楊若雨，吳劍榮，張洪濤，高敏杰，詹曉北

(糖化學與糖生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

帶分支的β-1,3-葡寡糖是一類由真菌所產β-1,3-葡聚糖經生物、化學等方法降解制備得到的功能性寡糖，它具有降低高血壓、高血糖、高血脂以及抗腫瘤、益生元等生理活性，性能穩(wěn)定且安全無毒。大量研究表明，與大分子多糖相比，帶分支的β-1,3-葡寡糖具有的生理活性更高更多元，在食品、醫(yī)藥、農業(yè)等領域具有更大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳?，常用的制備?1,3-葡寡糖的方法主要是人工化學合成和多糖降解。人工化學合成雖然能獲得非天然糖鏈，但操作起來費時費力且產量較低，幾乎無法用于實際生產。多糖降解又分為酶解和酸解2種方法，其中酶解反應條件溫和、水解效率高、操作簡便，是現階段制備β-1,3-葡寡糖最常用的方法。但單菌發(fā)酵產多糖后再利用酶解制備寡糖的方法往往效率低，葡聚糖的水不溶性造成水解酶無法充分的發(fā)揮作用。混合發(fā)酵法是在多糖產生的同時進行酶解，可有效克服直接酶解多糖時水解效率低的問題，同時還可以節(jié)約成本。

目前，β-葡聚糖酶是國內外的研究熱點，酶活性也顯著提高。湯興俊等[1]從土壤中篩選出1株能產生β-1,3-1,4-葡聚糖酶的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，利用紫外線和硫酸二乙酯對此菌株進行復合誘變，使β-1,3/1,4-葡聚糖酶的產量得到有效提高，最終突變株的酶活力可達到154.7 U/mL，是原始菌株的2.42倍。但是相關研究的內切β-1,3-葡聚糖酶的來源微生物并沒有列入食品安全目錄。長枝木霉是一株產酶體系相對豐富的菌株，已進入國家食品安全目錄，它含有內切β-1,3-葡聚糖酶的基因，但是內切β-1,3-葡聚糖酶活力較低。

裂褶菌多糖是一類主鏈為β-1,3-糖苷鍵，支鏈為β-1,6-糖苷鍵的多糖，在水中可形成穩(wěn)定的三螺旋結構[2-3]。與人工栽培、固體發(fā)酵相比，裂褶菌多糖的深層發(fā)酵周期短，多糖產量高且提取簡便。例如吳麗華[4]篩選出1株胞外多糖產量較高的裂褶菌，在7 L發(fā)酵罐水平多糖產量達到了5.2 g/L。另外，裂褶菌多糖在多個行業(yè)中都具有廣闊的應用前景，如作為增稠劑用于化妝品領域，作為生物反應調劑提高疫苗治療效果。SCHULZ等[5]制備裂褶菌多糖-多元醇衍生物具有成薄膜性，這種薄膜不是熱塑性，氧氣的滲透性低，但對水蒸氣的滲透性高，且具有低斷裂伸長率，可用于食品保鮮膜。

本文以長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)為原始菌株，通過常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)誘變以提高內切β-1,3-葡聚糖酶產量，獲得目的突變株T-6，對突變株T-6所產內切酶的動力學參數和酶學性質進行探索。在此基礎上，將突變株T-6與裂褶菌(Schizophyllumcommune)進行混合培養(yǎng)，用于制備裂褶寡糖，并對裂褶寡糖進行了結構表征和抗氧化活性的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

長枝木霉(GDMCC3.534)和裂褶菌(GDMCC5.43)，均購于廣東省微生物菌種保藏中心，由本實驗室活化并保藏。

ARTP-3常壓室溫等離子體誘變育種系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；食品級熱凝膠，Takeda-Kirin Food Co.Ltd；Sep-Pak C18固相萃取柱，Waters公司；DIONEX ICS-5000+SP-5高壓離子色譜系統(tǒng)，美國賽默飛世爾科技公司；Avance Ⅲ 400 MHZ全數字化核磁共振波譜儀，德國布魯克公司；MALDI-TOF/TOF基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜儀，美國布魯克·道爾頓公司；截留分子質量10 kDa透析袋，北京索萊寶科技有限公司；NO檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 長枝木霉培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(新鮮去皮)200，葡萄糖20，瓊脂20，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，維生素B1(硫胺素)8 mg，pH自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，酵母浸粉15.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：茯苓多糖60，胰蛋白胨15.0，NaNO35.0，KH2PO410.0，MgSO4·7H2O 1.0，pH 7.0。

