戚 斌，解天慧，石 慧

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 重慶 400715）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，人們在食用受污染的肉類、牛奶和雞蛋時可能感染沙門氏菌，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、頭痛，甚至死亡[1]。2019年，歐洲確診了近88 000 例人類沙門氏菌病病例。在美國，沙門氏菌每年導(dǎo)致大約135 萬人感染、26 500 人住院和420 人死亡。在中國，80%～90%的食源性細菌中毒事件是由沙門氏菌引起的[2-3]。為了避免沙門氏菌對食品安全造成嚴重的影響，人們采取積極的措施來預(yù)防和控制。例如，使用有機酸、水蒸氣等傳統(tǒng)的方法來殺滅食品表面的沙門氏菌，然而，這樣會改變食品的感官特性，而且還有可能在食品上造成有毒、有害物質(zhì)的殘留[4]。利用抗生素來殺滅沙門氏菌容易造成耐藥菌的出現(xiàn)，對沙門氏菌的控制造成極大的挑戰(zhàn)[5]。尋找新型的抗菌物質(zhì)已刻不容緩。

近些年來，由于噬菌體具有無毒，特異性高，裂解性強和抗耐藥性等優(yōu)良特點，已作為一種新型的生物抑菌劑被大量研究[6-7]。目前噬菌體已開始應(yīng)用于清除食品中致病菌，然而，在噬菌體制劑的研發(fā)中存在一些缺陷或不足，如作為活體病毒，噬菌體常常不被人們接受以及一些噬菌體對于耐藥基因的傳播等[8]。內(nèi)溶酶和穿孔素不僅保留了噬菌體的抑菌作用，而且細菌還很難對內(nèi)溶酶和穿孔素產(chǎn)生抗性，可很好地解決噬菌體制劑存在的不足和缺陷。

內(nèi)溶酶和穿孔素是一種存在于dsDNA 噬菌體中，對細菌具有裂解活性的蛋白[9]。內(nèi)溶酶和穿孔素可直接裂解細菌細胞壁或細胞膜[10]。內(nèi)溶酶能夠降解細菌的肽聚糖，使細菌裂解死亡；穿孔素能在細菌質(zhì)膜上形成小孔，協(xié)助內(nèi)溶酶降解肽聚糖。無毒、高效抑菌、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，使內(nèi)溶酶和穿孔素開始應(yīng)用于食品安全和醫(yī)藥等各個方面[11-12]。

本研究利用十聚體寡核苷酸隨機引物對前期分離的一株烈性沙門氏菌噬菌體SM-p2 的DNA進行隨機擴增并鑒定，利用鑒定結(jié)果設(shè)計內(nèi)溶酶Lys 2 與穿孔素Hol 2 的引物并確定它們的基因。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測該噬菌體內(nèi)溶酶結(jié)構(gòu)和特征，最后通過基因克隆表達得到內(nèi)溶酶Lys 2和穿孔素Hol 2。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SM-p2 為烈性噬菌體，保存于本實驗室；pEASY-Blunt E1 大腸桿菌表達試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1、BL21 （DE3）、膠回收試劑盒、Ni-IDA 填料，北京全式金生物有限公司；T 載體PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司。RNase A、DNaseI、乙二胺四乙酸（EDTA）、蛋白酶K，索萊寶生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。本試驗所用引物見表1。

表1 本試驗所用引物序列Table 1 Primers sequence in this research

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，Sartorius 公司；2720 Thermal CyclerPCR 儀，AppliedBiosystems 公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；JY88-IIN 超聲細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；011005酶標儀，Biotek 公司；Bio-rad ChemiDoc XRS+019900 化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)，Biorad 公司；DK-8D 水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-1600 紫外-可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；5810R 冷凍高速離心機，Eppendorf公司；MX-F 微型渦旋混合儀，上海瀘西分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體SM-p2 DNA 的提取 噬菌體懸浮液首先用RNase A（5 μg/mL）和DNaseI（2 U/mL）在37 ℃下處理30 min，然后在80 ℃下孵育15 min 使DNase I 失活。純化的噬菌體被蛋白酶K（50 μg/mL）于56 ℃下處理1 h，輔以SDS（0.5%）和EDTA（20 mmol/L）。加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混合并在4 ℃下以12 000×g 離心20 min。轉(zhuǎn)移上清液并與等體積的異丙醇混合并保持在-20 ℃過夜。離心后，用冰冷的75%乙醇洗滌沉淀3 次。最后，將顆粒風(fēng)干，溶解在50 μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl；1 mmol/L EDTA，pH 8）中并儲存在-20 ℃。

