李 昕 蒙秀東 史麗萍

(天津中醫(yī)藥大學,天津,301617)

冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)是由于冠狀動脈粥樣樣硬化使管腔狹窄或阻塞,導致心肌缺血,缺氧或壞死而引發(fā)的心臟疾病[1],世界衛(wèi)生組織將其分為隱匿型冠心病、心絞痛、心肌梗死、慢性心肌病和猝死5種臨床類型。據(jù)報告,2017年全球CHD患病人數(shù)估計為1.1億,因CHD病死人數(shù)估計為892萬,是全球第一位的死亡原因,在我國,心血管病患病率及病死率仍處于上升階段,據(jù)推算2018年CHD患病人數(shù)為1 100萬,而心血管死亡率居首位,高于腫瘤及其他疾病,占居民死亡構成的40%以上[2],中國心血管病負擔日漸加重,已成為了重大的公共衛(wèi)生問題。

CHD在中醫(yī)屬于“胸痹,心痛”的范疇,其病理過程從動脈粥樣硬化和血脂升高到心肌缺血和血液流變學改變可以看為由“痰”至“瘀(毒)”的過程,目前對于CHD的中藥治療也以豁痰去瘀為主?！督饏T要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》提出“陽微陰弦”為胸痹的基本病機,書中列出治療方前3位:瓜蔞薤白白酒湯、瓜蔞薤白半夏湯和枳實薤白桂枝湯分別用于治療胸痹主證、重證和實證,三方中均含有“瓜蔞-薤白”藥對,有研究發(fā)現(xiàn)瓜蔞、薤白合用對于清除氧自由基、減輕氧化反應而抑制P38、Jun激酶、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白磷酸化以減輕缺血損傷以保護心肌,降低紅細胞壓積、血液黏度和抑制血小板聚集以及降低血脂具有明顯作用[3-5],但仍缺乏藥物治療CHD特征起效成分及治療靶點研究,本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法,對瓜蔞-薤白治療CHD的潛在起效成分、作用靶點及通路進行探索。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論,配合計算機技術進步的基礎提出的新策略,以“疾病-表型-基因-藥物”多層次網(wǎng)絡系統(tǒng)地闡釋復雜的藥物協(xié)同作用于人體的機制,其在整體條件下開展研究,重視機體及網(wǎng)絡系統(tǒng)的整體反應與中醫(yī)整體觀念不謀而合。因此,本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法,對瓜蔞—薤白治療冠心病的機制進行探索,為進一步的研究提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 “瓜蔞-薤白”藥對活性成分及作用靶點的篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP.https://tcmspw.com/tcmsp.php)和中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)對瓜蔞-薤白藥對的活性成分及作用靶點進行篩選[6-7],將“Herb name”設置為檢索類別,關鍵詞為“GuaLou”和“XieBai”,將口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18作為條件對活性成分進行篩選。然后對滿足條件的活性成分在線獲取其作用靶點。

1.2 冠心病相關靶點的篩選 使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)在線獲取冠心病相關靶點,檢索詞為“Coronary Heart Disease”,將滿足條件的蛋白名以及1.1獲得的藥物活性成分的作用靶點使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對靶點名稱進行標準化處理。

1.3 藥物-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡的構建 將1.1得到的藥物、活性成分和作用靶點三者之間的關系利用Cytoscape 3.8.0軟件[8]繪制成“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡圖。

1.4 交集基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡的構建 將1.1得到的瓜蔞-薤白作用靶點與1.2得到的CHD相關靶點映射,其中交集部分視為瓜蔞-薤白治療冠心病的潛在作用靶點,并使用在線繪畫工具繪制韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。將瓜蔞-薤白與冠心病的交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)在線構建PPI并把網(wǎng)絡圖導入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡圖的繪制[9]。將瓜蔞-薤白治療冠心病潛在的116個靶點導入搜索鄰近基因的重復實例的工具(Search Tool for Recurring Instances of Neighbouring Genes，STRING)數(shù)據(jù)庫,在線獲取PPI網(wǎng)絡圖,將PPI網(wǎng)絡圖導出至Cytoscape 3.8.0軟件的Tools-Analyze network進行網(wǎng)絡拓撲分析。

1.5 交集基因的富集分析 利用Cytoscape的插件ClueGO[10]對交集靶點進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析及可視化處理,將瓜蔞-薤白治療冠心病的潛在靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行在線GO富集分析和KEGG富集分析,將GO和KEGG富集分析結(jié)果以P值從小到大作為排序依據(jù)使用R語言ggplot2進行繪圖分析,其中GO富集分析結(jié)果包括生物過程(Biological Process,BP)、細胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)。使用Cytoscape插件ClueGO對潛在作用靶點在GO和KEGG通路中的相互作用進行網(wǎng)絡拓撲分析及可視化處理,將Clue GO插件中參數(shù)設置為Kappa Score和P-value分別設置為0.6和0.000 1,物種設置為Homo Sapiens。

