江 勇，任 一，胡建山，梁子聰

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第二附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000；2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州 都勻 558013)

骨質(zhì)疏松是以骨密度降低及其顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化為主要特征的一類(lèi)型疾病。骨質(zhì)疏松發(fā)病率與年齡、性別呈明顯相關(guān)，尤其是絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平降低，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，骨質(zhì)脆性增加，導(dǎo)致骨折發(fā)生[1-2]。在我國(guó)隨著老齡化加重，骨質(zhì)疏松癥成為了危害公共健康嚴(yán)重問(wèn)題之一[3]。對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療現(xiàn)以使用骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑等治療為主，雖然藥物療效確切，是目前醫(yī)學(xué)界重要的課題之一[4]。“鹿角壯骨膠囊”是黔南州著名民族醫(yī)胡建山教授治療骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗(yàn)方。本實(shí)驗(yàn)探討鹿角壯骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠骨細(xì)微結(jié)構(gòu)及骨代謝影響的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供(批準(zhǔn)文號(hào)：黔藥制2013003號(hào)，規(guī)格：0.45 g/粒)，迪巧小兒碳酸鈣D3顆粒(碳酸鈣0.75 g/袋，國(guó)藥準(zhǔn)字J20090021)，血清鈣、血清磷、酸性磷酸酶、骨鈣素試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。大鼠骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)免疫組化一抗、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。ASP300 S型全封閉式組織脫水機(jī)、RM2265型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210型攤片機(jī)、DM750型光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica)，酶標(biāo)儀(深圳邁瑞)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)選用6個(gè)月齡 SD(清潔級(jí))雌性大白鼠60只，體質(zhì)重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)。造模前數(shù)字隨機(jī)法將大鼠其分成假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性組(碳酸鈣)、鹿角壯骨膠囊低劑量組(低劑量組)、鹿角壯骨膠囊中劑量組(中劑量組)及鹿角壯骨膠囊高劑量組(高劑量組)，每組10只。

1.3 造模及藥物干預(yù) 模型組、西藥組、鹿角壯骨膠囊低、中、高劑量組參考文獻(xiàn)方法建立陽(yáng)虛型骨質(zhì)疏松大鼠模型，即去勢(shì)法+糖皮質(zhì)激素：雌性大鼠予卵巢切除，按20 mg/kg的劑量間歇肌肉注射氫化可的松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型，誘導(dǎo)時(shí)間為2個(gè)月。假手術(shù)組僅予腹部切開(kāi)，隨后縫合切開(kāi)，不予激素誘導(dǎo)。造模后第二天，分別灌胃給予對(duì)應(yīng)藥液(人與大鼠體表面積換算等效劑量換算)，西藥組給予碳酸鈣(104.19 mg/(kg·d)，低劑量組給予鹿角壯骨膠囊藥粉(0.432 g/(kg·d)，中劑量組給予鹿角壯骨膠囊藥粉(0.864 g/(kg·d)，高劑量組給予鹿角壯骨膠囊藥粉(1.728 g(kg·d)；假手術(shù)組與模型組給予蒸餾水。給藥1次/d，連續(xù)給藥3個(gè)月。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 骨代謝生化指標(biāo)檢測(cè)、血清學(xué)指標(biāo)及骨基質(zhì)成分檢測(cè) 麻醉大鼠后，眼眶采血，收集血液，分離血清，測(cè)定血清鈣、磷、酸性磷酸酶和骨鈣素含量。

1.4.2 股骨細(xì)微結(jié)構(gòu) 取大鼠右側(cè)股骨，制作HE切片，置于顯微鏡下觀察，采用圖像系統(tǒng)采集平均骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(percent trabecular area，%Tb.Ar)、平均骨小梁厚度(trabecular thick ness，Tb.Th)、平均骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)的數(shù)值。

1.4.3 OPG及RANKL蛋白表達(dá) 切片脫蠟，修復(fù)抗原，加OPG及RANKL一抗過(guò)夜，滴加二抗，DAB顯色后，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定著色部位的平均光密度值，作為OPG及RANKL蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清鈣、血清磷、酸性磷酸酶、骨鈣素的檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清鈣、血清磷、酸性磷酸酶、骨鈣素的含量均明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性組和高劑量組大鼠血清鈣、血清磷的含量均不同程度上升(P<0.05)，而陽(yáng)性組和中高劑量組血清酸性磷酸酶、骨鈣素明顯上升(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清鈣、血清磷、酸性磷酸酶、骨鈣素的結(jié)果比較

2.2 各組大鼠骨細(xì)微結(jié)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠平均骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、平均骨小梁寬度明顯下降(P<0.05)，而平均骨小梁分離度明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性組及中高劑量組平均骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、平均骨小梁寬度明顯增高(P<0.05)，而平均骨小梁分離度明顯下降(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Tb.Ar、Tb.Th、Tb.Sp及OPG、RANKL表達(dá)的結(jié)果比較

