牧 丹，薩仁高娃，包 良，陳永福，蘇日娜*

（1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 呼和浩特 010010 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特 010010）

天冬（Radix asparagi） 為百合科植物天門(mén)冬【Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.】的干燥塊根，是國(guó)家衛(wèi)生部公布的第三批藥食兩用資源之一[1]，是一種既可食用也可藥用的珍品，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。其味甘、苦，性寒，歸肺腎經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、清肺生津的功效，用于肺燥干咳、頓咳痰黏、咽干口渴、腸燥便秘等癥[2]。根據(jù)《現(xiàn)在蒙醫(yī)藥學(xué)》的記錄，天冬、喜馬拉雅紫茉莉、黃精與玉竹并列在蒙醫(yī)藥四大傳統(tǒng)的根類(lèi)補(bǔ)益藥材之中，并具有滋補(bǔ)、固精、祛協(xié)日烏蘇、鎮(zhèn)赫依（指各生理功能的動(dòng)力）等功效[3-4]，主治協(xié)日烏蘇病，身體虛弱、頭暈、婦赫依癥、腎寒、遺精、陽(yáng)痿、陰伏熱、陳熱等病癥[5]?！睹t(yī)別錄》載“去寒熱，養(yǎng)肌膚，益氣力”，《月華于本草》載“鎮(zhèn)心，潤(rùn)五臟，益皮膚，悅顏色”，能使肌膚艷麗，保持青春活力[6]。由此可見(jiàn)，天冬滋養(yǎng)肌膚的功能明顯，民間有采用“天冬煮豬蹄”“天冬煮火腿”“天冬燉母雞”制作的食譜，極大地豐富了人們的養(yǎng)生美食范圍[7]。常食天冬能夠改善肌膚的血液循環(huán)，增強(qiáng)代謝功能，具有抗衰老的作用，尤其適合愛(ài)美人士食用。據(jù)研究報(bào)道，天冬主要化學(xué)成分包括19 種氨基酸、多糖與其它活性小分子化合物，如β-谷甾醇、胡蘿卜甾醇、9-二十七烷、異菝葜皂甙元、薯蕷皂甙元、洋菝葜皂甙元-3-O-β-D-糖苷-脒蚜胺及甾體皂苷等。其中，多糖是天冬較為重要的組成，具有多種治療特性，包括抗氧化[8]、抗菌及抗炎[9-12]、抗腫瘤[13-14]、降血糖[15]、抗疲勞[16]及止咳等功效[17]。多糖作為非特異性免疫增強(qiáng)化合物，能提高機(jī)體的免疫功能[18-20]。我國(guó)十分重視糖類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)，國(guó)家科技部已將“糖生物學(xué)與重大疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究”列入未來(lái)十年對(duì)生物經(jīng)濟(jì)起引導(dǎo)作用的重大生命科學(xué)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究課題[21-23]。近年來(lái)研究表明，天冬的抗腫瘤活性、免疫增強(qiáng)作用、清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性等主要的藥理作用均與天冬的多糖成分有著密切的關(guān)系[24]，對(duì)天冬多糖的研究具有重要意義。本文研究了天冬多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)解析、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化活性，為今后天冬多糖的開(kāi)發(fā)利用奠定試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

天冬藥材、無(wú)水乙醇、蒸餾水、氯仿、正丁醇、超純水、濃硫酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（GZDD-0114），中國(guó)食品藥品檢定研究院；不同分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 （5 800，11 800，47 300，100 000，380 000，788 000 u，批號(hào)90601），日本昭和電工公司；無(wú)水乙酸鈉（分析純級(jí)）、冰醋酸（分析純級(jí)）、三氟乙酸、50%氫氧化鈉溶液、醋酸鈉、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)品、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma chemical 公司；γ 干擾素（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（ELISA 試劑盒），深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA5003N 電子天平，上海菁海儀器有限公司；R-1001N 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BFX5-320 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，白洋離心機(jī)廠(chǎng)；透析袋，和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；78-1 磁力加熱攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；Telstar lyoQuest-85 凍干機(jī) （西班牙）；IRAffinity-1 紅外分光光度計(jì)，日本島津公司；ICS5000 離子色譜儀，ThermoFisher 公司；UGC-24M 氮吹儀，上海力辰科技有限公司；MAPADA-P9 雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。上海美譜達(dá)儀器有限公司；515 高效液相色譜儀、2410 示差折光檢測(cè)器、Empower2 色譜工作站，Waters 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 天冬粗多糖的提取 將天冬藥材粉碎過(guò)篩（40 目），稱(chēng)取100 g 置于圓底燒瓶中，加入500 mL 蒸餾水，加熱回流3 次，每次1 h，放冷后抽濾。將3 次濾液合并濃縮至約100 mL。加無(wú)水乙醇，調(diào)節(jié)至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，冷藏靜置，密封醇沉1 夜。將醇沉物抽濾，收集固體烘干后得棕色粗多糖粉末。