1.6 活性成分-靶點-關鍵通路網(wǎng)絡構建 使用Cytoscape軟件將1.5得到的分數(shù)較高的KEGG通路和1.1收集到的藥物活性成分及藥物-疾病共有作用靶點繪制成“活性成分-作用靶點-KEGG通路”網(wǎng)絡圖。以P值作為排序依據(jù)對潛在作用靶點的KEGG通路進行排名,將P值最低的前20條KEGG通路作為瓜蔞-薤白治療冠心病的核心通路,再將20條KEGG通路及其靶點與之前的藥物-活性成分網(wǎng)絡匯合,得到以下活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖,使用Cytoscape的Tools-Analyze network工具對網(wǎng)絡進行拓撲分析。

1.7 分子對接驗證核心活性成分和作用靶點 將“活性成分-作用靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡中度值較大的活性化合物及作用靶點作為受體和配體進行分子對接驗證。其中配體的三維結(jié)構來自PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),核心靶點的三維結(jié)構來自PDB數(shù)據(jù)庫(http://www1.rcsb.org/)[11],然后運用AutoDock Vina進行分子對接,對接活性口袋包含該靶點所有分子,對接結(jié)果以最小結(jié)合能視為最可能的作用位點,最后用PyMol對分子對接結(jié)果進行可視化處理。利用Autodock對活性成分-網(wǎng)絡-KEGG通路網(wǎng)絡中度值最高的5中活性成分(Quercetin、Beta-sitosterol、Naringenin、Hydroxygenkwanin、Hesperetin)與6個核心作用靶點(PIK3CG、MAPK3、PTGS2、MAPK3、TNF、AKT1)進行分子對接,其中活性成分為配體,作用靶點為受體。對接時選擇結(jié)合能最低的作為配體與受體結(jié)合最穩(wěn)定的參考依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞-薤白藥對活性成分及靶點 篩選出符合條件的活性成分瓜蔞11種,薤白11種,共計22種活性成分,2種藥物無重復活性成分,具體活性成分名稱及參數(shù)見表1。剔除重復部分共得到201個作用靶點,藥物-活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡圖見圖1。

表1 藥物活性成分帶代謝參數(shù)

續(xù)表1 藥物活性成分帶代謝參數(shù)

圖1 “瓜蔞-薤白”活性成分-作用靶點網(wǎng)絡

2.2 瓜蔞-薤白治療冠心病的潛在靶點 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得CHD相關靶點2 182個,其中與瓜蔞-薤白藥對作用靶點交集的靶點有116個,交集的116個是瓜蔞-薤白治療冠心病的潛在作用靶點。

圖2 “瓜蔞-薤白”靶點與冠心病靶點韋恩圖

2.3 潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡構建 由116個點構成的網(wǎng)絡中,共計3 842條邊,網(wǎng)絡中度(Degree)平均值為66.24,Closeness Centrality為0.573 6,Betweenness Centrality為0.006 825,Average Shortest Path Length為1.778,在核心靶點網(wǎng)絡中,度平均值為128.15,Closeness Centrality為0.693 07,Betweenness Centrality為0.019 22,Average Shortest Path Length為1.448 5,核心網(wǎng)絡中,以TNF、AKT1、MAPK3、IL6、TP53、VEGFA、EGFA為度值最高的靶點。見圖3。

圖3 “瓜蔞-薤白”與冠心病共有靶點PPI網(wǎng)絡

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析 GO富集分析CC、MF、BP和KEGG通路4者P值最低的前20位結(jié)果見圖4。CC以細胞外空間(Extracellular space)、膜小凹(Caveola)和細胞外區(qū)域(Extracellular region)為主,MF以酶結(jié)合(Enzyme binding)、類固醇激素受體活性(Steroid hormone receptor activity)和蛋白同二聚體活性(Protein homodimerization activity)為主,BP以對缺氧的反應(Response to hypoxia)、對藥物的反應(Response to drug)、聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter RNA)和衰老(Aging)為主,KEGG通路以缺氧誘導因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)和癌癥通路(Pathways in cancer)為主。

