黎 強，丁 祎，劉高文，賈 亭，高媛媛，陳 芮，宋玉竹,韓芹芹，夏雪山，張金陽

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

狂犬病是由狂犬病毒感染神經(jīng)系統(tǒng)引起的一種古老且缺乏有效治療方法的人獸共患的一種病毒性傳染病[1].該病一直是我國公共衛(wèi)生關(guān)注的重點，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，死亡率幾乎可達到100%[2].狂犬病患者一般是被含有狂犬病毒的動物咬到皮膚，唾液中的狂犬病毒進入到機體中引發(fā)感染.狂犬病的潛伏期較長，而患者發(fā)病后的前期臨床癥狀會表現(xiàn)出精神不振，隨著疾病的進程，患者逐漸出現(xiàn)神經(jīng)癥狀不久因中樞神經(jīng)衰竭而昏迷或死亡[3].根據(jù)WHO報道[4],每年因為狂犬病而死亡的人數(shù)約為5.5萬至6萬人.中國和一些發(fā)展中國家聽從WHO的建議對人民進行狂犬病相關(guān)知識以及狂犬疫苗的普及，進而使狂犬病的患病人數(shù)減少，造成的社會經(jīng)濟損失也在減少.但是由于狂犬病的治療沒有特效藥，使得每年因為狂犬病而死亡的人數(shù)也不少[5],是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國公共衛(wèi)生的病毒性傳染病.

狂犬病毒是一種單股負鏈不分節(jié)RNA病毒，全長基因組約為12 kb，從3’端到5’端編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白，即糖蛋白(G)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)、轉(zhuǎn)錄酶大蛋白(L)以及基質(zhì)蛋白(M)[6].在這5個結(jié)構(gòu)蛋白中，M蛋白的相對分子量最小，在病毒總蛋白中占11%[7].在狂犬病的整個生命周期中，M蛋白都扮演著一個至關(guān)重要的角色，同時很多學(xué)者已經(jīng)廣泛地研究和證實了M蛋白在病毒組裝和形態(tài)發(fā)生以及包膜病毒顆粒出芽中所發(fā)揮的作用[8].最近，針對狂犬病病毒家族的成員狂犬病毒(RABV)進行的逆向遺傳學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，除了病毒裝配以外，狂犬病病毒M蛋白還具有出乎意料的功能，即RNA合成的調(diào)控深刻影響復(fù)制以及復(fù)制的平衡[9].此外M蛋白與G蛋白之間發(fā)生相互作用去參與宿主免疫反應(yīng)，以M蛋白為核心，G蛋白起協(xié)同作用[10].因此，通過對RABV-M的研究有助于去揭示RABV在宿主上的致病機理.當(dāng)前，在對RABV的研究過程中，沒有合適的的單抗或多抗就會嚴(yán)重阻礙研究步伐.因此，開發(fā)適宜的抗體已經(jīng)成為我們進行相關(guān)研究的前提條件.

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a，RABV CVS-11毒株，E.coliDH5α感受態(tài)細胞，E.coliRosetta(DE3)及原核表達載體pET-28a均由昆明理工大學(xué)分子診斷實驗室保存.Balb/c小鼠購于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.

1.2 試劑及儀器

Trizol購于天根生物科技有限公司；蛋白高分子量預(yù)染Marker購于Thermo公司；DL2000 DNA Marker、T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa 公司；HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq Master Mix (Dye Plus)均購自Vazyme公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖膠回收劑盒購自北京莊盟公司；IPTG和鋁佐劑購自索萊寶公司; 考馬斯染色液、脫色液由本實驗室配置；鎳柱購于武漢匯研公司.SDS-PAGE電泳儀和核酸電泳儀購于北京六一公司；上海躍進醫(yī)療儀器廠臺式恒溫培養(yǎng)箱；Sigma 高速離心機；FormaCO2細胞培養(yǎng)箱；Canon 倒置熒光顯微鏡等.

1.3 方法

1.3.1 目的基因M的擴增

根據(jù)GenBanK數(shù)據(jù)庫中CVS-11毒株中的M基因序列(序列號：ADJ29910.1)，設(shè)計M的引物，同時引入BamHⅠ，HindⅢ酶切位點(下劃線部分).M正向引物為5′-CGCGGATCCATGAACGTTCTACGCAAGATAGTG-3′，反向引物為5′- CCCAAGCTTTAATTCTAGAAGCAGAGAAGAGTCTTTG-3′.Trizol 法提取CVS-11病毒感染N2A細胞的總RNA，以RNA為模板進行RT-PCR得到cDNA,再以cDNA為模板板擴增目的基因，50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系如下: 2×Taq Master Mix (Dye Plus) 25 μL、正反向引物各 2 μL;模板 DNA:3 μL、ddH2O 18 μL.反應(yīng)程序為:95 ℃ 3 min 后，95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后 72 ℃ 5 min.PCR結(jié)束后，將產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

