王榆薇，黃河儒，王寬誠(chéng)，朱邑辰，吳昕橙，陳淑貞，張芳芳

（杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310013）

香榧（Torreya grandis）是紅豆杉科榧樹(shù)屬下的一個(gè)種，別名野榧、羊角榧、榧子，為中國(guó)原產(chǎn)常綠針葉喬木，主要生長(zhǎng)在中國(guó)南方的濕潤(rùn)多雨地區(qū)，目前主要分布于浙江、福建、江蘇、江西、安徽和湖南等地[1-3]。香榧精油提取于香榧子中的假種皮，含有木質(zhì)素、單寧和紫杉醇等物質(zhì)，有體外抑菌、抗氧化、殺蟲(chóng)和趨避等活性[4-5]。假種皮是香榧加工的副產(chǎn)物，占實(shí)際果實(shí)質(zhì)量的1/2以上[6]。有研究結(jié)果表明，在常用的15種植物精油中，有11種含有致敏成分，檢出率為73.3%[7]。相對(duì)于其他木本精油，香榧精油通常被認(rèn)為是功效最多、用途最廣的精油[8-9]，然而其安全性評(píng)價(jià)資料尚不完善，因此，有必要對(duì)其可能存在的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）香榧精油：純度99.0%，淡黃色液體，假種皮蒸餾，香榧種皮源于浙江省龍泉市龍南鄉(xiāng)興川村野生香榧[10]。

（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭家兔8只（雌性），體重2.0～2.5 kg，由杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)專業(yè)合作社提供；豚鼠42只（雄性），體重250～300 g，由無(wú)錫恒泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供。

（3）動(dòng)物飼料由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

（4）飼養(yǎng)環(huán)境：家兔每籠1只，豚鼠每籠10只（每籠同性別、同劑量組），食、水自由攝取，溫度為20～26 ℃，相對(duì)濕度為40.0%～70.0%，人工光照，12 h光照和12 h無(wú)光照交替，每小時(shí)更新室內(nèi)空氣12次。

1.2 方法

1.2.1 家兔急性皮膚刺激試驗(yàn)

試驗(yàn)前24 h，將家兔脊柱兩側(cè)剃毛3.0 cm×3.0 cm，涂抹面積2.5 cm×2.5 cm，以自身對(duì)側(cè)皮膚為對(duì)照。用4只家兔進(jìn)行皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)，將0.5 mL受檢樣品均勻涂敷在皮膚上，用兩層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布加以固定，4 h后用溫水洗去，觀察皮膚的刺激反應(yīng)。于清除受檢樣品后的1、24、48、72 h觀察皮膚反應(yīng)，直到恢復(fù)為止，觀察期不超過(guò)14天。觀察并記錄皮膚刺激反應(yīng)的紅斑、水腫等癥狀，每天觀察1次。根據(jù)2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章“4 皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)”中的“表1皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分”評(píng)分，按計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分。

1.2.2 家兔急性眼刺激試驗(yàn)

用4只家兔進(jìn)行試驗(yàn)，輕輕拉開(kāi)一側(cè)眼睛下眼瞼，將0.1 mL受試物滴入結(jié)膜囊中，使上、下眼瞼被動(dòng)閉合1 s，防止受試物丟失，另一側(cè)眼睛不處理，作為自身對(duì)照。滴入受試物后24 h內(nèi)不沖洗眼睛。在滴入受試物后1、24、48、72 h以及第4天和第7天對(duì)動(dòng)物眼睛進(jìn)行檢查，如果72 h未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，即可終止試驗(yàn)。除了對(duì)角膜、虹膜、結(jié)膜進(jìn)行觀察外，其他損害效應(yīng)均應(yīng)記錄報(bào)告。每次檢查均按2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章“5 急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)”的“表1 眼損害的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)”記錄眼刺激反應(yīng)的積分，按“表3 產(chǎn)品眼刺激性反應(yīng)分級(jí)”判定受試物對(duì)眼的刺激強(qiáng)度。

1.2.3 豚鼠致敏試驗(yàn)

按2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章“6 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)”的局部封閉涂皮法（Buehler Test，BT），將豚鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，試驗(yàn)組動(dòng)物20只，陰性對(duì)照組動(dòng)物10只，陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物10只。另選用2只豚鼠做預(yù)試驗(yàn)。豚鼠背部各去4塊毛，將原液、1∶1稀釋液、1∶2稀釋液分別涂敷于去毛區(qū)，另一塊作為空白對(duì)照，于6 h后去除，根據(jù)1 h、24 h觀察到的皮膚反應(yīng)，確定誘導(dǎo)接觸劑量和激發(fā)接觸劑量。

