陳文錦，董同力嘎，張小羽，額爾敦巴雅爾，云雪艷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

肉類在運(yùn)輸，貯藏過(guò)程中因?yàn)槲⑸?、蛋白質(zhì)分解等發(fā)生腐敗變質(zhì)[1]，經(jīng)驗(yàn)不足的消費(fèi)者在購(gòu)買產(chǎn)品時(shí)可能會(huì)難以分辨。人們需要對(duì)食品的新鮮程度和安全性有所了解，監(jiān)測(cè)食品的新鮮度尤為重要。肉類腐敗會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性氨類物質(zhì)，使得包裝頂空的pH值上升，利用此條件開發(fā)出響應(yīng)肉類的新鮮度的材料，通常稱為智能指示包裝[2]。指示劑有化學(xué)合成色素和天然色素，但由于安全性問(wèn)題，天然色素逐漸代替化學(xué)合成色素[3]。常用天然色素有花青素、姜黃素、甜菜紅素、茜素[4-7]等。

茜素是從茜草植物中提取的醇溶性色素，是一類蒽醌類物質(zhì)，常用作染料和染色劑。利用酸性顯黃色，堿性顯示紫色的特點(diǎn)，將其與固體載體混合已用于監(jiān)測(cè)牛肉[8]，鱒魚[7,9]的腐敗程度，表明茜素可用于指示食品的新鮮度。

高分子藥物載體系統(tǒng)被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其具有可生物降解、相容性好、毒性低等特點(diǎn)[10]。在水溶液中嵌段共聚物通過(guò)分子間的氫鍵作用、疏水作用等弱非共價(jià)鍵作用，自組裝形成具有核殼結(jié)構(gòu)的膠束。親水性部分形成殼結(jié)構(gòu)，疏水性部分形成核結(jié)構(gòu)，通過(guò)物理包埋、化學(xué)鍵作用等負(fù)載藥物。聚乙二醇-聚己內(nèi)酯[monomethoxyl poly(ethylene glycol)-poly(caprolactone)，MPEG-PCL]是常用于制備膠束的高分子材料，將農(nóng)業(yè)殺菌劑異菌脲負(fù)載到MPEG-PCL中，能防止農(nóng)藥的光降解，并噴灑于收獲前60 d的葡萄上，在采摘時(shí)發(fā)現(xiàn)與未處理組相比，葡萄的大小、還原糖含量等均得到提高[11]。

目前研究多為將各類色素混入膜中制成比色膜。若直接將色素加入成膜基質(zhì)中，色素易受到外界因素影響而提前顯色。而聚合物膠束通常將作為藥物傳輸載體，使藥物到達(dá)病灶部位后再被利用，能提高藥物的利用率，對(duì)藥物起到保護(hù)和防止提前釋放的作用?；诖讼敕ǎ狙芯繉⒕酆衔锬z束包埋疏水性色素，再與固體基質(zhì)微晶纖維素制成比色片，保護(hù)色素的同時(shí)拓寬比色材料的范圍，最后將比色片用于豬肉新鮮度的監(jiān)測(cè)中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉(里脊肉)，呼和浩特市東瓦窯批發(fā)市場(chǎng)；單羥基聚乙二醇[monomethoxyl poly(ethylene glycol)，MPEG](Mn=5 000)、茜素(97%)，Sigma-Aldrich試劑公司；ε-己內(nèi)酯(ε-caprolactone，ε-CL)(純度≥99.9%)，上海麥克林有限公司；辛酸亞錫Sn(Oct2)、二氯甲烷等(分析純)，國(guó)藥試劑有限公司；氧化鎂、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)等(分析純)，羅恩試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

IRAffinity-1紅外光譜儀、UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Advance 2B核磁共振儀，德國(guó)Bruker公司；DSC-Q20差式掃描量熱分析儀，美國(guó)TA公司；JEM-2100F透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社公司；PHS-3C pH計(jì)，上海雷磁儀器；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)有限公司；LHS-HC-I恒溫恒濕箱，上海一恒有限公司；CR-20色差儀，日本柯尼卡；HC-2518R生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MPEG-PCL的合成

