崔小凡，杜椅楠，孫世廣，韓佳潤，閻佳楠，姜昕昱，李傲婷，吳海濤

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034）

扇貝（Patinopecten yessoensis）屬雙殼軟體動物，具有豐富的營養(yǎng)價值。2018年，中國扇貝的水產(chǎn)養(yǎng)殖總量高達(dá)192 萬t。近年來，扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，在其加工過程中，裙邊大多作為副產(chǎn)物被丟棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。

大量研究表明酶解可有效回收水產(chǎn)品副產(chǎn)物的功能成分，其水解產(chǎn)物大多具有良好的抗氧化能力[1]，前期研究表明[2]，扇貝裙邊中富含豐富的蛋白質(zhì)，可以通過酶解方式來制備其功能性酶解產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝的肌肉[2]、扇貝邊[3]和馬氏珠母貝肉的酶解物[4]均具有良好的自由基清除能力。然而，有關(guān)蝦夷扇貝雄性生殖腺酶解產(chǎn)物抗氧化能力的研究未見報(bào)道。

美拉德反應(yīng)是在加熱過程中肽、蛋白質(zhì)、氨基酸與還原糖之間的反應(yīng)，其所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)會進(jìn)一步影響食品風(fēng)味[5]。此外，一些研究表明，美拉德反應(yīng)可以用來提高大豆蛋白酶解物[6]、海參腸酶解物[7]、鯛魚鱗多肽[8]和牡蠣酶解物[9]的抗氧化活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)有效增強(qiáng)了櫛孔扇貝裙邊酶解物的羥自由基和ABTS 自由基清除能力[10]。美拉德反應(yīng)對蝦夷扇貝裙邊酶解物抗氧化活性的影響有待研究。

本文用蝦夷扇貝裙邊酶解物和核糖制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，探究反應(yīng)過程中中間體物質(zhì)的形成，顏色和揮發(fā)性化合物的變化。此外，探究酶解物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基、DPPH 和ABTS 自由基清除能力，為蝦夷扇貝裙邊蛋白的高值化利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及主要試劑

蝦夷扇貝，購自大連長興市場；中性蛋白酶，購自南寧龐博生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和購自美國Sigma-Aldrich 公司；核糖、木瓜蛋白酶、L-酪氨酸、EDTANa2，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO），購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT），購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；其它試劑均為生化試劑或分析純級。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子順磁共振波譜儀（ESR），購自德國Bruker BioSpin 公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，購自安捷倫（中國）科技有限公司；高速低溫離心機(jī)，購自HITACHI；精密電子天平，購自美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司；精密pH 計(jì)，購自上海雷磁儀器廠；酶標(biāo)定量測定儀，購自TECAN；紫外-可見分光光度計(jì)，購自上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備蝦夷扇貝裙邊凍干粉 蝦夷扇貝裙邊經(jīng)沸水浴10 min 變性處理后冷凍干燥，粉碎后于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE 分析 參照Zhao 等[11]的方法對蝦夷扇貝裙邊凍干粉的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析。用1×上樣緩沖液制備蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的樣品溶液，經(jīng)沸水浴10 min 后搖動12 h，將蛋白質(zhì)樣品（10 μL）加載到聚丙烯酰胺凝膠中（5%的濃縮膠，10%的分離膠）進(jìn)行分析，濃縮膠電流為7 mA，分離膠電流為15 mA。試驗(yàn)結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)G250 染色液對凝膠進(jìn)行染色，脫色后成像。

1.3.3 制備蝦夷扇貝裙邊酶解物 采用中性蛋白酶（酶活為204 326 U/g）對蝦夷扇貝裙邊凍干粉進(jìn)行酶解，酶解條件為：加酶量3 000 U/g 蛋白、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、pH 7.0、酶解溫度50 ℃，酶解時間分別為0.5，1，2，3 h。酶解后的溶液于沸水浴10 min 后離心4 000×g，10 min，將上清液收集后冷凍干燥，制得不同酶解時間的蝦夷扇貝裙邊酶解物（SMHs）并通過pH-stat 法計(jì)算其水解度（DH）[12]，其計(jì)算公式如下：

式中，B——保持pH 不變所消耗堿（NaOH）的體積，mL；Nb——堿的物質(zhì)的量濃度，mol/L；Mp——底物中蛋白總量，g；htot——底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g，其中本研究中htot為7.5；α——水解過程中α-氨基的解離度，具體計(jì)算公式如下：