1.3.2 原核表達載體的構(gòu)建和鑒定

PCR產(chǎn)物按照北京莊盟生物的瓊脂糖膠回收試劑盒里的操作說明書回收，用微量分光光度計測定回收后的DNA濃度.隨后用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對M基因和原核表達質(zhì)粒pET-28a進行雙酶切(37 ℃，5 h).使用膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，測定回收后的DNA濃度，將目的基因和pET-28a質(zhì)粒的雙酶切回收產(chǎn)物按照3∶1 的摩爾比混合，16 ℃ 過夜連接.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5αE.coli感受態(tài)細胞中，涂布于含 100 μg/mL 卡那抗性的 LB 固體平板上，37 ℃ 過夜培養(yǎng) 14 h.在LB 平板上隨機挑取 5 個單菌落置于含 100 μg/mL 卡那抗性LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃ 培養(yǎng)3～5 h，分別取菌液進行PCR鑒定，陽性克隆子送至擎科生物科技有限公司測序.

1.3.3 目的蛋白M的誘導(dǎo)表達和純化

將測序正確無誤的含重組質(zhì)粒的菌液提取質(zhì)粒 pET-28a-CVS-M(用質(zhì)粒小提試劑盒).將提取出的重組質(zhì)粒 pET-28a-CVS-M轉(zhuǎn)化于E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化菌接種于含卡那抗性的LB培養(yǎng)基試管中,37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)3～5 h 后，然后將菌液按照1∶100接種至含卡那抗性的 300 mL 的LB培養(yǎng)基的 1 L 錐形瓶中，繼續(xù)在 37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD值達到0.6左右時，加入IPTG 至終濃度為 1 mmol/L、4 ℃，50 r/min 誘導(dǎo)表達 12 h，收集菌液.同時設(shè)誘導(dǎo)前的菌體為對照.菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，觀察M蛋白的表達.表達出來的M蛋白通過超聲破碎后離心分為上清和沉淀，其上清為可溶性表達的M蛋白，直接通過Ni柱進行純化，即非變性條件下純化；而沉淀為以包涵體形式存在的M蛋白，用8 M尿素對其蛋白進行變性，使M蛋白暴露出來，再通過Ni柱進行純化,即變性條件下純化；純化步驟參照Seitkamal等[11]，并進行純化產(chǎn)物的分析.純化的M蛋白經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)濃度于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆?

1.3.4 M蛋白鼠多克隆抗體的制備

以重量為 20 g 雌性小鼠作為實驗對象，將純化后的重組M蛋白用PBS稀釋后與不完全佐劑混合.每次取 100 μL 混合物 (含 30 μg 蛋白) 注射到皮下多位點免疫Balb/c小鼠，對照組注射 100 μL PBS 與不完全佐劑混合物，每次免疫間隔 14 d.小鼠免疫 28 d 后，每隔14天進行尾部靜脈采血,用ELISA檢測小鼠血清中M蛋白抗體效價.

1.3.5 ELISA 檢測多克隆抗體的效價

用CBS將重組M蛋白稀釋至 10 μg/mL、100 μL/孔、4 ℃ 包被過夜.次日，棄掉包被液，用PBST洗滌3次；5%脫脂奶 37 ℃ 封閉 2 h，200 μL/孔，PBST洗3次，至孔內(nèi)沒有洗液殘留；加入5%脫脂奶倍比稀釋(1∶100～1∶204 800)的多抗血清，100 μL/孔，37 ℃ 孵育2 h，PBST 洗5 次；加入用5%脫脂奶按 1∶10 000 稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠的IgG，100 μL/孔，37 ℃ 孵育 1 h， PBST洗3次；每孔加入 100 μL TMB顯色液避光反應(yīng) 20 min；50 μL/孔 的2 M H2SO4終止反應(yīng)，測OD 450值，分析數(shù)據(jù).

1.3.6 IFA法檢測多克隆抗體的特異性

將N2A細胞消化鋪96孔板培養(yǎng)，待細胞貼壁后，每孔 2 μL CVS病毒混合后加入到孔中，培養(yǎng) 48 h.細胞培養(yǎng) 48 h 后，回收病毒，使用預(yù)冷的固定液 -20 ℃ 靜置 30 min,通風(fēng)處風(fēng)干96孔培養(yǎng)板.5%脫脂奶于 37 ℃ 封閉 2 h，PBST洗滌3次.加入5%脫脂奶倍比稀釋的鼠多抗血清，37 ℃ 孵育 2 h，PBST洗滌5次.以 1∶1 500 稀釋的FITC-山羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37 ℃ 孵育 1 h，PBST洗滌5次，熒光倒置顯微鏡觀察[12].