（1）誘導(dǎo)接觸：試驗(yàn)前24 h將動(dòng)物背部右側(cè)去毛4～6 cm2，然后將0.2 mL受試物涂在試驗(yàn)動(dòng)物去毛區(qū)皮膚上，用兩層紗布、一層玻璃紙覆蓋，再以無(wú)刺激性膠布封閉固定6 h。第7天和第14天以同樣的方法重復(fù)一次。陽(yáng)性對(duì)照組用0.2 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的2,4-二硝基氯代苯以同樣的方法致敏3次。陰性對(duì)照組用0.2 mL賦形劑（蒸餾水）以同樣的方法致敏3次。

（2）激發(fā)試驗(yàn)：末次誘導(dǎo)后14天，將0.2 mL受試物涂于豚鼠背部右側(cè)2.0 cm×2.0 cm去毛區(qū)（接觸前24 h脫毛），固定6 h。陽(yáng)性對(duì)照組用0.1 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的2,4-二硝基氯代苯以同樣的方法做激發(fā)接觸，于激發(fā)接觸后24 h和48 h觀察結(jié)果。陰性對(duì)照組用0.2 mL精油以同樣的方法僅做激發(fā)接觸，于激發(fā)接觸后24 h和48 h觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚刺激試驗(yàn)

在染毒后觀察期間，家兔皮膚可見(jiàn)紅斑（清晰可見(jiàn)、易于確定）、輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚），觀察至第4天恢復(fù)，于第4天試驗(yàn)結(jié)束，其紅斑最高分值為2，水腫最高分值為2，每天每只動(dòng)物平均積分為0.65。根據(jù)2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章“4 皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)”的“表2 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)”，判定本次試驗(yàn)皮膚刺激強(qiáng)度為輕度刺激，結(jié)果如表1所示。

表1 香榧精油急性皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 眼刺激試驗(yàn)

染毒后，家兔可見(jiàn)受試右眼結(jié)膜彌散性充血，呈深紅色，有明顯水腫，虹膜和角膜未見(jiàn)損傷，于第3天恢復(fù)正常，觀察至第3天試驗(yàn)結(jié)束。詳情如表2所示。

表2 香榧精油急性眼睛刺激性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 致敏試驗(yàn)

經(jīng)致敏接觸及激發(fā)試驗(yàn)后，精油試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組動(dòng)物染毒皮膚均未出現(xiàn)紅斑與水腫，致敏率為0%；陽(yáng)性對(duì)照組有9只動(dòng)物染毒皮膚出現(xiàn)程度不一的紅斑與水腫，致敏率為90.0%。根據(jù)2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章“6 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)”中的“表3 致敏強(qiáng)度”，香榧精油屬于弱致敏物，未見(jiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究所用香榧種皮源于浙江省龍泉市龍南鄉(xiāng)興川村野生香榧，變廢為寶，研發(fā)出香榧精油并衍生出一系列產(chǎn)品，如香榧精油手工皂、香榧精油氨基酸皂、香榧精油渲染皂等，促進(jìn)了香榧市場(chǎng)的發(fā)展。

急性皮膚刺激試驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)家兔皮膚表面的紅斑水腫進(jìn)行評(píng)分，檢測(cè)香榧精油對(duì)皮膚局部是否有刺激作用及評(píng)價(jià)刺激的嚴(yán)重程度。與人類(lèi)和豚鼠相比，新西蘭兔在大多數(shù)情況下對(duì)具有刺激性的物質(zhì)較為敏感。在本試驗(yàn)條件下，家兔皮膚封閉接觸4 h出現(xiàn)了肉眼可見(jiàn)的紅斑、水腫，而豚鼠皮膚封閉接觸6 h未見(jiàn)紅斑、水腫。急性眼睛刺激試驗(yàn)主要用于判斷香榧精油對(duì)眼睛的刺激作用，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，對(duì)結(jié)膜的充血、水腫和角膜的損傷進(jìn)行評(píng)分，并判斷其對(duì)眼睛急性刺激的可能性及嚴(yán)重程度，根據(jù)香榧精油對(duì)新西蘭兔的眼部刺激程度外推其對(duì)人眼部的刺激作用。皮膚致敏試驗(yàn)可以確定重復(fù)接觸香榧精油對(duì)豚鼠是否引起變態(tài)反應(yīng)及其反應(yīng)程度，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)豚鼠皮膚表面反復(fù)染毒，對(duì)皮膚紅斑及水腫進(jìn)行評(píng)分，判斷香榧精油不引起豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)，在人群中大概率也不會(huì)引起變態(tài)反應(yīng)。

香榧精油的純度為99.0%，在實(shí)際使用時(shí)，需用基礎(chǔ)油調(diào)和后以涂抹或按摩的方法施于皮膚，很少與人體皮膚直接接觸。試驗(yàn)中使用封閉式接觸是一種超常的實(shí)驗(yàn)室條件下的試驗(yàn)，在人實(shí)際使用化妝品的過(guò)程中很少存在這種接觸方式。綜上所述，香榧精油在日常生活中不易產(chǎn)生皮膚刺激性、眼睛刺激性和致敏性。