式中，pH——溶液的酸堿度；pK——電離平衡常數(shù)。

1.3.4 制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物 用去離子水配制20 mg/mL 的酶解物溶液和40 mg/mL 的核糖溶液，將兩種溶液按體積比1∶1 混合后調(diào)至pH 7.0，分裝于4 mL 旋蓋玻璃瓶中，然后置于干浴器中在95 ℃條件下加熱4 h 或12 h 以獲得蝦夷扇貝裙邊酶解物-核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs），將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物冷凍干燥后于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度 將制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液用去離子水稀釋到合適倍數(shù)后用紫外分光光度計(jì)測定其在波長294 nm （稀釋100 倍）和420 nm（稀釋5 倍）處的吸光值。

1.3.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)組成 取3 mL 美拉德產(chǎn)物原液于10 mL 分析小瓶中，加入20 μL 的內(nèi)標(biāo)物（環(huán)己酮，100 mg/L） 后通過HSSPME/GC/MS 進(jìn)行檢測，色譜柱為HP-5MS 5%聚苯基甲基硅氧烷30 m×250 μm×0.25 μm，升溫程序?yàn)椋撼鯗?5 ℃，保持3 min；以3 ℃/min 的速度升溫到70 ℃，以10 ℃/min 的速度升溫至200℃，以20 ℃/min 的速度升溫至260 ℃，保持5 min；分流進(jìn)樣，載氣流量（He）為l.5 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。掃描條件為：全譜掃描：質(zhì)量掃描范圍29～400 amu；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃。

1.3.7 DPPH 自由基的清除能力測定 利用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（pH 6.0，0.1 mol/L）配制不同的樣品溶液，取300 μL 樣品溶液與200 μL DPPH（200 μmol/L）溶液混合均勻后避光反應(yīng)30 min，2 000×g 離心10 min 后收集上清，轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管中，將毛細(xì)管的一端用凡士林封口后，放入諧振腔中檢測其ESR 波譜，測試條件為：中心磁場強(qiáng)度3 317.71 G，微波功率5.07 mW，微波頻率0.44 GHz，調(diào)制幅度1.00 G，調(diào)制頻率為100.00 kHz，時間常數(shù)327.68 ms，轉(zhuǎn)換時間160.00 ms。同時以BHT 為對照，DPPH 的清除率（E）的計(jì)算公式如下：

式中，ho——將PBS 溶液替代樣品溶液后測得ESR 圖譜中間最高峰的峰高；hx——樣品溶液測得的ESR 圖譜中間最高峰的峰高。

1.3.8 羥自由基清除能力測定 參照Wu 等[13]方法對蝦夷扇貝酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除能力進(jìn)行檢測。利用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，0.15 mol/L）配制不同的樣品溶液。取樣品溶液78 μL，DMPO 溶液（1 mmol/L）5 μL，EDTANa2和FeSO4混合液 （6 mmol/L）10 μL，H2O2（6%）8 μL，混合均勻于40 ℃條件下反應(yīng)30 min 后轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中，將毛細(xì)管的一端用凡士林封口后，放入諧振腔中檢測羥自由基信號譜圖，測試條件為中心磁場強(qiáng)度3 368.99 G，微波功率0.721 mW，微波頻率9.44 GHz，調(diào)制幅度1.00 G，調(diào)制頻率為100 kHz，時間常數(shù)81.92 ms，轉(zhuǎn)換時間40 ms，同時以維生素C 為對照，羥自由基清除率（E）計(jì)算公式如下：

式中，h1——將PBS 溶液替代樣品溶液后測得ESR 圖譜中第2 個峰的峰高；h2——樣品溶液測得的ESR 圖譜中第2 個峰的峰高。

1.3.9 ABTS 自由基清除能力測定 參照Han 等[10]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。將過硫酸鉀 （2.4 mmol/L）與ABTS 溶液（7.0 mmol/L）按照體積比1∶1 的比例混合均勻后于室溫下避光反應(yīng)12 h 制備ABTS 自由基儲備液。使用前以pH 7.4 的PBS 溶液（0.2 mol/L） 為溶劑稀釋ABTS 自由基儲備溶液至波長734 nm 處吸光值為0.7±0.02。將10 μL 樣品溶液與1 mL 稀釋后的ABTS 溶液混合避光反應(yīng)6 min 后在波長734 nm 處測定其吸光值并使用如下公式計(jì)算樣品的ABTS 自由基清除率（S）：

式中，A0——超純水代的吸光值；As——樣品的吸光值。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用http：//www.physics.csbsju.edu/stats/t-test.html 在線軟件進(jìn)行student's t 檢驗(yàn)，P<0.05 表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果討論

