趙 越，田 蕾，閆 峻，李 康，林本成，襲著革，劉曉華

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

近年來空氣污染問題已成為全球亟待解決的重要環(huán)境問題之一，臭氧（ozone，O3）作為環(huán)境重要污染物之一，已成為我國夏季大氣首要污染物［1］。中國環(huán)境監(jiān)測總站數(shù)據(jù)顯示，2019年就有154個城市出現(xiàn)O3高值，且以O(shè)3為首要污染物的天數(shù)共153 d；2020年，京津冀地區(qū)、長江三角地區(qū)和汾渭平原O3超標(biāo)天數(shù)占總超標(biāo)天數(shù)的一半［1］。流行病學(xué)研究表明O3暴露與人類呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率呈正相關(guān)關(guān)系［2］。O3暴露可引起黏膜和呼吸道刺激性反應(yīng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些因子隨血液循環(huán)到達(dá)其他組織器官，引起全身性反應(yīng)［3］。

長鏈非編碼RAN（long noncoding RNA，lncRNA）是真核生物DNA轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生的一類非編碼RNA，其核苷酸數(shù)量大于200個堿基，lncRNA功能與其在細(xì)胞中的定位相關(guān)，在細(xì)胞核中的lncRNA主要通過干預(yù)染色體來發(fā)揮調(diào)控功能，在細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與機(jī)體生理病理學(xué)過程［4］。Janika等人研究表明lncRNA Chat可促進(jìn)心室重塑［5］，Maria-Teresa Piccoli團(tuán)隊(duì)研究表明Meg3升高可在慢性心肌肥大的基礎(chǔ)上導(dǎo)致心臟纖維化，特異性干擾該基因的表達(dá)可顯著改善心臟功能［6］。

目前O3亞慢性暴露對心臟影響的研究較少，深入機(jī)制研究更為匱乏。本文首次針對O3亞慢性暴露后大鼠心臟中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜變化情況，和差異性lncRNA潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行闡述，為預(yù)防O3亞慢性暴露對人體的損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型構(gòu)建及樣本采集

從北京維通利華有限公司購入18只6周齡雄性Wistar大鼠，于清潔級動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為清潔空氣組和臭氧暴露組，每組9只。建模期間，將大鼠置于氣體染毒柜（Beijing huironghe，HRH-CSED-K）中，清潔空氣組暴露于過濾空氣中，臭氧暴露組暴露于O3濃度為0.5 ppm（0.980 mg/m3）的混合氣體中，每天6 h，共90 d。暴露結(jié)束后大鼠禁食不禁水，次日以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈取血后立即摘取心臟，隨后每組取3只大鼠心尖組織置于10%甲醛固定液中用于石蠟切片制備，其余心肌組織于4℃生理鹽水中清洗去除血液后置于液氮中保存。本實(shí)驗(yàn)針對大鼠的所有操作都經(jīng)過軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所動物倫理委員會的審查和批準(zhǔn)。

1.2 總RNA提取及質(zhì)量控制

根據(jù)TRIzol試 劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）說明書從前述實(shí)驗(yàn)中凍存的6只大鼠心臟中提取總RNA，利用RNasey Mini Kit對RNA樣本進(jìn)行純化，最后采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳對總RNA完整性進(jìn)行評估，通過Nanodrop ND-1000（Nanodrop，Wilmington，de，USA）對每個樣本中的總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量驗(yàn)證。

1.3 芯片雜交分析

由Arraystar Technologies（Maryland，USA Rockville）設(shè)計并生產(chǎn)大鼠lncRNA芯片2.0 V（4×44k），根據(jù)Quick Amp Labeling Kit和One-Color試劑盒（Agilent，USA）說明書將1.2中提取的總RNA樣本進(jìn)行標(biāo)記并反轉(zhuǎn)為熒光cRNA，隨后純化并檢測cDNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù)Agilent Gene Expression Hybridization試劑盒（Agilent，USA）說明書進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，通過Agilent Scanner G2505C對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描，通過R（3.1.2版）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)