1.2.2 裂褶菌培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母浸粉3.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂20.0，pH自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母浸粉3.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母浸粉3.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母浸粉3.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

1.3 培養(yǎng)方法

PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d的長枝木霉用已滅菌的生理鹽水15 mL沖洗并置于放置有數粒無菌玻璃球的已滅菌三角瓶中，充分振搖打散，將沖洗液用滅菌紗布(4層)過濾除去菌絲，稀釋至106～107個/mL，獲得孢子懸浮液。

裂褶菌培養(yǎng)方法：將菌株劃線接種在平板培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)7 d；取1～2環(huán)活化好的菌絲接種于裝液量為100 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，28 ℃，170 r/min搖床培養(yǎng)3 d；再以10%的接種量將種子培養(yǎng)液接入50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，190 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

長枝木霉培養(yǎng)方法：將菌株劃線接種在平板培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)5 d，制成孢子懸液；以5%的接種量將孢子懸液接種于裝液量為50 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)36 h；再以8%接種量將種子培養(yǎng)液接入50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，33 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)144 h。

混菌發(fā)酵培養(yǎng)方法：將按照上述方法培養(yǎng)發(fā)酵24 h的長枝木霉發(fā)酵液離心留沉淀，再按照發(fā)酵液體積比1∶1加入到裂褶菌發(fā)酵液中，于28 ℃、190 r/min 繼續(xù)搖床培養(yǎng)6 d。

1.4 長枝木霉的誘變篩選

將長枝木霉的原始菌株利用常壓室溫等離子體誘變育種系統(tǒng)選擇不同的誘變處理時間(30、60、90、120、150、180、210 s)，在功率120 W、氣流量10 mL/min 的條件下，對萌發(fā)敏感體進行誘變，以未經誘變的菌懸液為對照，涂布平板計算致死率選出最佳誘變時間，再通過透明圈初篩和搖瓶復篩得到內切β-1,3-葡聚糖酶的高產菌株。

1.5 粗酶液的制備

取發(fā)酵6 d的發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，再將上清液進行抽濾得濾液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 裂褶寡糖的提取純化

裂褶寡糖的提取純化：取一定體積的混菌發(fā)酵上清液，先加入3倍體積的無水乙醇4 ℃醇沉除去小分子多糖沉淀，再加入原混菌發(fā)酵上清液體積的7倍體積無水乙醇4 ℃醇沉過夜，離心留沉淀，氮氣吹干并復溶，溶液過膜備用。使用Sep-Pak C18固相萃取柱去除蛋白，獲得洗脫液。上述洗脫液利用旋轉蒸發(fā)進行濃縮，再用100～500 Da透析袋透析2 d，去除單糖和離子。最后凍干，得到帶分支的β-1,3-葡寡糖樣品。

1.7 分析方法

生物量測定方法：取定量的長枝木霉單菌發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min留沉淀，水洗2～3次后105 ℃烘干至恒重。

蛋白質含量采用BCA蛋白增強盒測定發(fā)酵液中蛋白含量。

發(fā)酵液殘?zhí)遣捎帽椒?硫酸法測定[6]。發(fā)酵液殘留還原糖測定采用生物傳感分析儀進行分析。

1.8 內切β-1,3-葡聚糖酶的活力測定

總酶活力(Etotal)：1 min水解熱凝膠得到1 μg寡糖的酶量記為1酶活力單位(U)。

內切β-1,3-葡聚糖酶活力(Eendo)：1 min水解熱凝膠得到1 μg寡糖(2≤聚合度<6)的量為1 U。

反應體系(5 mL)：1.5 mL 20 g/L熱凝膠懸浮液(20 g溶于1 L的1 mol/L NaOH)、2.5 mL醋酸鈉緩沖液(0.025 mol/L，pH 6.0)與1 mL粗酶液混勻置于50 ℃水浴反應2.5 h后，沸水浴加熱10 min終止反應，進行薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)板測定。測定方法參考文獻[7]。

1.9 內切β-1,3-葡聚糖酶的酶促反應動力學

將粗酶液分別作用于不同濃度的茯苓多糖，測定從底物釋放的還原糖生成量確定內切β-1,3-葡聚糖酶的動力學參數。具體方法參考文獻[8]并略有改動。以茯苓多糖(1.0～8.0 g/L)為底物在醋酸鈉緩沖溶液(50 ℃、pH 6.0、0.025 mol/L)中作用10 min，加入粗酶液開始反應，在不同時間段取樣用DNS法測定釋放出的還原糖量。