1.3.2 噬菌體SM-p2DNA 的隨機擴增 以噬菌體SM-p2 的DNA 為模板，用引物287、277、275、272、270、241、228 和208 進行PCR 擴增。PCR 擴增體系：Taq 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、10xPCR 緩沖 液2.5 μL、dNTPs （2.5mmol/L）2.5 μL、ddH2O 17.5 μL、模板DNA 0.5 μL、MgCl21.3 μL、上下游引物各1 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，34 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，共30 個循環(huán)。選擇第1 次擴增結(jié)果中又少又亮的條帶進行再擴增，將第2 次擴增的PCR 產(chǎn)物回收后進行TA 克隆并測序。測得的序列在NCBI 上進行相似性比對（Blastn）。

1.3.3 噬菌體SM-p2 內(nèi)溶酶 （Lys 2） 和穿孔素（Hol 2） 基因的確定 將上述隨機二次擴增PCR產(chǎn)物的核酸序列在NCBI 上進行相似性比對，選取Blast 比對結(jié)果中同源率最高的噬菌體的內(nèi)溶酶和穿孔素基因設(shè)計引物。獲得4 條引物，即Hol 2 的上下游引物（Lys 2 的上下游引物），以SM-p2的DNA 為模板，結(jié)合Hol 2 的上游引物和Hol 2下游引物（Lys 2 上游引物引物和Lys 2 的下游引物）進行PCR 擴增。PCR 擴增體系：Taq 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL、10xPCR 緩沖液5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 1 μL、ddH2O 35.2 μL、模 板DNA 0.5 μL、MgCl24 μL、上下游引物各2 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.3.4 Lys 2 與Hol 2 的生物學(xué)信息分析 分別利用 SOPMA、ExPASy ProtParamtool、TMHMM Server v.2.0 和Pfam 數(shù)據(jù)庫對SM-p2 內(nèi)溶酶和穿孔素的二級結(jié)構(gòu)、理化特征、跨膜結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。利用PyMOL 內(nèi)溶酶和穿孔素的二級結(jié)構(gòu)進行可視化。

1.3.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 將內(nèi)溶酶Lys 2或穿孔素Hol 2 基因片段與載體質(zhì)粒pEasy-Blunt E1 以物質(zhì)的量比7∶1 的比例加入離心管中，在室溫下反應(yīng)8 min 后，將試管置于冰上冷卻。加連接產(chǎn)物于剛解凍好的50 μL Trans1-T1感受態(tài)細胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上進行篩選，以T7 promoter primer 和目的基因的下游引物進行菌落PCR 挑選陽性菌，將的陽性菌提取質(zhì)粒后送至測序公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)大腸桿菌。

1.3.6 Lys 2 與Hol 2 的誘導(dǎo)表達與純化 將含有pEASY-Lys 2、pEASY-Hol 2 重組質(zhì)粒的大腸感受態(tài)細胞接種到含有卡那霉素抗性（0.1 μg/mL）的LB 肉湯培養(yǎng)基，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600nm在0.5 左右。分別加入終濃度為0.1，0.5，1，2，5 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)。在200 r/min、37 ℃的條件下誘導(dǎo)表達5 h。取誘導(dǎo)后的菌液6 000 r/min 離心10 min，收集細菌沉淀；將沉淀重懸于100 mL 無菌的PBS 緩沖液中，冰浴下超聲破碎，待溶液變得澄清后，10 000 r/min 離心1 h，收集上清；使用0.45 μm 的濾膜過濾得上清液。利用鎳親和柱純化過濾后的上清，將過濾后的上清液加入柱子，上清液自然流出并收集穿透液。再用25 mL Tris-NaCl 緩沖液清洗柱子并收集洗滌液后，使用濃度分別為20 mmol/L 和50 mmol/L 的咪唑洗脫雜蛋白，收集洗脫液。再分別用200 mmol/L 和500 mmol/L 咪唑?qū)δ康牡鞍走M行洗脫。取36 μL 純化好的目標蛋白洗脫液與4 μL 4×SDS-PAGE 上樣緩沖液混和，用水浴鍋在100 ℃下水浴3～5 min 充分混勻，得蛋白凝膠電泳上樣液，進行蛋白凝膠電泳。NanoDrop 紫外分光光度計用于檢測蛋白濃度。