從芯片結(jié)果中選取6個差異性顯著的lncRNA（3個顯著上調(diào)，3個顯著下調(diào)）進(jìn)行驗(yàn)證，以GAPDH為內(nèi)參，利用Primer 5.0設(shè)計引物。用TRIzol試劑提取前述實(shí)驗(yàn)中凍存的心肌組織中總RNA，去除基因組DNA，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Thermo，US）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)（30℃10 min；42℃50 min）。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)主要儀器為Bio-Rad iq5（Bio-Rad，US）；主要試劑為Fast-Start Essential DNA Green Maste（Roche）qRT-PCR，條件為85℃10 min，每組六次平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 GO和KEGG分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）（http：//www.geneontology.org）分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個部分，使用Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，P（P＜0.05）值越小，GO項(xiàng)越顯著；京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https：//www.genome.jp/kegg/）用于描述差異性lncRNA可能參與的信號通路，P（P＜0.05）值越小，KEGG項(xiàng)越顯著。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 O3亞慢性暴露對大鼠心臟中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的影響

我們采用芯片雜交技術(shù)對O3亞慢性暴露后大鼠心臟中l(wèi)ncRNA表達(dá)變化情況進(jìn)行分析。箱式圖描述了臭氧暴露組與清潔空氣組數(shù)據(jù)分布情況，結(jié)果顯示六組數(shù)據(jù)分散情況基本一致（圖1A）。熱圖結(jié)果表明，與對照組相比，臭氧暴露組中大量lncRNA表達(dá)量發(fā)生改變（紅色為表達(dá)上調(diào)，綠色為表達(dá)下調(diào)，圖1B）?；鹕綀D結(jié)果顯示差異性lncRNA中顯著上調(diào)的有167個（紅色），顯著下調(diào)的有64個（綠色，圖1C）。

Fig.1 Overview of differentially expressed lncRNA

2.2 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達(dá)lncRNA分類

通過對差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行分類分析，結(jié)果顯示差異性上調(diào)的lncRNA中含量最多的是基因間lncRNA（灰色，34%）、外顯子有義重疊型lncRNA（橙色，32%）和內(nèi)含子有義重疊型lncRNA（黃色，21%）；差異性下調(diào)的lncRNA中含量最多的是基因間lncRNA（灰色，46%）、雙向型lncRNA（深藍(lán)色，22%）和外顯子有義重疊型lncRNA（橙色，20%）。在全部lncRNA中占比最多的是基因間lncRNA（灰色），最少的是天然反義型lncRNA（綠色，圖2）。

Fig.2 Classification of the differentially expressed lncRNA

2.3 差異表達(dá)lncRNA表達(dá)量驗(yàn)證

根據(jù)芯片雜交分析結(jié)果，我們利用qRT-PCR方法對表達(dá)變化最顯著的6個lncRNA（LOC102554403、LOC103693964、LOC108349594、LOC102554241、LOC102547903、LOC102552250）的表達(dá)趨勢進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果顯示，LOC102554403、LOC103693964和LOC108349594表達(dá) 上 調(diào)，LOC102554241、LOC102547903和LOC102552250表達(dá)下調(diào)，且變化倍數(shù)＞2，這一結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，即芯片結(jié)果可信（圖3）。

Fig.3 LncRNA expression level validated by microarray and qRT-PCR（±s，n=6）

2.4 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達(dá)lncRNA的GO分析

GO分析結(jié)果表明，顯著上調(diào)的lncRNA主要參于生長發(fā)育過程和細(xì)胞對外界刺激性的反應(yīng)；在細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；可能具有黏著功能（GO：0005488）和與其他物質(zhì)相結(jié)合的功能（表1）。

顯著下調(diào)的lncRNA主要參與細(xì)胞器定位（GO：0051640）和物質(zhì)分解代謝的過程；在細(xì)胞中主要定位于纖毛纖維過渡、濃縮的染色體外著絲粒和微管中；可能通過調(diào)節(jié)氧化還原酶活性發(fā)揮調(diào)控功能（表2）。