1.10 裂褶寡糖的定量分析

TLC分析：點樣2 μL于薄層層析板；以V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(水)=5∶5∶4為展開劑，層析60 min。經顯色劑處理后于105 ℃ 顯色5 min。顯色結束后，采用Image J處理軟件對結果進行分析。

基質輔助激光解吸飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption / ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)分析：使用FlexControl和 FlexAnalysis 140 3.4.軟件進行數據采集和處理。

1.11 裂褶寡糖的單糖組成分析

樣品處理方法及分析方法參考文獻[9]，并略有改動。將純化后的寡糖樣品配制為10 mg/L的單糖混標溶液，包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖。采用高壓離子色譜儀進行分析。

1.12 裂褶寡糖的核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)測定

取1.6中的20 mg寡糖溶于0.5 mL的D2O裝入核磁管，在400 Hz條件下采集1H譜；取1.6中的45 mg 寡糖溶于0.5 mL的D2O裝入核磁管，在600 Hz 條件下采集13C譜。

1.13 裂褶寡糖體外抗氧化活性研究

2 結果與分析

2.1 長枝木霉產內切β-1,3-葡聚糖酶的酶學性質

對長枝木霉原始菌株進行預實驗發(fā)現能檢測到內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力，但酶活力很低。我們將原始菌株進行ARTP誘變處理，通過透明圈初篩和搖瓶復篩選育出了內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力較高且遺傳形狀穩(wěn)定的突變株T-6。將原始菌株和突變株T-6在相同條件下進行培養(yǎng)，結果見圖1-a。與原始菌株相比，突變株T-6的總酶活力和內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力都得到了明顯的提高。其中，內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力是原始菌株的1.71倍，總酶活力是原始菌株的1.21倍，Eendo/Etotal達到0.50。經發(fā)酵條件優(yōu)化后，菌株T-6的內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力可達到212 U/mL。目前，國內關于長枝木霉發(fā)酵生產內切β-1,3-葡聚糖酶的報道很少，多是進行發(fā)酵生產纖維素酶的研究，比如趙菁[12]利用紫外和微波對出發(fā)菌株長枝木霉A002進行誘變篩選，得到1株纖維素酶高產菌株M06，并且通過蛋白質組學分析了產酶增強的機理。本研究通過誘變選育獲得的內切β-1,3-葡聚糖酶高產菌株，具有產酶活力高且遺傳性狀穩(wěn)定的特點，為下一步的裂褶菌-長枝木霉耦合發(fā)酵奠定了基礎。

酶促反應動力學主要用來研究酶催化底物的反應速度以及影響其反應速度的包括酶濃度、底物濃度在內的各種因素。我們將長枝木霉單菌發(fā)酵粗酶液分別作用于不同濃度的茯苓多糖，用DNS法測定從底物釋放的寡糖生成量。根據米氏常數方程，利用Lineweaver-Burk(L-B)雙倒數作圖法可得到內切β-1,3-葡聚糖酶的動力學參數(圖1-b)，即Vm=0.110 5 mg/(mL·min)，Km=4.005 g/L。相比之下，唐治玉[13]報道木霉菌株LE02來源的內切β-葡聚糖酶的Km值為0.012 8 g/L，鄭必勝等[14]報道裂褶菌所產的內切β-1,3-葡聚糖酶的Km為0.881 g/L。因此，不同來源的內切β-1,3-葡聚糖酶的米氏常數差別較大。

進一步研究酶的穩(wěn)定性，如圖1-c和圖1-d所示。在30～50 ℃，內切β-1,3-葡聚糖酶的酶活力隨溫度的升高而提高，最適反應溫度為50 ℃，反應溫度超過50 ℃時，內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力開始隨著溫度的升高而降低。內切β-1,3-葡聚糖酶在45～60 ℃ 時酶活力較高，相對酶活力均在50 ℃時酶活力的80%以上，當反應溫度達到80 ℃時，酶活力的損失很大，僅為50 ℃酶活力的8%。大部分酶在反應時都受其環(huán)境pH值的影響，可在某一pH值時達到最大酶反應速度。內切β-1,3-葡聚糖酶在pH 5.0～6.5時酶活力較高，當pH為6.0時酶的反應速度最大。當pH值<6.0時，隨著pH值的增大，內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力也逐漸增加。但是，當pH繼續(xù)加大，其內切酶活力并沒有繼續(xù)增加，反而開始下降，到pH值為7時內切β-1,3-葡聚糖酶酶活力只有最大值的35%。因此可以確定該酶的最適pH值為6.0。

a-T.longibrachiatum及其突變體T-6的酶活力；b-內切β-1,3-葡聚糖酶動力學參數的L-B圖；c-溫度對內切β-1,3-葡聚糖酶的影響；d-pH值對內切β-1,3-葡聚糖酶的影響圖1 內切β-1,3-葡聚糖酶的酶活力和酶學性質Fig.1 Activities and properties of endo β-1,3-glucanase