2.3 各組大鼠骨組織OPG、RANKL的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 從圖1、2看出，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨OPG表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而RANKL表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性組及中高劑量組OPG表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而RANKL表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

圖1A假手術(shù)組OPG 圖1B模型組OPG 圖1C陽(yáng)性組OPG

圖1D低劑量組OPG 圖1E中劑量組OPG 圖1F中劑量組OPG

圖2D低劑量組RANKL 圖2E中劑量組RANKL 圖2F中劑量組RANKL

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是老年常見(jiàn)病之一，女性發(fā)病率高于男性，原因是女性更年期后，機(jī)體雌激素水平的降低，隨著年齡的增加，女性的雌激素分泌水平下降更加明顯，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病[5]。卵巢切除聯(lián)合糖皮質(zhì)激素建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，與本病發(fā)病機(jī)理相似，是目前首選的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[6]。骨微細(xì)結(jié)構(gòu)是反映骨質(zhì)疏松癥的重要指標(biāo)，骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁間距等反映單位面積內(nèi)骨小梁結(jié)構(gòu)狀況，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的判斷起重要作用[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)卵巢切除聯(lián)合糖皮質(zhì)激素建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，模型組大鼠在骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁分離度等指標(biāo)較假手術(shù)組具有明顯差異，骨質(zhì)丟失明顯，說(shuō)明造模成功。

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)中屬于“骨萎”的范圍，其病因主要為年老體衰、肝腎虧虛所致[8]。研究認(rèn)為，中醫(yī)補(bǔ)腎療法可以加強(qiáng)下丘腦垂體性腺軸功能，對(duì)鈣離子等在腸道的吸收及細(xì)胞機(jī)制中鈣磷代謝平衡中起重要作用，促進(jìn)骨質(zhì)形成，減少骨的破壞[9]。骨鈣素通過(guò)富集成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨形成和骨的鈣化作用。而破骨細(xì)胞能產(chǎn)生和分泌酸性磷酸酶，參與骨礦質(zhì)降解過(guò)程，是評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞功能和骨吸收的特異性指標(biāo)[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)骨重建的最重要的分子系統(tǒng)之一，OPG和RANKL是兩種作用完全相反的破骨細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)的重要中介物質(zhì)[11]。據(jù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨保護(hù)素被激活后，可以抑制破骨細(xì)胞骨分化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。而成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL能與破骨細(xì)胞前體細(xì)接觸，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成[12]。因此，除了血清鈣磷等代謝指標(biāo)外，OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路成為了中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理研究的重要指標(biāo)之一。鹿角壯骨膠囊以鹿角膠為君藥，主歸肝、腎經(jīng)，起到補(bǔ)腎強(qiáng)骨功效。臣以骨碎補(bǔ)、熟大黃、增強(qiáng)君藥補(bǔ)益肝腎之功，佐以黃芪、當(dāng)歸、血竭、炒土鱉、鍛自然銅、白術(shù)、川芎等多味中藥共湊益氣補(bǔ)血、填精生髓之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，骨碎補(bǔ)可調(diào)節(jié)BMSCs細(xì)胞OPG、RANKL的表達(dá),激活OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟[13]。黃芪和當(dāng)歸亦可通過(guò)OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路，上調(diào)OPG、VEGF164表達(dá)，下調(diào)RANKL表達(dá),降低RANKL/OPG比降低骨細(xì)胞死亡率、抑制破骨細(xì)胞過(guò)度活動(dòng)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性組和高劑量組大鼠血清鈣、血清磷的含量均不同程度上升(P<0.05)，而陽(yáng)性組和中高劑量組血清酸性磷酸酶、骨鈣素明顯上升(P<0.05)，陽(yáng)性組及中高劑量組平均骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、平均骨小梁寬度明顯增高(P<0.05)，而平均骨小梁分離度明顯下降(P<0.05)，陽(yáng)性組及中高劑量組OPG表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而RANKL表達(dá)明顯下降(P<0.05)。因此可以說(shuō)明，鹿角壯骨膠囊可以通過(guò)調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路，提高骨OPG蛋白表達(dá)及抑制RANKL蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)大鼠機(jī)體鈣磷代謝，進(jìn)而通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化，減少骨微結(jié)構(gòu)中骨量的丟失來(lái)預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。

綜上所述，早期使用中高劑量鹿角壯骨膠囊干預(yù)，能減少骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，可以有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。其作用原理可能與鹿角壯骨膠囊調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路，穩(wěn)定機(jī)體鈣磷代謝相關(guān)。