1.3.2 粗多糖的分離純化以及含量測(cè)定

1.3.2.1 純化 稱(chēng)取1 g 天冬粗多糖粉末，加100 mL 蒸餾水溶解。將溶液置于分液漏斗中，加入Sevage 試劑（V氯仿∶V正丁醇=4 ∶1）25 mL，強(qiáng)烈振搖20 min 后離心，收集上層液體，再次分液，重復(fù)上述脫蛋白操作，直至無(wú)蛋白層出現(xiàn)。將脫蛋白后的水溶液置于透析袋內(nèi)透析2～3 d。收集透析后的溶液濃縮后凍干，得白色天冬脫蛋白多糖凍干粉。

1.3.2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量測(cè)定

1） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密稱(chēng)取0.0250 g 無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用超純水定容，振蕩搖勻，得0.25 mg/mL 無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加入超純水補(bǔ)至2.0 mL，分別加入6%的苯酚試劑1.0 mL，振蕩搖勻，用濃硫酸定容至刻度線(xiàn)，振蕩搖勻，靜置5 min 后40 ℃水浴30 min，取出。另取超純水2.00 mL 置于10 mL 容量瓶?jī)?nèi)，同上述操作制得空白對(duì)照溶液。用紫外-可見(jiàn)分光光度法在波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)其吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2） 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取天冬粗多糖粉末與天冬脫蛋白凍干粉末各10 mg 于10 mL容量瓶中，加入超純水使其溶解并定容至刻度線(xiàn)，振蕩搖勻、備用。分別精密吸取以上溶液0.2 mL，置于10 mL 容量瓶中，同標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法制備供試品溶液，在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中多糖含量。

1.3.3 脫蛋白多糖的分級(jí)醇沉 稱(chēng)取1.45 g 天冬脫蛋白凍干粉，置于燒杯中，加入150 mL 蒸餾水溶解，分別用30%，60%，80%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇分級(jí)醇沉。每級(jí)醇沉物離心后所得沉淀用適量蒸餾水溶解，透析、凍干后進(jìn)行凝膠滲透色譜（GPC）測(cè)定。離心后剩余液體繼續(xù)進(jìn)行醇沉操作，最后得30%醇沉物73 mg，60%醇沉物365 mg 及80%醇沉物80 mg，用于結(jié)構(gòu)表征及活性測(cè)定。

1.3.4 TD-80 紅外光譜檢測(cè) 取適量溴化鉀，烘干后置于研缽內(nèi)研磨至粉末狀，加入1～2 mg TD-80 凍干粉，混合后研磨均勻，壓片，用紅外光譜儀，在4 000～400 cm-1范圍測(cè)定TD-80 多糖的紅外光譜。

1.3.5 天冬多糖的分子質(zhì)量的測(cè)定 采用凝膠滲透色譜（GPC）-示差檢測(cè)器法對(duì)天冬脫蛋白多糖及不同分級(jí)醇沉多糖進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定。色譜條件：Ultrahydrogel 500 和Ultrahydrogel 250 （7.8 mm×300 mm）連用；排阻范圍（0.1～1 000 ku）；流動(dòng)相為醋酸鹽緩沖溶液（pH 4.5）；流速：0.9 mL/min；柱溫：45 ℃。分別稱(chēng)取分子質(zhì)量為5 800，11 800，47 300，100 000，380 000，788 000 u 的 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖樣品各7 mg，用1 mL 流動(dòng)相溶解，待用。吸取不同分子質(zhì)量的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以保留時(shí)間（RT）為橫坐標(biāo)（x 軸），分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（y 軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用Empower 2 色譜工作站計(jì)算得到回歸方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，計(jì)算樣品的數(shù)均分子質(zhì)量。