2.5 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達(dá)lncRNA的KEGG分析

KEGG分析結(jié)果表明顯著上調(diào)的lncRNA主要參與PI3K-Akt信號通路、脂肪酸降解、甲狀腺激素等信號通路；顯著下調(diào)的lncRNA主要參與各種維生素和主要供能物質(zhì)的代謝過程，并可能調(diào)控藥物代謝細(xì)胞色素P450等過程（表3）。

3 討論

O3是目前大氣污染中重點(diǎn)防治對象之一，O3對哺乳動物和人的影響主要集中于呼吸系統(tǒng)，研究表明O3急性暴露導(dǎo)致肺部發(fā)生廣泛性、持續(xù)性的炎癥，使機(jī)體免疫功能降低、肺上皮細(xì)胞增生和肺纖維化［3］。在本研究中我們采用芯片技術(shù)研究證實(shí)O3亞慢性暴露可導(dǎo)致大鼠心臟中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，顯著上調(diào)的lncRNA有167個，顯著下調(diào)的lncRNA有64個（FC≥1.5和P＜0.05），其中數(shù)量最多的是基因間lncRNA。

Tab.1 GO analysis for up-regulated lncRNA after ozone subchronic exposure

Tab.2 GO analysis for down-regulated lncRNA after ozone sub-chronic exposure

GO分析結(jié)果表明差異性上調(diào)的lncRNA可能主要參與生長發(fā)育過程，大量研究表明發(fā)育過程較為復(fù)雜的生物體內(nèi)的lncRNA可能通過RNA修飾參與調(diào)節(jié)生長發(fā)揮過程，與心臟發(fā)育密切相關(guān)的基因有Bvht、Fendrr等，其中l(wèi)ncRNA SRA1和Linc-MD可通過海綿作用調(diào)控細(xì)胞分化［7］，本研究也發(fā)現(xiàn)大量與發(fā)育相關(guān)的lncRNA，GO分析提示這些差異表達(dá)的lncRNA可能參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、器官生長發(fā)生或系統(tǒng)發(fā)育過程；此外還可能參與細(xì)胞對化學(xué)刺激和有機(jī)物刺激的應(yīng)激過程，有研究表明O3急性暴露可使神經(jīng)體液因子失調(diào)，這些神經(jīng)體液因子隨循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)全身各處，造成機(jī)體代謝紊亂，Miller DB等人的研究表明O3大多在呼吸道發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生大量應(yīng)激因子和脂質(zhì)代謝物，如IL-6、內(nèi)皮素、纖維蛋白原等，同時檢測結(jié)果表明循環(huán)系統(tǒng)中上述物質(zhì)表達(dá)量顯著升高［8］，而這些物質(zhì)在循環(huán)中的升高可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，造成血栓和動脈粥樣硬化［2］。

Tab.3 KEGG analysis for differentially expressed lncRNA after ozone sub-chronic exposure

KEGG分析結(jié)果表明差異性上調(diào)的lncRNA可能主要參與PI3K-Akt信號通路，有大量研究揭示PI3K-Akt信號通路在多種心臟疾病和功能損傷等病理進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，該通路的激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與增殖，氧化應(yīng)激激活該通路使心肌細(xì)胞凋亡加快［9］，敗血癥誘導(dǎo)的心臟功能障礙中PI3K和Akt去磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞炎癥與凋亡，在心肌肥大的研究中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mRNA信號通路活化后，可通過Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［9，10］。其次，差異性上調(diào)的lncRNA也可能參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，脂肪酸氧化分解可產(chǎn)生ATP，在成年心臟中脂肪酸是主要能量代謝物質(zhì)［11］，脂肪酸代謝超過一定的限度可抑制心臟糖酵解過程，從而導(dǎo)致能量供給不足，使心臟功能降低，在臨床治療中通常通過直接增加糖酵解或抑制脂肪酸代謝來改善心臟功能［12］，實(shí)驗(yàn)證明棕櫚酸酯可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心肌細(xì)胞死亡相關(guān)基因、蛋白質(zhì)表達(dá)升高［13］，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以假設(shè)O3暴露可能通過線粒體氧化應(yīng)激途徑對心臟造成損傷；近年來有體外實(shí)驗(yàn)證明lncRNA參與調(diào)控脂肪酸代謝過程，LINC00473在脂肪細(xì)胞中特異性表達(dá)，該基因的表達(dá)量與線粒體氧化代謝能力相關(guān)，在調(diào)節(jié)脂肪酸解代謝也有重要作用，核lncRNA Blinc1參與調(diào)控生熱脂肪細(xì)胞的發(fā)育，lncBATE10通過抑制Ppargc1a mRNA基因的表達(dá)使細(xì)胞產(chǎn)熱［14］。

