點(diǎn)的篩選 再次應(yīng)用TCMSP檢索丹參飲的相關(guān)作用靶點(diǎn),并通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.uniprot org/)對(duì)其作用靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,得到其官方名稱(Official Symbol),并建立數(shù)據(jù)集。

1.3 心絞痛的靶點(diǎn)篩選 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)以“Angina Pectoris”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,得到心絞痛的疾病相關(guān)靶點(diǎn),再將結(jié)果導(dǎo)入到Excel表格中進(jìn)行整理篩選。

1.4 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的建立 為將丹參飲對(duì)心絞痛疾病的作用機(jī)制闡述地更加明確、具體,把得到的丹參飲的相關(guān)靶點(diǎn)與心絞痛的疾病靶點(diǎn)取交集,并利用R 3.6.2軟件繪制韋恩圖。將韋恩圖中所示的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,獲得成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的建立 將取得的交集靶點(diǎn)輸入用于揭示蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)PPI的STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)[10],物種設(shè)定為“Homo Sapiens”,隱藏在網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的斷開(kāi)的節(jié)點(diǎn),將最低互作分?jǐn)?shù)設(shè)為0.4,構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白可視化互作網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出。

1.6 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 通過(guò)Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.bioconductor.org/)及R軟件將篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)化為基因ID,進(jìn)行GO功能分析及KEGG通路富集分析,以明確丹參飲治療心絞痛的生物過(guò)程及信號(hào)通路,并繪制通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 丹參飲中藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 檢索出丹參飲的所有化學(xué)成分,包括丹參202個(gè),檀香70個(gè),砂仁165個(gè),再根據(jù)OB>30%,DL>0.18,共篩選出丹參飲中藥物的活性成分78個(gè),其中丹參65個(gè),檀香3個(gè),砂仁10個(gè)。

2.2 藥物-疾病有效成分靶點(diǎn)篩選結(jié)果 得到有效成分靶點(diǎn)120個(gè)。得到心絞痛的疾病靶點(diǎn)2 578個(gè),利用R X64 3.6.2軟件將其與藥物的靶點(diǎn)取交集,建立藥物-疾病數(shù)據(jù)集。見(jiàn)表2。得到共同靶點(diǎn)基因93個(gè),相對(duì)應(yīng)的活性成分59個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖(藥物與疾病有93個(gè)共同靶點(diǎn))

表1 藥物-疾病有效靶點(diǎn)

2.3 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)由154個(gè)節(jié)點(diǎn),682條邊組成。見(jiàn)圖2。

圖2 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 93個(gè)有效靶點(diǎn)可視化PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。其中篩選出鏈接節(jié)點(diǎn)最多的20個(gè)靶點(diǎn)基因。見(jiàn)圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中20個(gè)核心基因

2.5 GO功能分析及KEGG分析結(jié)果 得到主要GO條目20個(gè)。見(jiàn)圖5。根據(jù)分析結(jié)果可知,丹參飲對(duì)心絞痛疾病的有效靶點(diǎn)基因主要涉及腎上腺素能受體活性(Adrenergic Receptor Activity)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G Protein-Coupled Amine Receptor Activity)、泛素-蛋白連接酶結(jié)合(Ubiquitin-Protein Ligase Binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(Cytokine Receptor Binding)、核受體活性(Nuclear Receptor Activity)等功能起作用。

圖5 GO功能分析條目

KEGG通路富集結(jié)果顯示147條通路,主要包括前列腺癌(Prostate Cancer)、內(nèi)分泌抵抗(Endocrine Resistance)、乙型肝炎(Hepatitis B)、膀胱癌(Bladder Cancer)等疾病通路,以及IL-17信號(hào)通路(IL-17 Signaling Pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 Signaling Pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF Signaling Pathway)等主要通路。見(jiàn)圖6～7。