對長枝木霉所產的內切β-1,3-葡聚糖酶的底物專一性進行研究。分別以熱凝膠、茯苓多糖、小核菌多糖、水溶性淀粉和羧甲基纖維素為底物，測定內切β-1,3-葡聚糖酶的底物專一性，底物質量濃度為2 g/L(溶于水)，結果如表1所示。水溶性淀粉和羧甲基纖維素的相對酶活力為0，而水溶性淀粉含有α(1→4)糖苷鍵，羧甲基纖維素含有β(1→4)糖苷鍵，說明該酶對α(1→4)和β(1→4)糖苷鍵幾乎沒有水解作用。但對熱凝膠、茯苓多糖、小核菌多糖的水解作用相對較好，均在熱凝膠酶活力的70%以上，而這3種物質均含有β(1→3)糖苷鍵，說明此該酶具有嚴格的底物專一性。酶的底物專一性與內切β-1,3-葡聚糖酶一致，根據酶的底物專一性可知，此酶為內切β-1,3-葡聚糖酶。

表1 內切β-1,3-葡聚糖酶對不同底物的作用Table 1 The effect of endo β-1,3-glucanase on different substrates

2.2 長枝木霉與裂褶菌耦合發(fā)酵制備β-1,3-葡寡糖的結構表征

酶水解生產β-葡寡糖是目前最常用的一種方法，但生產成本增加，而利用微生物耦合發(fā)酵方法制備寡糖可以有效解決這個問題，并提高目的寡糖的產量。本研究將裂褶菌-長枝木霉進行耦合發(fā)酵，成功制備得到帶分支的β-1,3-葡寡糖，并將其命名為-裂褶寡糖(oligo β-1,3-glucans of schizophyllum commune，Sc.bOβG)。寡糖的分子質量分析多采用黏度計、電泳、HPLC以及MS等方法[15]。本研究中制得的寡糖樣品可能因發(fā)酵過程中水解不完全而存在小分子多糖而更適合采用MALDI-TOF MS法分析裂褶寡糖的分子質量。而薄層層析法具有操作方便、設備簡單、顯色容易等優(yōu)點，且展開速度快，常用來快速分析糖的聚合度，但結果不夠精確。因此，本研究主要選取了薄層層析串聯MALDI-TOF MS的方法對裂褶寡糖進行聚合度分析。

首先將裂褶菌-長枝木霉混菌發(fā)酵液進行TLC板測定，結果如圖2-a所示。裂褶菌與哈茨木霉共培養(yǎng)得到的發(fā)酵上清液中含有小分子質量的裂褶寡糖，且所得的裂褶寡糖聚合度多在7以上，聚合度在7以下的寡糖很少。但TLC跑板的結果只能得到一個粗略的寡糖聚合度范圍，并不能準確得出所產帶分支的β-1,3-葡寡糖的具體聚合度。因此，將上述樣品進行純化，對純化的裂褶寡糖再進行 MALDI-TOF MS分析，結果如圖2-b所示。由圖2可計算得出裂褶寡糖的聚合度為4～15。結果表明，混合發(fā)酵所產帶分支的β-1,3-葡寡糖的分子質量分布范圍較小。

a-Sc.bOβG的TLC板結果；b-Sc.bOβG的MALDI-TOF MS圖譜圖2 Sc.bOβG的TLC分析和MALDI-TOF MS圖譜Fig.2 TLC and MALDI-TOF MS analysis of Sc.bOβG