1.3.6 TD-80 單糖組成分析 采用離子色譜-安培檢測(cè)法，色譜條件：色譜柱：DionexCarbopacTMPA20 （3 mm×150 mm）；流 動(dòng)相：A：H2O；B：250 mmol/L NaOAC、50 mmol/L NaOH 和500 mmol/L NaOAC；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃；檢測(cè)器：安培檢測(cè)器。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、核糖）配成約10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液精密配制1，5，10，20，50，80，100 mg/L 梯 度質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)絕對(duì)定量方法，測(cè)定不同單糖質(zhì)量。

取多糖TD-80 樣品4 mg 于安瓿瓶中，加入2 mol/L 三氟乙酸（TFA）1 mL，120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取200 μL 酸水解溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，氮吹吹干，加入1 mL 水渦旋混勻，12 000 r/min 離心5 min。取上清進(jìn)行離子色譜分析。

1.3.7 免疫調(diào)節(jié)活性試驗(yàn)

1.3.7.1 TD-80 對(duì)脾淋巴細(xì)胞免疫增殖活性的測(cè)定 評(píng)價(jià)天冬的80%分級(jí)醇沉后得的均一多糖（TD-80）對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增值活性，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

小鼠斷頸處死，乙醇浸泡后剪開(kāi)腹腔，取出脾臟，加分離液，研磨脾臟，單細(xì)胞透過(guò)尼龍網(wǎng)進(jìn)入分離液中，分離液轉(zhuǎn)至離心管，培養(yǎng)基離心30 min，分離出淋巴細(xì)胞層。淋巴細(xì)胞分離完成后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。向96 孔板中加入100 μL 5×106個(gè)/mL 細(xì)胞懸液。陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μL 終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL 氘逗素（ConA），試驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度分別為200，40，5 μg/mL 的多糖溶液，每孔終體積為200 μL，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h 后，加入CCK-8 在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定OD 值。

1.3.7.2 TD-80 對(duì)IFN-γ 和IL-2 細(xì)胞因子分泌的影響 如1.3.7.1 節(jié)所述，制備淋巴細(xì)胞懸液，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。試驗(yàn)組每孔加入100 μL 質(zhì)量濃度為200，40，5 μg/mL 多糖樣品，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，2 000 r/mim、4℃離心10 min，收集上清。使用雙抗體夾心法，參照IFN-γ 和IL-2 ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)評(píng)估其細(xì)胞因子水平。將細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋至500，250，125，62.5，31.3，15.6 pg/mL 和7.8 pg/mL。

1.3.7.3 TD-80 對(duì)TNF-α，IL-1β 和IL-6 細(xì)胞因子分泌的影響 RAW264.7 細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系（從中國(guó)科學(xué)院的細(xì)胞庫(kù)中獲得），在含有10%熱滅活胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（Invitrogen）中保存。RAW264.7 細(xì)胞在96 孔板（1×106細(xì)胞/孔）中培養(yǎng)，與不同質(zhì)量濃度（5，40 μg/mL 和200 μg/mL） 的TD-80 多糖在37 ℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)48 h。以2.5 μg/mL 脂多糖（LPS）為陽(yáng)性對(duì)照。除去上清液后，保存在-20 ℃。參照TNF-α，IL-1β 和IL-6 ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法評(píng)估其細(xì)胞因子水平。

