胡 戈，曹建民，周海濤，張 靜，田一鳴，宋瀅洋，蔣若雨

（1.常州大學(xué) 體育學(xué)院，常州 213164；2.北京體育大學(xué) 運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；3.北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100101；4.北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

我國飲酒人群比例和酒精性肝病患病率均呈現(xiàn)上升趨勢，嚴(yán)重危害人民健康［1］。慢性炎癥是酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵誘因，薈萃研究表明，慢性酒精攝入可導(dǎo)致Toll樣受體4（toll-like receptors4，TLR4）/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號激活，從基因水平增加多種促炎細(xì)胞因子表達(dá)，繼而誘發(fā)肝臟損傷［2］。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）具有多種活性成分，以往研究多聚焦于其抗氧化作用［3，4］。相關(guān)研究表明，黑果枸杞具有降低血清炎癥因子水平，保護(hù)肝臟結(jié)構(gòu)和功能的潛在作用［5］。本研究通過建立酒精性肝損傷大鼠模型，探討黑果枸杞汁通過介導(dǎo)TLR4/p38 MAPK信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性因子水平，預(yù)防和緩解酒精性肝損傷發(fā)生與發(fā)展，保護(hù)肝臟結(jié)構(gòu)和功能正常的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

60只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體重170～200 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2019-0010。北京體育大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度20～24℃，相對濕度55%～75%，正常晝夜節(jié)律。經(jīng)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為5組：對照組（C）、模型組（M）、低劑量黑果枸杞汁組（LLM）、中劑量黑果枸杞汁組（MLM）、高劑量黑果枸杞汁組（HLM），每組12只。

1.2 儀器

主要儀器包括RM 2016病理切片機(jī)（德國Leica公司）；Pannoramic MIDI病理切片掃描儀（匈牙利3D HISTECH公司）；BX51F32H01光學(xué)顯微鏡（日本Olympus Corporation）；DR-200BS酶標(biāo)分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）；Allegra 25R臺式高速離心機(jī)、AU480生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 模型建立與營養(yǎng)干預(yù)方案

1.3.1 酒精性肝損傷模型建立［6］62°牛欄山二鍋頭，稀釋成400 g/L乙醇溶液，M組、LLM組、MLM組和HLM組灌胃劑量8 g/（kg·d），體積20 ml/kg，于13：00和19：00分2次完成，C組灌胃等體積蒸餾水，每日進(jìn)行。

1.3.2 營養(yǎng)干預(yù)方案 黑果枸杞汁（原花青素2.08%，多糖4.9%，總花色苷3.2%，深圳金瑞豐生物科技公司提供）。LLM組、MLM組和HLM組分別以2.4、4.8和9.6 ml/（kg·d）（相當(dāng)于人體推薦劑量的0.5、1.0、2.0倍）進(jìn)行黑果枸杞汁灌胃，C組和M組灌胃等體積蒸餾水，灌胃時間為每日上午9：00。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物取材

實(shí)驗(yàn)共4周，末次灌胃后24 h，烏拉坦麻醉大鼠后稱取體重，腹主動脈取血，室溫自然凝固，4℃離心10 min，3 000 r/min，提取血清，-20℃保存。取出肝臟，置于預(yù)冷生理鹽水沖洗，吸干后稱重。切取合適大小肝左葉，4%多聚甲醛固定。其余肝葉分裝后液氮凍存，取材結(jié)束后移至-80℃冰箱保存。

1.5 肝臟指數(shù)計算

分別稱取大鼠肝臟質(zhì)量和體質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)（%）=肝臟質(zhì)量（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%

1.6 肝臟病理評價

固定后的肝臟組織經(jīng)脫水、透明、包埋、切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，光鏡下（200×）觀察肝臟病理變化。

1.7 蛋白質(zhì)免疫組化分析

石蠟切片脫蠟后，經(jīng)抗原修復(fù)、過氧化物酶阻斷、一抗及二抗孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色、細(xì)胞核復(fù)染，最后完成脫水封片。TLR4抗體由美國Santa Cruz公司提供，稀釋比為1∶50；p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK）抗體由美國Sigma公司提供，稀釋比分別為1∶100和1∶50；山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗由武漢Servicebio公司提供，稀釋比為1∶200。經(jīng)全視野數(shù)字掃描整張組織切片，細(xì)胞核顏色為深棕色、棕黃色和淺黃色分判定為強(qiáng)陽性、中度陽性和弱陽性，細(xì)胞核藍(lán)色為陰性，依據(jù)陽性強(qiáng)弱關(guān)系計算組織化學(xué)評分（histochemistry score，Hscore）［7］用于組間分析。H-score=（弱陽性細(xì)胞密度×1）+（中度陽性細(xì)胞密度×2）+（強(qiáng)陽性細(xì)胞密度×3）。

1.8 其他指標(biāo)測試方法

采用全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定肝臟腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）水平。相關(guān)試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重和肝臟指數(shù)