2.1 蝦夷扇貝裙邊蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布

凱氏定氮結(jié)果表明，蝦夷扇貝裙邊凍干粉中含有約77%的蛋白質(zhì)。由圖1可知，蝦夷扇貝裙邊中蛋白質(zhì)主要分布于200 ku （肌球蛋白重鏈），97 ku（副肌球蛋白）和42 ku（肌動蛋白）。肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是水產(chǎn)動物中常見的蛋白質(zhì)組分，比如竹莢魚（Trachurus trachurus）[14]和大黃魚[15]。Nozawa 等[16]發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝肌肉中的蛋白質(zhì)組分主要分布在230，210，100 ku 和45 ku。此外，分子質(zhì)量約為97～110 ku 的副肌球蛋白也廣泛存在于海洋動物肌肉中[17]，比如章魚[18]和海參[11]。

圖1 蝦夷扇貝裙邊的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE of scallop （P.yessoensis） mantle

2.2 蝦夷扇貝裙邊的酶解曲線

由圖2所示，在酶解前30 min 內(nèi)水解度快速上升，分別達(dá)到了17.33%和8.37%，在30～120 min 緩慢升高，120 min 后趨于穩(wěn)定。在水解3 h后，蝦夷扇貝裙邊酶解物的水解度（DH）達(dá)到28.95%。Wu 等[13]也發(fā)現(xiàn)用中性蛋白酶酶解蝦夷扇貝雌性生殖腺3 h 后，其水解度能夠達(dá)到34.25%，這些結(jié)果表明中性蛋白酶對蝦夷扇貝裙邊具有良好的酶解作用。

圖2 蝦夷扇貝裙邊粉酶解過程中的水解度曲線Fig.2 DH curve of scallop （P.yessoensis）skirt powder in the process of hydrolysis

2.3 蝦夷扇貝裙邊酶解物-核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸光度及褐變程度

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在波長294 nm 和420 nm 處的吸光值可以分別用來表示美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的生成和褐變程度。如圖3a 所示，隨著加熱時間的延長，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在波長294 nm 下的吸光度顯著升高，加熱4 h 和12 h 后獲得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度是酶解物的3.33 倍和10.67 倍。海參腸酶解物-核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物也呈現(xiàn)出了相似的結(jié)果[7]。

褐變程度也經(jīng)常用來表征食物的美拉德反應(yīng)程度。由圖3b 所示，加熱時間為0 h 的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在波長420 nm 處的吸光值僅有0.07，然而，加熱4 h 和12 h 后，吸光度顯著增加，尤其是加熱12 h 后美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度是未加熱的13 倍。Sun 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雞肉副產(chǎn)物的MRPs褐變程度隨著加熱時間延長而增大。這些結(jié)果表明在美拉德反應(yīng)過程中，有大量的中間產(chǎn)物和褐色物質(zhì)生成。

圖3 蝦夷扇貝裙邊酶解物-核糖美拉德產(chǎn)物在294 nm（a）、420nm（b）的UV 吸光度Fig.3 The UV-vis spectra of the MRPs of scallop （P.yessoensis） skirt hydrolysates were obtained at 294 nm （a） and 420 nm （b）

2.4 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析

利用GC-MS 對酶解物及其美拉德產(chǎn)物的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，酶解物中只有25 種揮發(fā)性成分，包括13 種醛類、3 種酮類、1種醇類、1 種酸類、1 種酯類、3 種雜環(huán)類和3 種烷烴類，而美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性成分分別達(dá)到32 種（美拉德反應(yīng)4 h）和30 種（美拉德反應(yīng)12 h），與酶解物相比，經(jīng)美拉德反應(yīng)后有1 種醛類、2種酮類、6 種醇類、4 種酯類、11 種雜環(huán)類和2 種烷烴類生成。此外不同加熱時間獲得的美拉德產(chǎn)物，生成的風(fēng)味物質(zhì)組成也有差異。由表1可知，雜環(huán)化合物的含量隨著反應(yīng)時間的增加而升高，尤其是糠醛（美拉德反應(yīng)的標(biāo)志性產(chǎn)物[20]）。經(jīng)美拉德反應(yīng)4 h 后醇類的種類增加，但繼續(xù)進(jìn)行美拉德反應(yīng)至12 h 時，醇類的種類呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能是由于長時間的加熱導(dǎo)致醇類物質(zhì)的揮發(fā)，使其檢出量降低[21]。

醛是蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物中的主要揮發(fā)性成分。苯甲醛與甜味、果味、焦糖味有關(guān)[22]。在蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物中共鑒定出了5 種酮，這些酮可以散發(fā)出令人愉悅的氣味[23]。此外，其它揮發(fā)性化合物也可以改善食品的風(fēng)味，例如苯甲醛（水果味、甜味）和1，1-十二烷二醇（水果味），這些結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)可以用來改善蝦夷扇貝裙邊酶解物的風(fēng)味。