1.3.8 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.8.1 超氧陰離子清除能力測(cè)定 AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-，NO2-與對(duì)氨基苯磺酸和α－萘胺作用生成紅色的偶氮化合物，在波長(zhǎng)530 nm 處有特征吸收峰。樣品對(duì)超氧陰離子的清除能力與在波長(zhǎng)530 nm 處的吸光值呈負(fù)相關(guān)。采用超氧化物陰離子清除試劑盒使用說(shuō)明書(shū)——微量法檢測(cè)超氧陰離子自由基的清除活性。簡(jiǎn)而言之，將10 μL Tris-HCl 溶液（TEMED）和40 μL 過(guò)硫酸銨加到對(duì)照管和樣品管中，僅將25 μL H2O 添加到對(duì)照管中，在25 ℃下混合反應(yīng)1 min。將25 μL 多糖TD-80 溶液和陽(yáng)性對(duì)照溶液抗壞血酸 （ASA）（0.01～0.1 mg/mL）添加到樣品管中，然后將50 μL 鹽酸羥胺溶液添加到兩個(gè)管中，在37 ℃下反應(yīng)30 min。最后，將50 μL 對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺在乙酸溶液中混合后加入到上述混合物中，在37 ℃下顯色反應(yīng)20 min，在波長(zhǎng)530 nm 處測(cè)量吸光度A。計(jì)算超氧化物自由基清除活性。

1.3.8.2 羥自由基清除能力 H2O2/Fe2+通過(guò)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+，導(dǎo)致波長(zhǎng)536 nm 處吸光度下降，樣品對(duì)536 nm 處吸光度下降速率的抑制程度，反映樣品清除羥自由基的能力。采用超氧化物陰離子清除試劑盒使用說(shuō)明書(shū)——微量法檢測(cè)羥自由基的清除活性。簡(jiǎn)而言之，在空白管、對(duì)照管及樣品管中分別加入250 μL 工作液 （V鄰二氮菲-無(wú)水乙醇∶VNa2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O∶VFeSO4·7H2O=100∶50 ∶100），空白管加入100 μL H2O；對(duì)照管加入50 μL H2O 和50 μL H2O2；樣品管中加入50 μL H2O2和50 μL不同質(zhì)量濃度的多糖及陽(yáng)性對(duì)照ASA，混勻，37℃保溫60 min，8 000×g、25 ℃離心5 min。吸 取200 μL 上清液，于96 孔板中測(cè)定波長(zhǎng)536 nm 處的吸光值，空白管、對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值分別記為A空、A對(duì)和A測(cè)。

1.3.8.3 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 配制質(zhì)量濃度為1×10-5g/mL 的DPPH-乙醇溶液和0.2 mg/mL 天冬多糖溶液。分別取不同體積的多糖溶液200，400，600，800，1 000，1 500，2 000 μL，補(bǔ)足乙醇溶液至2 mL，用移液槍分別加入DPPH-乙醇溶液。混勻后置無(wú)光環(huán)境中反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度。以乙醇作為空白，按式（4）計(jì)算天冬多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率。每份樣品平行操作3 次，取平均值。

式中，A對(duì)照——DPPH 本身在測(cè)定波長(zhǎng)處的吸光度；A樣品——樣品對(duì)DPPH 作用后的吸光度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖糖含量

苯酚-硫酸法含量測(cè)定結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.00～1.588 μg/mL 范圍呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為y = 0.0796x-0.3613，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。粗多糖中糖含量為63.13%，脫蛋白凍干粉中糖含量為73.98%。

2.2 TD-80 紅外光譜檢測(cè)

粗多糖80%醇沉物紅外光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。3 428.01 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是糖分子中O-H 鍵的伸縮振動(dòng)吸收，2 936.59 cm-1處的峰是C-H 鍵的伸縮振動(dòng)吸收，1 630.16 cm-1處的峰是糖結(jié)合水的吸收峰，1 442.34cm-1的峰是糖分子中C-H 鍵的變角振動(dòng)吸收，1 020.49 cm-1處的峰是吡喃環(huán)醚鍵C-O 鍵的變型振動(dòng)吸收。另外，在1 745.73 cm-1附近有酯羰基對(duì)應(yīng)的強(qiáng)吸收峰，表明該糖含有糖醛酸，是酸性多糖。916.47 cm-1的峰是吡喃糖β 型C-H 變形振動(dòng)的吸收峰，760.44 cm-1的峰是α-構(gòu)型吡喃環(huán)的對(duì)稱(chēng)振動(dòng)，說(shuō)明天冬的80%醇沉多糖是含有α、β 兩種構(gòu)型的酸性吡喃多糖。