圖4 “瓜蔞-薤白”與CHD共有活性成分GO及KEGG富集分析結(jié)果氣泡圖

在CC方面,與管徑調(diào)節(jié)(Regulation of tube diameter 8.42%)、活性氧生物合成過程(Reactive oxygen species biosynthetic process 8.42%)和調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖(Regulation of smooth muscle cell proliferation 6.32%)等相關;在MF方面,與氧化還原酶活性,作用于成對的供體上,并結(jié)合或還原分子氧(Oxidoreductase acticity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen 17.33%)、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程(Cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process 14.67%)和蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)(Regulation of protein serine/threonine kinase activity 13.33%)相關;在BP方面,與miRNA對基因沉默的負調(diào)控(Negative regulation of gene silencing by miRNA12.73%)、脂質(zhì)定位的負調(diào)控(Negative regulation of lipid localization 9.09%)和巨噬細胞衍生的泡沫細胞分化(Macrophage derived foam cell differentiation 7.27%)等相關;在KEGG信號通路方面,與糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication 55.56%)、乙型肝炎(Hepatitis B 9.4%)和肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma 8.55%)等相關。見圖5。

圖5 “瓜蔞-薤白”與CHD共有活性成分GO及KEGG網(wǎng)絡及餅狀圖

2.5 活性成分-靶點-關鍵通路網(wǎng)絡 網(wǎng)絡中度值最高的靶點是PIK3CG、MAPK1、PTGS2、MAPK3、TNF、AKT1等,度值最高的活性成分有薤白中的槲皮素Quercetin、柚皮素Naringenin、β-谷甾醇Beta-sitosterol、及瓜蔞中的羥基蕪花素Hydroxygenkwanin、香葉木素Diosmetin。見圖6。

圖6 活性成分-作用靶點-核心通路網(wǎng)絡

2.6 分子對接分析 結(jié)果表明5個活性成分與6個核心靶點結(jié)合能均<-6 kcal/mol(1 cal=4.184 J)。見表2。選取部分活性成分與作用靶點的最低結(jié)合能結(jié)合狀態(tài)進行展示。見圖7。

表2 核心活性成分與核心作用靶點結(jié)合能(kcal/mol)

圖7 瓜蔞-薤白核心活性成分與CHD關鍵靶點的部分分子對接示意圖

3 討論

冠心病是最常見的心血管疾病之一,屬于中醫(yī)“胸痹、心痛”的范疇,《金匱要略》提出胸痹的基本病機是“陽微陰弦”,現(xiàn)代研究也證實“胸陽不宣”作為胸痹的基本病機貫穿疾病的整個病程之中,而瓜蔞-薤白辛溫通陽,為治療胸痹心痛常用方的核心藥組[12],臨床驗之有效?，F(xiàn)代藥理學表明:瓜蔞主要化學成分為脂肪酸、甾醇、三萜及其苷類等,具有保護心肌、改善心肌缺血[13],抗血栓形成,抗心肌纖維化,抗氧化、抗炎、抑制同型半胱氨酸誘導的動脈粥樣硬化和免疫調(diào)節(jié)作用[14-17];薤白主要化學成分為主要化學成分包括甾體皂苷類化合物、含硫化合物、含氮化合物、脂肪酸類化合物、聚酰胺類化合物等,具有降血脂,抗動脈粥樣硬化,抑制腫瘤,消炎,抗氧化和抑菌等多種藥理作用[18-19]。但由于中藥具有多成分多靶點的藥理作用特點,且瓜蔞-薤白治療冠心病的具體作用機制仍不明確,本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術對其進行探討。

本研究初步篩選出22種活性成分和201個作用靶點,其中槲皮素(Quercetin)在網(wǎng)絡中度值最高,屬于黃酮類的化合物,有研究表明槲皮素可以通過抑制基質(zhì)細胞源性因子-1與C-X-C趨化因子受體4的表達途徑抑制載脂蛋白E-/-小鼠動脈粥樣硬化形成[20]、減輕氧化應激損傷保護同型半胱氨酸誘導的心細胞凋亡[21]、抑制活性氧介導的MAPK信號通路抗心肌纖維化,具有心血管保護作用[22]。脂代謝異常、氧化反應和炎癥反應貫穿冠心病的全過程。柚皮素(Naringenin)屬于類黃酮多酚,在血脂異常,胰島素抵抗,肝脂肪變性,肥胖和動脈粥樣硬化的治療中具有重要作用[23-24],也可以作為脂蛋白代謝和動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)劑。動物研究表明柚皮素可有效抑制代謝綜合征小鼠模型中培養(yǎng)的肝細胞中載脂蛋白B100脂蛋白的組裝和分泌,并改善血脂異常和胰島素抵抗,降低動脈粥樣硬化進展[23]。β-谷甾醇(Beta-sitosterol)屬于萜類化合物,具有抗氧化、血管生成、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物作用[24-25]，可以通過將刺激肝臟脂肪酸氧化以減少血漿中膽固醇的含量，從而阻止膽固醇的吸收，被推薦用于預防不同心血管疾病及高脂血癥。。羥基蕪花素(Hydroxygenkwanin)屬于天然類黃酮,具有抗癌作用[26],用于治療水腫,腹水,咳嗽,哮喘和癌癥,研究發(fā)現(xiàn)羥基蕪花素與炎癥及2型糖尿病相關,通過磷酸化并誘導腫瘤壞死因子受體相關因子2蛋白降解,從而引起T細胞中白細胞介素-6產(chǎn)生負反饋,2型糖尿病患者的T細胞中HGK(組氨酸-甘氨酸-賴氨酸)水平下降而白細胞介素-6水平上升[27]。香葉木素(Diosmetin)的藥理作用也體現(xiàn)在抗癌、抗菌、抗氧化和抗炎等方面[28]。