根據(jù)SHUAI等[12]的方法，適當(dāng)修改。三口燒瓶中加入引發(fā)劑MPEG(10 g)，100 ℃抽真空4 h除去殘留水分。加入單體ε-CL(10 mL)和催化劑Sn(Oct2)(單體質(zhì)量的千分之三)，置換4次氬氣后120 ℃ 反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后降至室溫，用二氯甲烷溶解，無(wú)水乙醚純化，真空干燥至恒重，得到白色固體粉末，產(chǎn)率為92%。

1.3.2 pH響應(yīng)性納米球的制備

參考YANG等[13]的方法，適當(dāng)修改。采用溶劑揮發(fā)法制備膠束，取100 mg聚合物與茜素(0、10、20 mg)溶解于20 mL丙酮中。緩慢滴加在100 mL超純水中，攪拌過(guò)夜使丙酮揮發(fā)，形成1 mg/mL的膠束溶液。0.45 μm濾器過(guò)濾后冷凍干燥得到載藥凍干粉，用PP、APP1、APP2表示。

1.3.3 材料的表征

1.3.3.1 核磁共振氫譜儀分析

將適量樣品溶于氘代氯仿中，以四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)物，在23 ℃，500 MHz頻率下進(jìn)行測(cè)試。

1.3.3.2 差示掃描量熱分析

稱取樣品5～10 mg放于鋁制樣品盤中，在50 mL/min的N2保護(hù)下，以10 ℃/min升溫速率，從25 ℃升溫到100 ℃。

1.3.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取干燥好的溴化鉀100 mg與樣品2 mg在研缽中充分研磨，通過(guò)壓片機(jī)壓片后進(jìn)行測(cè)試，以純溴化鉀為背景。條件設(shè)置為分辨率4 cm-1，波數(shù)400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64次。

1.3.3.4 包封率及載藥量

在丙酮中溶解不同劑量的茜素標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將凍干粉溶解于丙酮中，用紫外分光光度計(jì)記錄417 nm處的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中。根據(jù)公式(1)和公式(2)計(jì)算得到包封率和載藥量：

(1)

(2)

1.3.3.5 透射電鏡觀察

將膠束溶液滴在碳支持的銅網(wǎng)上，風(fēng)干后用20 g/L 的磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染色，風(fēng)干后在200 kV加速電壓下觀察膠束形貌。用Nano Measurer 1.2軟件分析粒徑。

1.3.3.6 顏色分析

將0.25 mL質(zhì)量濃度為0.2 g/L的茜素乙醇溶液加入到pH 1～12的溶液中，用0.01 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)在350～750 nm內(nèi)的吸收光譜。

1.3.4 豬肉的新鮮度的監(jiān)測(cè)

1.3.4.1 比色片的制備及對(duì)揮發(fā)氨的響應(yīng)

將10 mg膠束凍干粉APP1與30 mg微晶纖維素壓成將直徑為1.4 cm的圓片。比色片對(duì)揮發(fā)氨的響應(yīng)測(cè)試參考CHEN等[5]的方法，適當(dāng)修改。在100 mL錐形瓶中加入80 mL不同濃度氨水(0.08、0.16、0.64、0.8 mol/L)，將比色片置于液面上方4 cm處。以純微晶纖維素片為對(duì)照組。在25 ℃下，每4 min，用色差儀測(cè)定L、a、b值，共計(jì)28 min，總色差ΔE計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：L、a、b為響應(yīng)后的值，L0、a0、b0為初始值。

1.3.4.2 豬肉的應(yīng)用

將新鮮里脊肉放于4 ℃冰箱中預(yù)冷2 h排酸。在生物安全柜中將豬肉切成每塊約200 g，放于14 cm×14 cm的托盤中，用聚酰胺/聚乙烯袋包裝，將比色指示片固定于袋內(nèi)但不與肉接觸，并用熱封機(jī)封口，之后置于4 ℃的恒溫恒濕箱中貯藏。用色差儀記錄比色片的L，a，b值，公式(3)計(jì)算總色差ΔE。