圖1 TD-80 紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of TD-80

2.3 分子質(zhì)量的測(cè)定

經(jīng)GPC 法測(cè)定脫蛋白天冬多糖和80%醇沉產(chǎn)物TD-80 的分子質(zhì)量。圖2a 為脫蛋白后天冬多糖的色譜圖，其顯示天冬脫蛋白多糖由兩個(gè)分子質(zhì)量的多糖組成，保留時(shí)間11.51 min 的峰的重均分子質(zhì)量為59.4 ku，保留時(shí)間16.29 min 的峰的分子質(zhì)量為3.9 ku。圖2b 顯示一個(gè)色譜峰，峰型對(duì)稱(chēng)，說(shuō)明TD-80 多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布均一。根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程為y =-0.3079x+5.9129，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。TD-80的重均分子質(zhì)量Mw 為6.8 ku，多分散指數(shù)為2.48。其余醇沉產(chǎn)物未得到單一組分多糖，文中未提供GPC 圖譜。

圖2 GPC色譜圖Fig.2 GPC chromatogram

2.4 單糖組成分析

采用離子色譜儀，以13 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定水解后TD-80 多糖的單糖組成。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖樣品色譜圖譜的出峰時(shí)間，鑒定樣品中相應(yīng)的單糖峰。結(jié)果表明：樣品TD-80 多糖中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸物質(zhì)的量比為0.048 ∶0.102 ∶0.316∶0.157∶0.101∶0.017∶0.259，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram

2.5 TD-80 多糖免疫調(diào)節(jié)作用

2.5.1 TD-80 多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 結(jié)果表明（圖4、表1），試驗(yàn)組OD450nm值與空白組比較均增大，表明TD-80 多糖組和Con-A 陽(yáng)性對(duì)照組均不同程度地促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值作用，其中TD-80 多糖組在5～200 g/mL 質(zhì)量濃度下，顯示質(zhì)量濃度依賴(lài)關(guān)系；當(dāng)TD-80 質(zhì)量濃度在40 μg/mL 和200 μg/mL 時(shí)，差異顯著（P<0.05）。

表1 TD-80 對(duì)正常小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)的影響Table 1 Effect of TD-80 on proliferation of splenic lymphocytes in normal mice

圖4 TD-80 對(duì)正常小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of TD-80 on proliferation of splenic lymphocytes in normal mice

2.5.2 TD-80 多糖對(duì)IFN-γ 和IL-2 細(xì)胞因子分泌的影響 3 個(gè)質(zhì)量濃度的TD-80 多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ 的分泌具有極顯著的影響（P<0.01），并具有質(zhì)量濃度依賴(lài)性。當(dāng)TD-80 多糖質(zhì)量濃度大于40 μg/mL 時(shí)，與細(xì)胞空白比較IFN-γ的分泌達(dá)到300 多倍，表明TD-80 多糖對(duì)IFN-γ的分泌影響極大。與細(xì)胞空白比較TD-80 多糖對(duì)IL-2 分泌的影響不顯著（結(jié)果見(jiàn)圖5）。

圖5 TD-80 多糖對(duì)IFN-γ 和IL-2 細(xì)胞因子的分泌影響Fig.5 The effect of TD-80 polysaccharide on the secretion of IFN-γ and IL-2 cytokines

2.5.3 TD-80 多糖對(duì)TNF-α，IL-6 和NO 細(xì)胞因子分泌的影響 測(cè)定TD-80 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響，研究TD-80 多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。如圖6所示，將質(zhì)量濃度5～200 μg/mL 的TD-80 多糖與RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)TD-80 能促進(jìn)TNF-α （圖6a），IL-6（圖6b）和NO（圖6c）細(xì)胞因子的分泌。其中TD-80 的3 個(gè)質(zhì)量濃度組（5～200 μg/mL）與空白細(xì)胞組相比，均極顯著地增加腫瘤壞死因子α 的分泌（P<0.01）（圖6a），且具有質(zhì)量濃度依賴(lài)關(guān)系。TD-80 多糖同時(shí)對(duì)白介素-6 的分泌也有質(zhì)量濃度依賴(lài)性的影響，與空白細(xì)胞相比，高質(zhì)量濃度多糖組具有極顯著差異（P<0.01），陽(yáng)性對(duì)照組LPS 和中濃度多糖組具有顯著性差異（P<0.05）（圖6b）。在NO 細(xì)胞因子的分泌影響中，TD-80 的2個(gè)質(zhì)量濃度組（40，200 μg/mL）和LPS 與空白細(xì)胞組相比，均顯著地增加NO 的分泌（P<0.05 或P<0.01）（圖6c），且具有質(zhì)量濃度依賴(lài)關(guān)系。