將純化的裂褶寡糖利用金屬浴水解成單糖，利用離子色譜對寡糖進行單糖組成分析，結果見圖3-a?？梢钥闯隽疡薰烟蔷挥善咸烟墙M成。進一步采用NMR對裂褶寡糖進行結構表征，1H-NMR圖譜結果如圖3-b所示。已純化的裂褶寡糖的1H-NMR圖譜出現了多糖的普通區(qū)分信號，在3～4.71 ppm之間的狹窄區(qū)域中過度擁擠，表示存在糖殘基[16]。與文獻進行對比，裂褶寡糖具有4.54 ppm處的β-1,3的β-異頭質子信號和4.22 ppm處的β-1,6連接的β-異頭質子信號；另外3.07～4.11 ppm之間的一組廣泛而密集信號認為是糖的CH2-O和CH-O基團。裂褶寡糖的13C-NMR圖譜結果如圖3-c所示。與文獻進行對比[17]，圖譜中說明裂褶寡糖中存在發(fā)生取代的C-1、C-3、C-6和未發(fā)生取代的C-2、C-4。因為峰高和碳原子數呈一定程度上的正相關，發(fā)生取代的C-3和未發(fā)生取代的C-6的碳原子數相同，發(fā)生取代的C-1和未發(fā)生取代的C-5的碳原子數相同。結合1H-NMR和13C-NMR圖譜，可以推知裂褶寡糖由主鏈β-1,3-糖苷鍵和支鏈β-1,6-糖苷鍵連接而成，與設想結構一致。

a-單糖組成分析(Ara-阿拉伯糖；Gla-葡萄糖醛酸；Glc-葡萄糖；Xyl-木糖；Man-甘露糖)；b-1H-NMR譜圖；c-13C-NMR譜圖圖3 Sc.bOβG的結構表征Fig.3 Structural characterization of Sc.bOβG

2.3 裂褶寡糖的體外抗氧化活性

裂褶寡糖的羥自由基清除率結果如圖4-c所示。寡糖質量濃度由0增加到2 g/L時，裂褶寡糖對羥自由基的清除率迅速增加，繼續(xù)增加寡糖濃度，其增速開始減緩，當寡糖質量濃度升至10 g/L時，裂褶寡糖對羥自由基的清除率達到99.4%，說明裂褶寡糖對羥自由基具有較好的清除能力。

最后，對裂褶寡糖的還原力進行測定，裂褶寡糖的還原力(用OD值表示)結果如圖4-d所示。當裂褶寡糖質量濃度為10 g/L時，裂褶寡糖還原力(700 nm)為1.129，熱凝膠寡糖還原力(700 nm)為0.321，維生素C還原力(700 nm)為3.028。由此得知，裂褶寡糖的還原力高于熱凝膠寡糖，但明顯低于維生素C。綜合上述4種抗氧化作用的評價方法，驗證了裂褶寡糖具有較好的抗氧化活性，相比之下，線性寡糖熱凝膠的抗氧化效果很差，說明支鏈寡糖的抗氧化活性明顯優(yōu)于線性寡糖，具有更好的研究價值。

a-DPPH自由基清除活性；清除活性；c-羥自由基清除活性；d-還原力圖4 寡糖的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of oligosaccharide

近年來，尋找一種價格低廉且能夠用于穩(wěn)定大規(guī)模生產功能性寡糖的方法已逐漸成為國內外的研究熱點。賀海濤等[19]以蔗糖為底物，通過蔗糖磷酸化酶和細小裸藻中的昆布二糖磷酸化酶耦合催化，最終成功合成β-1,3-葡寡糖。這種酶合成雖然方便快捷，純度高，但產品成本高，濃度偏低，不適合用于大規(guī)模生產，難以用于食品、醫(yī)藥等領域。李菲菲等[20]構建土壤桿菌-畢赤酵母耦合培養(yǎng)體系直接生產熱凝膠低聚糖。LIANG等[21]首次構建了由土壤桿菌ATCC-31749和哈茨木霉GIM 3.442組成的共培養(yǎng)發(fā)酵體系減弱了熱凝膠膠層對土壤桿菌菌體的包裹，成功地建立了微生物發(fā)酵直接生產熱凝膠低聚糖的方法。這種耦合發(fā)酵制備寡糖的方法不僅成功解決了酶制劑成本高的問題，而且有效提高了水解效率。在后期，我們進一步構建了哈茨木霉與小核菌或裂褶菌的耦合發(fā)酵體系，分別獲得聚合度為5～12和5～15的帶有分支的葡寡糖[22]。但是，哈茨木霉、畢赤酵母等在食品中并不被允許使用。本研究前期基礎上，選擇藥食兼用的裂褶菌和達到食品安全要求的長枝木霉，成功建立真菌混合發(fā)酵直接生產功能性寡糖的方法，所制備寡糖可應用于食品領域。

3 結論