1.3.4.3 理化指標(biāo)測(cè)試

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[14]中半微量定氮法測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)；參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[15]測(cè)定菌落總數(shù)(total viable count，TVC)；參照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[16]測(cè)定pH；硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的測(cè)定參考DONG等[17]的方法，適當(dāng)修改，在25 mL的7.5%三氯乙酸(含0.1% 乙二胺四乙酸二鈉)中加入5 g絞碎的肉樣，攪拌30 min后過(guò)濾，將5 mL上清液與5 mL的0.02 mol/L的硫代巴比妥酸溶液混合，90 ℃水浴40 min后冷卻1 h，1 600 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，將上清液與5 mL三氯甲烷混合，振搖靜置分層，測(cè)定上清液在532 nm與600 nm處的吸光度，根據(jù)公式(4)計(jì)算TBARS的值：

(4)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3組平行，使用SPSS 26分析數(shù)據(jù)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，ANOVA分析顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁氫譜分析

圖1中，MPEG中δ3.38是甲氧基(—OCH3)上的氫原子，δ3.62對(duì)應(yīng)亞甲基(—CH2)上的4個(gè)氫原子[13]。MPEG-PCL中δ4.06，δ2.31，δ1.64，δ1.36處分別是PCL嵌段中—OCH2—，—COCH2—，—CH2*CH2CH2*—，—CH2CH2*CH2—的上氫原子的振動(dòng)峰[18]，根據(jù)己內(nèi)酯和乙二醇單元上氫的積分面積比可計(jì)算得到嵌段聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量約為1.0×105，接近設(shè)定投料比。

圖1 MPEG和MPEG-PCL共聚物的氫核磁共振圖譜Fig.1 1H NMR spectrum of MPEG and MPEG-PCL diblock polymers

2.2 差式掃描量熱分析

由表1可知，MPEG的熔融溫度(Tm)為64.5 ℃，熔融焓(ΔHm)為163.1 J/g。MPEG-PCL的熔融溫度為57.2 ℃，熔融焓(ΔHm)為112.8 J/g。由圖2可知，共聚物是一個(gè)大的熔融單峰，這是因?yàn)镻CL嵌段與MPEG嵌段的熔融溫度相近[19]，當(dāng)己內(nèi)酯單元/乙二醇單元比在0.5時(shí)，PEG與PCL鏈段長(zhǎng)度接近，兩組分之間的限制很小，也會(huì)出現(xiàn)單峰[20]，說(shuō)明成功合成了MPEG-PCL共聚物。

圖2 MPEG和MPEG-PCL共聚物的差式掃描量熱曲線Fig.2 DSC curves of MPEG and MPEG-PCL

表1 MPEG和MPEG-PCL的熱學(xué)性能Table 1 The thermal properties of MPEG and MPEG-PCL diblock polymers

2.3 透射電鏡分析

聚合物在水中通過(guò)分子間氫鍵、疏水作用等自組裝形成膠束，當(dāng)用磷鎢酸負(fù)染時(shí)，親水外殼被染色，而疏水內(nèi)核不被染色，故呈現(xiàn)出黑色的背景與亮白色的內(nèi)核[18]。圖3所示為膠束均呈現(xiàn)白色球狀結(jié)構(gòu)，未載茜素的膠束呈現(xiàn)較小顆粒，粒徑為33.1 nm，負(fù)載茜素后膠束的粒徑增大，APP1粒徑為35.9 nm，APP2粒徑為36.2 nm，粒徑增大表明茜素已成功負(fù)載[11]。

a-PP；b-APP1；c-APP2圖3 膠束PP、APP1和APP2的透射電鏡圖Fig.3 TEM images of the PP,APP1 and APP2 micelles

2.4 包封率及載藥量

由表2可知，純膠束PP無(wú)包封率及載藥量，負(fù)載茜素后，膠束APP1的包封率為5.2%，載藥量為0.49%，APP2的包封率為2.7%，載藥量為0.26%。包封率與載藥量沒(méi)有隨投料比的提高而提高。聚合物質(zhì)量與藥物質(zhì)量的比例對(duì)包封率和載藥效果有一定的影響，藥物添加量多會(huì)使聚合物和藥物之間出現(xiàn)凝聚體，從而不能形成穩(wěn)定的膠束[21]，使包封率降低。膠束包封難溶性藥物有多種作用方式，當(dāng)藥物分子與疏水段的相容性差時(shí)，包封率與載藥量會(huì)降低，當(dāng)聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量小時(shí)，包封率與載藥量也會(huì)下降[22]。這與邱笛[23]將肝素包埋于不同分子質(zhì)量的PLLA-PEG-PLLA微球中現(xiàn)象一致。