1.3.7 Hol 2 表達對BL21（DE3）的生長的毒害作用 分別挑取含有pEASY-Hol 2、pEASY-Lys 2和pEASY-Blunt E1 重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的到10 mL 含卡那霉素的LB 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600nm在0.4～0.6 后，最終在200 r/min，37 ℃條件下加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h。定期檢測菌液濁度，時間間隔為20 min，以描述大腸桿菌BL21（DE3）的生長趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體SM-p2DNA 的隨機擴增及Lys 2 與Hol 2 基因的確定

如圖1b 所示，噬菌體SM-p2 DNA 的隨機擴增產(chǎn)物具有多樣性，引物208 在泳道1 中的PCR產(chǎn)物條帶少且亮，選擇泳道1 中的PCR 產(chǎn)物進行再擴增。最終回收到一段700～800 bp 的DNA 片段 （圖1c）。將回收的這段DNA 測序，再進行Blastn 比對。Blast 比對結(jié)果顯示，沙門氏菌噬菌體Sepoy 的核苷酸還原酶與隨機擴增的SM-p2 DNA片段同源率最高，為72.12%。根據(jù)沙門氏菌噬菌體Sepoy 內(nèi)溶酶和穿孔素的DNA 序列設(shè)計引物。將設(shè)計好的引物，以SM-p2 的DNA 為模板進行PCR。所圖1d 所示，得到SM-p2 內(nèi)溶酶Lys 2 的基因片段，大小在800 bp 左右；得到SM-p2 穿孔素Hol 2 的基因片段，大小在700 bp 左右。

圖1 Lys 2 與Hol 2 基因的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of gene of Lys 2 and Hol 2

2.2 Lys 2 和Hol 2 的生物學(xué)信息分析

2.2.1 噬菌體SM-p2 內(nèi)溶酶和穿孔素的二級結(jié)構(gòu) 如圖2所示，Lys 2 和Hol 2 的主要二級結(jié)構(gòu)都為α-螺旋，分別占氨基酸總數(shù)的56.06%和41.64%；Lys 2 和Hol 2 中第2 豐富的結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲，分別占氨基酸總數(shù)的29.17%和39.35%。在2 種蛋白的二級結(jié)構(gòu)中均未發(fā)現(xiàn)β-折疊。延長鏈和β-轉(zhuǎn)角在Lys 2 和Hol 2 占氨基酸總數(shù)含量較少。由于Lys 2 和Hol 2 的二級結(jié)構(gòu)中很少有層狀結(jié)構(gòu)，且主要二級結(jié)構(gòu)為α-螺旋結(jié)構(gòu)，因此可以推斷Lys 2 和Hol 2 具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[14]。

圖2 Lys 2 和Hol 2 二級結(jié)構(gòu)的可視化Fig.2 Visualization of secondary structure of Lys 2 and Hol 2

2.2.2 Lys 2 與Hol 2 的特性預(yù)測 一般來說，不穩(wěn)定系數(shù)小于40 表示蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的[15]。如表2所示，Lys 2 和Hol 2 的分子質(zhì)量分別是24.51 ku和28.66 ku，且不穩(wěn)定系數(shù)都低于40。

表2 Lys 2 和Hol 2 的理化性質(zhì)Table 2 The physicochemical properties of Lys 2 and Hol 2