與C組相比，M組體重顯著降低（P＜0.05）；與M組相比，LLM、MLM、HLM組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與C組相比，M組肝臟重量顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，LLM組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），MLM和HLM組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與C組相比，M組肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，LLM和MLM組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），HLM組顯著降低（P＜0.05）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表1）。

Tab.1 Body weight and liver index in each group（±s，n=12）

Tab.1 Body weight and liver index in each group（±s，n=12）

C：Control group；M：Model group；LLM：Low-dose Lycium ruthenicum Murr.juice group；MLM：Medium-dose Lycium ruthenicum Murr.juice group；HLM：High-dose Lycium ruthenicum Murr.juice group *P＜0.05，**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05 vs group LLM

Group Body weight（g）Liver weight（g）Liver index（%）C 304.16±15.45 9.40±0.45 3.10±0.27 M 277.31±34.74*11.69±0.75**4.29±0.72**LLM 256.74±16.18 11.12±0.87 4.35±0.49 MLM 255.17±11.58 10.75±0.54#4.22±0.25 HLM 267.88±18.86 10.03±0.71##△3.75±0.33#△

2.2 各組大鼠肝臟損傷標(biāo)志物活性

肝臟損傷標(biāo)志物血清ALT活性，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，HLM組顯著降低（P＜0.05），其余兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。血清AST活性，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，LLM、MLM、HLM組均顯著降低（P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表2）。

Tab.2 Indicators of liver injury in each group（U/L，±s，n=12）

Tab.2 Indicators of liver injury in each group（U/L，±s，n=12）

**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05 vs group LLM

Group ALT AST C 31.50±2.77 130.48±23.14 M 48.56±7.40** 233.23±39.98**LLM 44.16±9.34 181.12±16.59##MLM 40.00±9.06 161.97±28.16##HLM 35.28±7.88# 140.58±27.38##△

2.3 各組大鼠肝臟組織形態(tài)

200倍光鏡下觀察顯示（圖1），C組肝細(xì)胞排列規(guī)則，無變性、壞死及空泡化，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝血竇無淤血，無炎性細(xì)胞浸潤。M組肝細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)空泡化，肝血竇擴(kuò)張，血管周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞聚集，形成大量炎性小灶。LLM組無明顯改善，仍可見空泡化肝細(xì)胞和眾多炎性小灶。MLM組偶見肝細(xì)胞空泡化，肝血竇擴(kuò)張情況有所緩解，可見炎性細(xì)胞聚集。HLM組肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝血竇無明顯擴(kuò)張，僅少量炎性細(xì)胞浸潤。

Fig.1 Hepatic histopathological changes in each group（HE×200）

2.4 各組大鼠肝臟TLR4/p38 MAPK通路相關(guān)蛋白質(zhì)水平

肝臟TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.01），其余兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。p38 MAPK蛋白質(zhì)表達(dá)，各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。p38 MAPK磷酸化水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.05），其余兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。p-p38 MAPK/p38 MAPK結(jié)果，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，LLM組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），MLM和HLM組均顯著降低（P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.01），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3，圖2-4）。

Tab.3 H-score of hepatic TLR4/p38 MAPK signaling pathway-related proteins in each group（±s，n=12）

Tab.3 H-score of hepatic TLR4/p38 MAPK signaling pathway-related proteins in each group（±s，n=12）

**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs group LLM

Group TLR4 p38 MAPK p-p38 MAPK p-p38 MAPK/p38 MAPK C 94.75±4.33 124.29±4.79 105.35±7.28 0.85±0.03 M 119.57±8.94** 129.09±7.96 133.06±12.01** 1.03±0.03**LLM 115.53±6.26 129.51±7.85 127.99±9.76 0.99±0.02 MLM 110.58±5.92 127.36±4.20 120.39±10.81 0.94±0.06##HLM 101.48±7.63##△ 127.25±6.98 113.80±6.22# 0.89±0.01##△△

Fig.2 Expression of hepatic TLR4 in each group（IHC-P×400）

Fig.3 Expression of hepatic p38 MAPK in each group（IHCP×400）

2.5 各組大鼠肝臟炎癥因子水平

Fig.4 Expression of hepatic p-p38 MAPK in each group（IHC-P×400）

肝臟TNF-α水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.01），其余兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。IL-1β水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.05），其余兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。IL-10水平，與C組相比，M組顯著降低（P＜0.01）；與M組相比，LLM、MLM和HLM組均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；不同劑量組組間，MLM組顯著高于LLM組（P＜0.05），HLM組顯著高于LLM和MLM組（P＜0.05或P＜0.01）。IL-18水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，LML組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），MLM和HLM組均顯著降低（P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.01），其余組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表4）。