差異表達(dá)下調(diào)的lncRNA可能主要參與氨基酸代謝過程，心臟可以分泌大量谷氨酸和丙氨酸，有研究表明支鏈氨基酸分解代謝受損使心臟更容易發(fā)生缺血/再灌注損傷，這主要是通過抑制小鼠體內(nèi)葡萄糖代謝和O-GlcNAc的蛋白修飾來實(shí)現(xiàn)的［15］；γ-氨基丁酸主要參與調(diào)節(jié)心血管生理病理進(jìn)程，在慢性心力衰竭患者血中總氨基酸和多種分類氨基酸含量均降低，其中天冬氨酸、蛋氨酸和牛黃酸含量與心臟功能衰減程度有正相關(guān)關(guān)系［16］。谷氨酰胺是癌癥細(xì)胞中重要的能量代謝物質(zhì)，lncRNA可調(diào)節(jié)癌癥中谷氨酰胺代謝，如肝內(nèi)膽管癌中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá)升高與該疾病愈后差密切相關(guān)，抑制lncRNA TUG1表達(dá)后谷氨酰胺消耗和能量產(chǎn)生顯著減少，lncRNA EPB41L4A-AS1表達(dá)量降低可使HeLa和HepG2細(xì)胞對谷氨酰胺的依賴性增強(qiáng)，同時加快谷氨酰胺的代謝，在膀胱癌細(xì)胞中抑制lincRNA-p21的表達(dá)也可以使谷氨酰胺代謝加速，而過表達(dá)lincRNA-p21可抑制癌細(xì)胞增殖［17］。

KEGG分析結(jié)果表明差異性下調(diào)的lncRNA主要參與維生素的調(diào)節(jié)，流行病學(xué)研究和大量實(shí)驗(yàn)研究證明維生素D在心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中有重要作用［18］，25-OH D水平降低可激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)和左心室心肌肥厚，體內(nèi)維生素D不足與心血管疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，Zhou等人研究發(fā)現(xiàn)缺乏維生素D可增加人群心血管疾病發(fā)病風(fēng)險，維生素D水平過低的患者發(fā)生心臟病的風(fēng)險更高，而且該人群血壓更高［19］。維生素E是一種重要的脂溶性抗氧化劑，流行病學(xué)研究、體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明維生素E升高可抑制低密度脂蛋白氧化所誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)一步發(fā)展［20］，這為維生素E治療與脂質(zhì)氧化相關(guān)心血管疾病提供重要數(shù)據(jù)支撐。

我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的大量lncRNA可能參與調(diào)節(jié)心臟中能量和營養(yǎng)物質(zhì)代謝，目前對營養(yǎng)物質(zhì)在心血管疾病中的研究僅是冰山一角，需要深入研究，并且營養(yǎng)素補(bǔ)充對疾病的治療在用量和方法上都難以從動物試驗(yàn)中推廣到人群實(shí)驗(yàn)中。lncRNA在心臟中的研究在功能和調(diào)控機(jī)制尚未闡述完全，由于ln-cRNA保守性差，因此動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果向臨床試驗(yàn)外推十分困難，lncRNA在臨床治療方面尚處空白階段，因此對心臟中l(wèi)ncRNA功能和調(diào)控機(jī)制研究十分必要，而我們的研究對治療心臟疾病的可能有重大推進(jìn)作用。