2.2.3 Lys 2 與Hol 2 的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 對噬菌體SM-p2 內(nèi)溶酶和穿孔素的跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（圖3） 結(jié)果顯示，穿孔素Hol 2 在N 端在21～38位氨基酸形成一個跨膜結(jié)構(gòu)，39～150 位氨基酸處于胞外，1～27 位氨基酸處于胞內(nèi)；內(nèi)溶酶Lys 2 在150～200 之間由于螺旋程度較低最終并未形成跨膜結(jié)構(gòu)。

圖3 內(nèi)溶酶Lys 2 的跨膜結(jié)構(gòu)（a）和穿孔素Hol 2 的跨膜結(jié)構(gòu)（b）Fig.3 The transmembrane structure of endolysin Lys 2 （a） and holin Hol 2 （b）

2.2.4 Lys 2 與Hol 2 的結(jié)構(gòu)域預(yù)測 如圖4a 所示，噬菌體SM-p2 的內(nèi)溶酶Lys 2 由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）和一個催化結(jié)構(gòu)域（EDA），CBD 的主要位點是肽聚糖，EDA 起裂解細菌的作用，其本質(zhì)屬于N-乙酰胞壁酸酶，能裂解β-1，4-糖苷鍵。如圖4b 所示噬菌體SM-p2 的穿孔素Hol 2，含有一個保守結(jié)構(gòu)域，其主要作用是進行信息調(diào)節(jié)和破壞細菌細胞。

圖4 內(nèi)溶酶Lys 2（a）和穿孔素Hol 2（b）的結(jié)構(gòu)域Fig.4 Endolysin Lys 2 （a） and holin Hol 2 （b）structure domain

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEASY-Lys 2 和pESAYHol 2 來表達Lys 2 與Hol 2 功能蛋白。結(jié)果如圖5所示，菌落PCR 產(chǎn)物在泳道1 和泳道2 有明顯的條帶，大小分別為700 bp 和800 bp 左右，這與Hol 2 和Lys 2 基因大小一致，表明目的基因成功插入到了質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 菌落PCR 產(chǎn)物Fig.5 PCR products of colony

2.4 Lys 2 與Hol 2 的誘導(dǎo)表達與純化

向含pEASY-Lys 2、pEASY-Hol 2 的菌液和含空載體pEASY 的菌液中加入IPTG 誘導(dǎo)表達的蛋白以及純化后的蛋白進行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果顯示，0.1，0.5，1，2，5 mmol/L 的IPTG 均能誘導(dǎo)蛋白表達，其中Lys 2 在1 mmol/L 和2 mmol/L 的濃度下表達量最高，在26 ku 到33 ku左右出現(xiàn)明顯條帶 （圖6a）；在0.1～5 mmol/L 的IPTG 濃度范圍內(nèi)，加入的IPTG 濃度對Hol 2 的誘導(dǎo)表達無明顯影響，都能在20 ku 到25 ku 附近出現(xiàn)明顯條帶。作為陰性對照的質(zhì)?？蛰d蛋白在相應(yīng)位置并未出現(xiàn)明顯的條帶，表明Lys 2 與Hol 2 在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中的成功表達 （圖6b）。

圖6 不同濃度IPTG 誘導(dǎo)內(nèi)溶酶Lys 2（a）和穿孔素Hol 2（b）表達Fig.6 Different concentrations of IPTG induce expression of Lys 2 （a） and Hol 2 （b）

如圖7，SDS-PAGE 電泳圖所示，Lys 2 能夠在鎳親和柱中被200 mmol/L 咪唑大量洗脫并純化 （圖7a，泳道8），Hol 2 能夠在鎳親和柱中被500 mmol/L 咪唑大量洗脫并純化（圖7b，泳道6），且只在與目標蛋白分子質(zhì)量大小一致的位置出現(xiàn)唯一清晰的條帶。經(jīng)檢測，Lys 2 和Hol 2 的質(zhì)量濃度分別為5.419 mg/mL 和2.191 mg/mL。