3 討論

乙醇（酒精）是一種極性分子物質(zhì)，可溶于水和脂質(zhì)，攝入后通過胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，吸收后的酒精超過95%通過肝臟代謝，長期過量飲酒是造成肝臟疾病發(fā)生的主要原因，酒精性肝病已成為我國最主要的慢性肝臟疾病之一［1］。酒精及其代謝物可以直接或間接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及蛋白質(zhì)營養(yǎng)失衡等多種病理生理過程，這些因素相互作用，最終導(dǎo)致酒精性肝病的發(fā)生［2，8］。血清ALT和AST是評價肝臟功能的常用早期指標(biāo)［1］。本研究中，模型組血清ALT和AST水平、肝臟指數(shù)較對照組顯著升高，且體重下降明顯，結(jié)合病理診斷，提示模型組大鼠出現(xiàn)酒精性肝臟損傷，模型建立成功。而黑果枸杞汁各劑量組與模型組相比，血清ALT和AST、肝臟指數(shù)及組織形態(tài)均出現(xiàn)不同程度改善，提示黑果枸杞汁能夠在一定程度上緩解酒精對大鼠肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。這與同類型研究的結(jié)果基本一致［9，10］。

Tab.4 Hepatic inflammatory factors in each group（pg/mg，±s，n=12）

Tab.4 Hepatic inflammatory factors in each group（pg/mg，±s，n=12）

**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs group LLM；▲P＜0.05 vs group MLM

Group TNF-α IL-1β IL-10 IL-18 C 6.18±0.09 2.78±0.17 2.68±0.14 8.39±0.29 M 6.81±0.33** 3.27±0.24** 1.51±0.21** 9.34±0.20**LLM 6.75±0.25 3.18±0.20 1.82±0.19# 9.06±0.19 MLM 6.56±0.31 3.04±0.29 2.14±0.15##△ 8.84±0.19##HLM 6.28±0.28##△ 2.92±0.24# 2.45±0.22##△△▲ 8.60±0.22##△△

TLR4屬于I型跨膜受體蛋白，酒精可以通過其代謝物乙醛直接上調(diào)TLR4通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，也可通過損害腸道屏障功能，提高脂多糖水平，過量的脂多糖引起TLR4二聚化，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終激活下游信號蛋白，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β和IL-18等多種炎性細(xì)胞因子的激活和分泌［11，12］。p38 MAPK能夠?qū)Χ喾N應(yīng)激刺激產(chǎn)生廣泛應(yīng)答，是與炎癥反應(yīng)有關(guān)的重要細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，與炎癥調(diào)節(jié)和控制機(jī)制密切相關(guān)，對于調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)水平至關(guān)重要。蔣偉等［13］的研究表明，TLR4激活后，可以引起p-p38 MAPK表達(dá)增加。而慢性酒精攝入所致脂多糖增加，也可引起磷酸化p38 MAPK上調(diào)，穩(wěn)定TNF-α的mRNA水平［14］。本研究中，模型組TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)和p38 MAPK磷酸化水平以及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均顯著高于對照組，且TNF-α、IL-1β和IL-18水平顯著升高，表明酒精通過活化TLR4/p38 MAPK信號通路，引起肝臟炎癥水平升高。

研究表明，慢性酒精喂養(yǎng)不會導(dǎo)致TLR4基因缺陷小鼠肝臟中TNF-α和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表達(dá)增加［15］。而通過抑制p38 MAPK表達(dá)，可以降低長期乙醇喂養(yǎng)大鼠枯否細(xì)胞中TNFα的表達(dá)［16］。IL-10作為一種抗炎因子，可以阻斷巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生［17］。上述炎癥信號途徑中的關(guān)鍵分子均可成為酒精性肝臟損傷的有效干預(yù)靶點(diǎn)。黑果枸杞含有花色苷、原花青素、多糖等多種活性成分。相關(guān)研究表明，黑果枸杞可降低血清中TNF-α和IL-6水平，對酒精性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用［9，10］。也可通過抑制腦組織中TLR4通路信號因子，下調(diào)TNF-α表達(dá)，上調(diào)IL-10表達(dá)［18］。本研究中，與模型組相比，黑果枸杞汁高劑量組肝臟TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)、p38 MAPK磷酸化水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值以及TNF-α、IL-1β和IL-18水平顯著降低，肝臟IL-10水平顯著升高，同時肝臟損傷標(biāo)志物ALT、AST水平顯著下降，結(jié)合組織病理學(xué)變化，說明肝臟形態(tài)/功能明顯改善。黑果枸杞汁各劑量組間比較，高劑量組較低劑量組肝臟系數(shù)、血清AST、肝臟TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、TNF-α和IL-18水平均顯著降低，肝臟IL-10水平顯著升高；高劑量組較中劑量組肝臟IL-10水平顯著升高；中劑量組較低劑量組肝臟IL-10水平顯著升高。機(jī)制可能為：相對于干果，黑果枸杞汁在加工過程中營養(yǎng)成分損失較少，其富含的多種活性物質(zhì)可通過抑制TLR4/p38 MAPK通路信號強(qiáng)度，改善促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子間平衡關(guān)系，緩解酒精代謝引起的炎性損傷，發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

綜上，本研究成功建立酒精性肝損傷大鼠模型，黑果枸杞汁可通過介導(dǎo)TLR4/p38 MAPK信號通路，調(diào)節(jié)肝臟炎性因子水平，改善大鼠酒精性肝臟損傷，保護(hù)肝臟結(jié)構(gòu)和功能正常，且高劑量組效果最優(yōu)。