由表1可知，雜環(huán)化合物是12 h 后美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的主要風(fēng)味物質(zhì)，尤其是糠醛，含量最高。Han 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，糠醛含量與美拉德產(chǎn)物DPPH 自由基清除能力之間的相關(guān)系數(shù)為0.958。此外，美拉德反應(yīng)后2H-吡喃-6-羧酰胺2H-吡喃-2-酮的含量也明顯增加，這可能也會改善其自由基清除能力[7]。蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物的自由基清除能力需要進(jìn)一步研究。

表1 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物的GC-MS 分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis result of the scallop （P.yessoensis） mantle hydrolysates and MRPs

（續(xù)表1）

2.5 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的自由基清除能力

2.5.1 羥自由基的清除能力 羥自由基是重要的活性氧，具有很強(qiáng)的氧化能力。進(jìn)一步通過ESR的方法來檢測蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除能力[13]。由圖4可知在同一酶解時間下，羥自由基清除能力呈現(xiàn)MRPs-12 h>MRPs-4 h>SMHs 的趨勢，并且酶解1 h 以后，酶解物本身的羥自由基清除能力也顯著提高。另外，美拉德反應(yīng)12 h 后獲得的反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除能力是酶解物的1.51～1.80 倍。通過酶解3 h 后的酶解物及其相應(yīng)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ESR信號可以看出，酶解物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ESR信號強(qiáng)度均顯著下降，且隨著美拉德反應(yīng)時間延長，信號強(qiáng)度降低的越明顯，這與櫛孔扇貝裙邊酶解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的研究結(jié)果一致[24]。這些結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)可以有助于提高蝦夷扇貝裙邊酶解物的羥自由基清除能力。

圖4 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除能力和ESR 圖譜Fig.4 Hydroxyl radical scavenging capacity and the ESR spectra of the scallop （P.yessoensis） mantle hydrolysates and MRPs

2.5.2 DPPH 自由基清除能力 圖5顯示了在不同酶解時間下，蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力。低濃度的酶解物在不同酶解時間下DPPH 自由基清除能力均為0%，無明顯DPPH 自由基清除能力。然而，經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，MRPs 表現(xiàn)出了較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。此外，酶解1～3 h 后的酶解物對應(yīng)的美拉德產(chǎn)物具有更高的DPPH 自由基清除能力。通過酶解3 h 后的酶解物及其相應(yīng)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ESR 信號可以看出，酶解物的ESR 信號強(qiáng)度與空白組相比沒有明顯變化，而美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ESR 信號強(qiáng)度顯著下降，且隨著美拉德反應(yīng)時間延長，信號強(qiáng)度降低的越明顯。進(jìn)一步對蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凍干后分析，發(fā)現(xiàn)其IC50值分別為10.3（SMHs），0.57 mg/mL（MRPs-4 h）和0.37 mg/mL（MRPs-12 h），均高于BHT（0.016 mg/mL）。

圖5 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力和ESR 圖譜Fig.5 DPPH radical scavenging capacity and the ESR spectra of the scallop （P.yessoensis）mantle hydrolysates and MRPs

2.5.3 ABTS 自由基的清除能力 圖6顯示了蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力。在同一酶解時間下，ABTS 自由基清除能力呈現(xiàn)MRPs-12 h>MRPs-4 h>SMHs的趨勢，并且酶解1 h 以后，酶解物本身的ABTS自由基清除能力也顯著提高。酶解3 h 后獲得的酶解物具有最高的ABTS 由基清除能力（31.64%）。此外，經(jīng)美拉德反應(yīng)后，不同酶解時間獲得的酶解物的ABTS 自由基清除能力均有了顯著提高，其中美拉德反應(yīng)12 h 獲得的酶解物的ABTS 自由基清除能力是酶解物的2.18～2.49 倍，海參腸酶解物-核糖美拉德產(chǎn)物也顯示出相似的結(jié)果[25]。綜上，美拉德反應(yīng)可以用作提高蝦夷扇貝裙邊酶解物抗氧化能力的有效方法。

圖6 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ABTS 自由基清除能力Fig.6 The ABTS radical scavenging capacity of the scallop （P.yessoensis） mantle hydrolysates and MRPs

3 結(jié)論

美拉德反應(yīng)后，蝦夷扇貝裙邊酶解物的中間產(chǎn)物數(shù)量、褐變程度和風(fēng)味物質(zhì)均有所增加。并且其羥自由基、DPPH 和ABTS 自由基清除能力也得到顯著改善。綜上，美拉德反應(yīng)可用于增強(qiáng)蝦夷扇貝裙邊酶解物的自由基清除能力，而蝦夷扇貝裙邊酶解物的美拉德反應(yīng)與自由基清除能力之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。