圖7 內(nèi)溶酶Lys 2（a）和穿孔素Hol 2（b）的純化Fig.7 Purification of Lys 2 （a） and Hol 2 （b）

2.5 Hol 2 表達對BL21（DE3）的生長的毒害作用

穿孔素具有直接裂解細菌細胞內(nèi)膜的功能，可能對表達細菌產(chǎn)生毒害。如圖8所示，隨著時間的增加，BL21（DE3）+pEASY-Blunt E1（對照組）的菌液OD600nm值顯著高于BL21（DE3）+ pEASYHol 2 的菌液OD600nm值，說明穿孔素Hol 2 的表達抑制了細菌的生長。Hol 2 的表達雖能夠抑制細菌的生長，但不能降低菌液的濃度，并在表達80 min 后菌液濃度趨于穩(wěn)定，說明Hol 2 在加入IPTG 誘導(dǎo)表達的后的第80 分鐘表達量趨于穩(wěn)定，故Hol 2 的最佳表達時間為80 min。此外，BL21 （DE3） + pEASY-Lys 2 在不同時間菌液OD600nm值與對照組無顯著性差異，說明內(nèi)溶酶Lys 2 的表達不會抑制細菌的生長。

圖8 內(nèi)溶酶和穿孔素表達對大腸桿菌BL21（DE3）生長的抑制作用Fig.8 Inhibition of expression of endolysin and holin on growth of BL21 （DE3）

3 結(jié)論

噬菌體編碼的、有抑菌作用的內(nèi)溶酶和穿孔素，可作為一種新型抑菌劑控制食品中的病原菌。本研究對篩選的SM-p2 噬菌體進行了初步的鑒定，結(jié)果表明，噬菌體SM-p2 的DNA 片段與沙門氏菌噬菌體Sepoy 的同源率最高為72.12%。生物信息公共數(shù)據(jù)庫顯示，沙門氏菌噬菌體Sepoy 是一種含雙鏈DNA 的肌尾科噬菌體。因此，SM-p2可能也是一種雙鏈DNA 噬菌體。內(nèi)溶酶和穿孔素一般存在于雙鏈DNA 噬菌體的尾刺上可以破壞細菌細胞壁，使噬菌體的DNA 注入宿主細菌，對細菌具有很強的裂解活性，如T4 噬菌體[16]。

雙鏈DNA 噬菌體的內(nèi)溶酶是一種高效的革蘭氏陽性裂解酶，它具有無毒、高特異性、不易產(chǎn)生細菌耐藥性等特點[17]。內(nèi)溶酶具有模塊化結(jié)構(gòu)域，一般由細胞壁識別結(jié)構(gòu)域（CBD）和催化結(jié)構(gòu)域（EDA） 兩部分組成，CBD 能夠識別細菌，EDA能夠裂解細菌死亡[18]。內(nèi)溶酶的結(jié)構(gòu)域決定了能夠裂解的宿主范圍，一般既有CBD 又有EDA 的內(nèi)溶酶宿主范圍小，僅有一個球狀催化結(jié)構(gòu)域的內(nèi)溶酶能裂解多種細菌，甚至是革蘭氏陰性細菌[19]。也有研究表明，有的內(nèi)溶酶不止一個CBD或EDA[20-21]。跨膜結(jié)構(gòu)對于穿孔素傳遞信息和控制細菌裂解時間具有重要的意義[22]。Lys 2 的生物信息學(xué)顯示，Lys 2 具有典型的內(nèi)溶酶結(jié)構(gòu)，即由一個CBD 和一個EDA 組成，既可以識別具有特定結(jié)構(gòu)的細菌又能對結(jié)合到細菌造成裂解。Hol 2有一個跨膜結(jié)構(gòu)，用于傳遞信息和裂解細胞膜。

本研究利用原核表達系統(tǒng)成功表達了Lys 2和Hol 2，IPTG 誘導(dǎo)Lys 2 和Hol 2 表達的最佳濃度為1 mmol/L，在此濃度下誘導(dǎo)表達和純化最終獲得5.419 mg/mL 的內(nèi)溶酶溶液。穿孔素Hol2在未誘導(dǎo)之前少量表達，雖抑制了BL21（DE3）的生長，但并不能降低菌液濃度，在用IPTG 誘導(dǎo)表達80 min 后菌液濃度不在變化，因此穿孔素Hol 2 的最佳表達時間是80 min，純化后的穿孔素Hol 2 質(zhì)量濃度為2.191 mg/mL。