表2 膠束的包封率及載藥量Table 2 Durg-loading efficiency and drug-loading content of micelles

2.5 紅外光譜分析

圖4 MPEG、MPEG-PCL、茜素、APP及混合的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectrum of MPEG、MPEG-PCL、Alizarin、APP and physical blend

2.6 茜素的顏色響應(yīng)及比色片對(duì)揮發(fā)氨的響應(yīng)

茜素是一種蒽醌類物質(zhì)，酚羥基的供電子性能會(huì)隨著pH值增加而陰離子化增強(qiáng)，其顏色會(huì)逐漸加深。如圖5-a所示，在酸性溶液(pH 2～6)中，顏色由黃色變?yōu)殚偕?，pH 7～8為橘紅色，pH 9為淺粉色，pH 10～11為紫紅色，pH 12為紫色。茜素在不同pH溶液中顏色變化明顯，具有pH響應(yīng)能力。如圖5-b所示，隨著pH的增加，其最大吸收峰向更長(zhǎng)的波長(zhǎng)移動(dòng)。pH為2時(shí)，最大吸收峰在430 nm處，pH增加時(shí)，羥基上的負(fù)電荷發(fā)生離域，導(dǎo)致吸收峰強(qiáng)度降低[27]。pH為6時(shí)，羥基去質(zhì)子化導(dǎo)致共振效應(yīng)產(chǎn)生，使得波長(zhǎng)427 nm紅移至538 nm，堿性溶液(pH 8～12)中，吸收峰位置基本沒(méi)變化，但強(qiáng)度會(huì)有所增加，這是由于羥基第二次去質(zhì)子導(dǎo)致的[28]。CHEN等[29]也報(bào)道了茜素的吸收波長(zhǎng)會(huì)隨著pH的增加而發(fā)生紅移，羥基上的質(zhì)子在分子內(nèi)氫鍵作用下發(fā)生轉(zhuǎn)移，使顏色發(fā)生變化。

a-顏色變化；b-紫外吸收光譜圖5 茜素在pH 2～12溶液中的顏色變化、紫外吸收光譜圖Fig.5 Visible color UV-vis spectrum of alizarin solution at pH 2-12

a-比色片的總色差；b-實(shí)物圖圖6 不同氨濃度下響應(yīng)的比色片的總色差、實(shí)物圖Fig.6 Total colour difference (ΔE) of colorimetric tablets after exposure to different concentrations NH3,reaction graph

2.7 豬肉新鮮度的監(jiān)測(cè)

通常評(píng)價(jià)豬肉新鮮程度的指標(biāo)有pH、TVC與TVB-N等。pH評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：5.6≤新鮮肉≤6.2，6.3≤次鮮肉≤6.6，腐敗肉>6.7；TVC評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：新鮮肉<4 lgCFU/g，次鮮肉4 lgCFU/g～6 lgCFU/g，腐敗肉>6 lgCFU/g；TVB-N評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：新鮮肉<15 mg/100g，次鮮肉15～20 mg/100g，腐敗肉>20 mg/100g[30]。表3是豬肉貯藏期間各項(xiàng)指標(biāo)變化。初始pH為6.14，新鮮狀態(tài);貯藏2 d時(shí)pH上升到6.59，為次新鮮狀態(tài);4 d時(shí)達(dá)到6.71，超過(guò)腐敗值6.7，pH的上升是因?yàn)樨i肉在細(xì)菌和酶的作用下，蛋白質(zhì)與氨基酸被分解，產(chǎn)生胺類等堿性含氮化合物，堿性物質(zhì)逐步增多，肉的pH上升也越快。TVC反映食品被微生物污染的程度，雖初始TVC<4處于新鮮程度，但被微生物污染程度較高，會(huì)縮短貯藏時(shí)間，貯藏2 d時(shí)TVC為5.27 lgCFU/g，處于次新鮮狀態(tài)，貯藏4 d時(shí)TVC為6.23 lgCFU/g已經(jīng)腐敗。TVB-N為肉類食品是否新鮮的一個(gè)重要理化指標(biāo)。TVB-N的上升也是因?yàn)閴A性含氮化合物的產(chǎn)生及積累，初始TVB-N為11.9 mg/100g屬于新鮮級(jí)，貯藏2 d時(shí)為16.6 mg/100g為次新鮮級(jí)，貯藏4 d時(shí)為23.1 mg/100g，已經(jīng)腐敗。肉類在貯藏中會(huì)發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而生成醛酮類等物質(zhì)，產(chǎn)生令人不愉快的氣味，一般用TBARS值表示脂肪氧化的程度。通常認(rèn)為TBARS>1 mg/kg時(shí)，會(huì)出現(xiàn)酸味，為變質(zhì)肉[31]，初始TBARS為0.28 mg/kg，豬肉新鮮，貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，TBARS顯著上升，第4天時(shí)，為1.18 mg/kg，超過(guò)1 mg/kg的閾值，豬肉腐敗變質(zhì)。