圖6 TD-80 多糖對(duì)TNF-α、IL-6 和NO 細(xì)胞因子的分泌影響Fig.6 The effect of TD-80 polysaccharide on the secretion of TNF-α，IL-6 and NO cytokines

2.6 體外抗氧化活性

活性氧（ROS）主要由羥自由基和過(guò)氧化氫組成，過(guò)量的ROS 產(chǎn)生與細(xì)菌感染期間肝臟和腎臟的氧化損傷有關(guān)，這可能有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和死亡率[25]。如今，合成抗氧化劑在食品工業(yè)中得到廣泛使用，然而，這些合成物質(zhì)的毒性和致癌作用令人擔(dān)憂(yōu)[26]。解決該問(wèn)題途徑之一是使用天然抗氧化劑。

在活性氧中，羥自由基是反應(yīng)性最高的一種，可以攻擊生物分子，例如DNA 和蛋白質(zhì)[27]。從天冬分離的多糖在4～10 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍具有清除羥自由基的能力（圖7a），兩種樣品的活性均以質(zhì)量濃度依賴(lài)性方式增加。此外，TD-80 的清除活性隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，特別是在高劑量（10 mg/mL）下，TD-80 表現(xiàn)出非常高的自由基清除活性（45.12%），與陽(yáng)性對(duì)照比較P<0.05。在低劑量（4～7.5 mg/mL）時(shí)，TD-80 的自由基清除活性低，這說(shuō)明多糖TD-80 在高劑量下具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

與抗壞血酸（ASA）相比，TD-80 清除超氧陰離子活性如圖7b 所示。樣品以質(zhì)量濃度依賴(lài)性方式表現(xiàn)出明顯的清除超氧陰離子的活性。TD-80多糖在質(zhì)量濃度0.01～0.1 mg/mL 范圍具有清除超氧陰離子的能力。與維生素C 比較，在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL 下，TD-80 具有顯著的清除超氧陰離子活性（60.72%，P<0.05）。這些結(jié)果表明TD-80 具有清除超氧陰離子的抗氧化能力。

DPPH 通常用作評(píng)估抗氧化劑活性的化合物，在波長(zhǎng)517 nm 處表現(xiàn)出特征吸收，通常被認(rèn)為是具有穩(wěn)定自由基的化合物之一。本研究用比色法檢測(cè)純化的多糖TD-80 對(duì)DPPH 自由基的清除能力，結(jié)果如圖7c 所示。在質(zhì)量濃度0.02～0.2 mg/mL 范圍，陽(yáng)性對(duì)照組ASA 的DPPH 清除率為100%；TD-80 多糖組具有質(zhì)量濃度依賴(lài)的DPPH 自由基清除能力，在最高質(zhì)量濃度下，其DPPH 自由基的清除率達(dá)到68.8%。以上羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、DPPH 自由基清除能力等3 種抗氧化活性的測(cè)定僅在體外化學(xué)系統(tǒng)中建立。需進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證其抗氧化活性。

圖7 TD-80 的體外抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of TD-80 in vitro

3 結(jié)論

從天冬中提取多糖，分離純化后分析結(jié)構(gòu)特征，研究其免疫調(diào)節(jié)活性和體外抗氧化活性。結(jié)果表明：天冬粗多糖中糖含量為63.13%，脫蛋白凍干粉中糖含量為73.98%。根據(jù)紅外檢測(cè)結(jié)果，天冬的80%醇沉多糖（TD-80）是含有α、β 兩種構(gòu)型的酸性吡喃多糖。GPC 法測(cè)定結(jié)果表明：TD-80 的重均分子質(zhì)量Mw 為6.8 ku，多分散指數(shù)為2.48。天冬的80%醇沉多糖（TD-80）由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸等單糖組成。體外活性試驗(yàn)表明，TD-80 能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子 （TNF-α，IL-1β和IL-6）的分泌有一定的刺激作用，呈現(xiàn)一定的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性。