圖6 KEGG主要通路氣泡圖

圖7 KEGG通路示意圖

3 討論

心絞痛疾病隨著老齡化社會(huì)的加重,發(fā)病率逐年增長(zhǎng),其發(fā)病原因復(fù)雜,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究丹參飲治療心絞痛的作用機(jī)制,區(qū)別于單純的西藥治療的單一分子、單一通路模式,建立活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖,體現(xiàn)中藥復(fù)方制劑治療疾病多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)TCMSP篩選出丹參飲中有效成分59個(gè),作用于心絞痛疾病的有效靶點(diǎn)93個(gè)。其中作用靶點(diǎn)較多的3個(gè)活性成分分別是木犀草素(Luteolin)、丹參酮Iia(Tanshinone Iia)、豆甾醇(Stigmasterol)。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究表明木犀草素可通過(guò)提高分解脂質(zhì)酶的活性以顯著降低大鼠的血脂水平[11],還可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)IL-1β,IL-2等細(xì)胞因子,抑制炎癥反應(yīng),改變部分信號(hào)通路、減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生等發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用[12]。丹參酮ⅡA具有抗心肌缺血、減輕動(dòng)脈粥樣硬化以及舒張血管的作用,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可抑制新西蘭白兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并增加其穩(wěn)定性以防破裂[13-15]。豆甾醇具有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)及降低膽固醇的作用,能有效地降低人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收[16-19]。

本研究通過(guò)活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖、韋恩圖以及PPI網(wǎng)絡(luò)圖得到丹參飲治療心絞痛疾病的主要靶點(diǎn)93個(gè),AKT1、IL6、FOS、VEGFA、CASP3為其中重要的5個(gè)靶點(diǎn)蛋白。王靜等[20]通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn),采用TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AKT1基因會(huì)抑制心肌細(xì)胞的凋亡,其保護(hù)心肌細(xì)胞的機(jī)制可能與抑制Cyt-C的釋放,保護(hù)心肌線粒體有關(guān)。IL6作為一種炎癥介質(zhì)可能通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)的沉積、血栓的形成、血管平滑肌的增生、血管內(nèi)皮的損傷等多種途徑參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成與進(jìn)展[21]。FOS除了與癌癥相關(guān),還參與了心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展,楊潔等[22]研究發(fā)現(xiàn),miR-29c過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞的增值和抑制心肌纖維化,而FOS的過(guò)表達(dá)則會(huì)逆轉(zhuǎn)此作用,因此FOS與心肌細(xì)胞的凋亡與心肌纖維化密切相關(guān)。VEGFA能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,可能促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)的形成,李瑩鴻等[23]通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn),通陽(yáng)寬胸顆粒能改善穩(wěn)定型心絞痛患者癥狀,且使VEGFA表達(dá)水平升高。既往研究表明冠心病心絞痛患者胱天蛋白酶-3的表達(dá)顯著提高,徐興偉等[24]證實(shí),姜黃素膠囊對(duì)心絞痛有較好療效,且能明顯降低血清中胱天蛋白酶-3的表達(dá)。綜上看來(lái),丹參飲通過(guò)影響多種蛋白的表達(dá)來(lái)治療心絞痛。

通過(guò)GO功能分析表明,丹參飲的主要藥物丹參、檀香、砂仁作用于疾病心絞痛的靶點(diǎn)主要參與腎上腺素能受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、泛樣-蛋白連接酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、酰胺結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等生物過(guò)程起作用。

KEGG富集分析主要涉及前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、乙型肝炎等疾病通路,IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。白細(xì)胞介素-17是一個(gè)重要的促炎癥介質(zhì),主要由Th17分泌,IL-17信號(hào)通路既可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞的聚集,又能通過(guò)TRAF6激活下游核因子κB通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)[25]。王俊巖等[26]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈組織中HIF-1αmRNA表達(dá)水平顯著提高,因此抑制HIF-1信號(hào)通路的激活能有消抗動(dòng)脈粥樣硬化。TNF信號(hào)通路的激活,也能激活下游核因子κB通路,促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的釋放,從而加快動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[27]。分析看出,丹參飲可能通過(guò)多種疾病通路、信號(hào)通路治療心絞痛。

綜上所述,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種新思路、新方法探究發(fā)現(xiàn),丹參飲通過(guò)多種靶點(diǎn)、多種生物過(guò)程和通路治療心絞痛,可能包括抗炎、抗氧化、改善內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管生成等作用,但仍有部分結(jié)果需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究,為臨床診療提供理論依據(jù)[28]。