表3 豬肉貯藏期間pH、TVC、TVB-N和TBARS的變化Table 3 The changes of pH,TVC,TVB-N and TBARS in pork during storage

比色片在貯藏期間L，a，b值及ΔE的變化如表4所示，L值為亮度，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)亮度顯著下降。a值為紅綠值，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)a值顯著上升，即紅色加深。b值為黃藍(lán)值，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)b值顯著下降，即藍(lán)色加深。而紅色與藍(lán)色組合為紫色，由圖7中也能看出比色片顏色有很明顯的變化，從棕色變?yōu)樽仙?。從ΔE變化可知，在貯藏第2天時(shí)，ΔE為3.0，此時(shí)豬肉指標(biāo)pH、TVC與TVB-N均在次鮮肉范圍內(nèi)，TBARS也未超過(guò)腐敗肉的值。在貯藏第4天時(shí)，ΔE為7.1超過(guò)5，比色片顏色變化肉眼可見，此時(shí)豬肉指標(biāo)pH、TVC、TVB-N與TBARS均超過(guò)腐敗值，豬肉腐敗變質(zhì)。比色片的顏色變化表示豬肉從新鮮肉變?yōu)楦瘮∪?，表明可用ΔE的變化表示豬肉的新鮮程度，即棕色為新鮮肉，紫色為腐敗肉。之前也有研究表明當(dāng)鱒魚和牛肉腐敗時(shí)，含茜素的智能指示膜均可以從黃色或棕色變?yōu)樽仙玔7-9]。

表4 比色片在貯藏期間的L、a、b和ΔE變化Table 4 The changes of L,a,b and ΔE values of colorimetric tablets during storage

圖7 豬肉貯藏0 d及4 d的肉與比色片的變化圖Fig.7 Changes of meat and colorimetric tablets of pork stored for 0 and 4 days

進(jìn)一步對(duì)比色片ΔE與新鮮度指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析。由表5可知，比色片的ΔE與pH、TVC、TVB-N和TBARS均呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.905、0.966、0.987和0.979，均呈較高的相關(guān)性。以上結(jié)果表明，比色片的ΔE能作為肉類新鮮度評(píng)定的指標(biāo)。

表5 豬肉貯藏期間ΔE、pH、TVC、TVB-N和TBARS的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of ΔE,pH,TVC,TVB-N and TBARS of pork during storage

3 結(jié)論

使用溶劑揮發(fā)法將茜素包埋于MPEG-PCL膠束中，凍干后與微晶纖維素壓片制備成比色指示片。氫核磁共振、紅外光譜表明MPEG-PCL的合成，透射電鏡表明膠束的形成，同時(shí)比色片對(duì)不同濃度氨氣均表現(xiàn)出響應(yīng)能力。應(yīng)用于豬肉上時(shí)，當(dāng)豬肉腐敗，比色指示片從棕色變?yōu)樽仙?，ΔE與理化指標(biāo)pH、TVC、TVB-N和TBARS呈顯著相關(guān)。結(jié)果表明比色指示片在監(jiān)測(cè)肉類新鮮度方面具有應(yīng)用前景，同時(shí)為智能指標(biāo)包裝提供新的思路。