在瓜蔞-薤白藥對治療CHD的PPI網(wǎng)絡中有116個節(jié)點和3 842條邊,網(wǎng)絡中TNF、AKT1、MAPK3、IL6和TP53等靶點處于重要地位,可能是瓜蔞-薤白治療CHD的潛在作用靶點。AKT家族是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在調(diào)節(jié)生長、增殖、代謝等其他細胞活動中起關鍵作用,AKT1是唯一在心臟和大腦中都富集的AKT亞型,在心臟中,IGF-1/AKT軸參與控制心肌細胞大小,收縮功能和Ca2+研究發(fā)現(xiàn)AKT1可能通過上調(diào)受磷蛋白磷酸化改善心臟收縮[29-30],AKT激活還增加Thr17位點的PLN磷酸化,在介導正性肌力中起作用[31];此外,內(nèi)皮細胞中的AKT信號轉(zhuǎn)導在調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)和血管生成中也發(fā)揮著重要作用[32]。GO富集分析結(jié)果顯示,瓜蔞-薤白治療CHD的生物學過程主要集中在與miRNA對基因沉默的負調(diào)控(12.73%)、脂質(zhì)定位的負調(diào)控(9.09%)和巨噬細胞衍生的泡沫細胞分化(7.27%)等相關。

KEGG通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn),瓜蔞-薤白可能通過調(diào)節(jié)TNF信號通路、HIF-1信號通路來改善冠心病,對KEGG進行富集分析則顯示作用靶點中占比55.56%的部分與AGE-RAGE信號存在聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn),晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路通過影響動脈硬度、動脈粥樣硬化、線粒體功能、氧化應激、鈣穩(wěn)態(tài)和細胞骨架功能來調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)病機制。晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體相關的氧化穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能增強人體對氧化、炎癥組織損傷的敏感性,增加了活性氧和炎癥介質(zhì)的生成,從而引起氧化應激,長期可能出現(xiàn)心血管和代謝改變[33]。此外晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體軸還參與高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、心房顫動的發(fā)病,以及激活了核因子κB引發(fā)主動脈瘤等與冠心病諸多高危因素密切相關[34-36]。晚期糖基化終末產(chǎn)物與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體之間的相互作用可以增加氧自由基和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生從而參與心臟代謝疾病,瓜蔞-薤白治療冠心病可能與抗氧化和抗炎相關。為了進一步驗證活性成分-作用靶點-KEGG通路網(wǎng)絡結(jié)果的可靠性,我們利用分子對接驗證了活性成分與作用靶點結(jié)合能,結(jié)果表明5個關鍵活性成分與關鍵靶點PIK3CG、MAPK1、PTGS2、MAPK3、TNF和AKT1之間結(jié)合能均小于-6 kcal/mol,表明他們之間具有較好的結(jié)合活性。其中β-谷甾醇與PIK3CG,槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、羥基蕪花素與PTGS2結(jié)合能均低于-9 kcal/mol,表明這部分活性成分與其對應靶點具有強的結(jié)合活性。

本研究以《金匱要略》治療胸痹的經(jīng)典名方中共有藥味“瓜蔞-薤白”為研究對象,通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法,發(fā)現(xiàn)瓜蔞-薤白可以影響心血管活性氧代謝過程、炎癥反應等過程,其作用機制可能與AGE/RAGE、HIF-1、TNF信號通路等通路有關,且發(fā)現(xiàn)槲皮素、β-谷甾醇、香葉木素、柚皮素、羥基蕪花素活性成分作用于PIK3CG、MAPK1、PTGS2、MAPK3、TNF和AKT1等關鍵靶點。體現(xiàn)了中醫(yī)的多成分、多靶點、多途徑的特點,為后續(xù)深入研究“瓜蔞-薤白”治療CHD奠定了基礎。