1.3.7 狂犬病毒M蛋白多克隆抗體的中和活性測定

將多抗血清放置于 56 ℃ 水浴鍋中滅活 30 min 后，進行倍比稀釋；取 50 μL 多抗血清與等體積含104TCID50/0.1 mL 的狂犬病毒CVS株進行混合，以正常小鼠血清為對照，37 ℃ 反應(yīng) 2 h；然后接種到N2A細胞中培養(yǎng)，每個做三個平行；培養(yǎng) 48 h 后，固定細胞，以實驗室前期制得的抗狂犬病毒N蛋白抗體1N1(1∶1 000)進行IFA檢測，并與正常小鼠血清對比，根據(jù)Spearman/Karber 方法計算血清抗體效價[13].

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增 M 基因

從CVS-11病毒感染的N2A細胞中提取RNA，然后進行RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在500～750 bp 之間出現(xiàn)了一條特異條帶，與目的基因M的理論值 609 bp 一致(見圖1).

1.DL5000 DNA marker；2.PCR擴增的M基因；3.Negative control 圖1 M基因PCR擴增 Fig.1 Amplification of M gene by PCR

2.2 pET-28a-CVS-M重組原核載體鑒定

取 1 μL 菌液作為模板進行 PCR 鑒定，將擴增出與目的基因大小相符的 DNA 片段的重組質(zhì)粒菌液送擎科生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)過NCBI上的BLASTn以及手工比對后顯示，插入載體的片段與目的基因的相似度為100%，插入序列無發(fā)生突變，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-CVS-M(見圖2).

1.DL 5000 DNA marker；2.Negative control；3、4、5、6、7.隨機挑取的5個單菌落.圖2 重組質(zhì)粒 pET-28a-CVS-M PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET-28a-CVS-M

2.3 重組M蛋白表達與純化

重組表達質(zhì)粒pET-28a-CVS-M成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)后，經(jīng)過擴大培養(yǎng)與IPTG 誘導(dǎo)后，對于誘導(dǎo)前后的菌液進行 SDS-PAGE 分析.結(jié)果表明：重組表達菌在 IPTG 誘導(dǎo)下，大量表達相對分子量約為 28 kD 的目的蛋白，大小與預(yù)期相符(見圖3).在Western blotting實驗中，誘導(dǎo)表達出來的重組M蛋白與鼠源His-tag多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，在約 28 kDa 處出現(xiàn)了一條特異性的蛋白條帶，未進行誘導(dǎo)的菌體的蛋白沒有(見圖4)，與SDS-PAGE的分析結(jié)果一致.表明含有His標(biāo)簽的重組M蛋白正確表達.上述結(jié)果證實，本研究已獲得重組M蛋白,測定其濃度為 1 mg/mL.

1.非預(yù)染蛋白maker；2.未誘導(dǎo)菌體；3.誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的細胞沉淀；4.誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的細胞上清；5.純化的重組M蛋白圖3 重組蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

1.未誘導(dǎo)菌體；2.誘導(dǎo)后的菌體；3.非變性條件下純化的重組M蛋白；4.變性條件下純化的重組M蛋白；5.預(yù)染蛋白marker圖4 重組蛋白純化的Western bloting分析Fig.4 Western bloting analysis of recombinant proteins

2.4 CVS-M蛋白小鼠多克隆抗體具有較高的效價和較好的特異性

運用 ELISA 檢測小鼠血清中CVS-M 抗體效價，結(jié)果顯示蛋白與福式佐劑混合物能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體效價達 1∶204 800(見圖5)，表明重組M蛋白具有免疫原性.利用IFA法進一步鑒定所制備的多克隆抗體，結(jié)果顯示，免疫了CVS-M蛋白的小鼠血清對于感染CVS病毒的細胞有陽性反應(yīng)，小鼠血清對于未感染病毒的細胞則無反應(yīng)(見圖6)，說明多抗血清能夠在體外細胞中特異性識別CVS病毒，進而表明本研究制備的鼠抗CVS-M蛋白多克隆抗體可與CVS-M蛋白發(fā)生良好的免疫反應(yīng).

2.5 狂犬病毒M蛋白多克隆抗體的中和活性測定

結(jié)果顯示，本文制備的狂犬病毒M 蛋白多克隆抗體沒有明顯的病毒感染抑制現(xiàn)象，無中和活性.

圖5 鼠抗RABV M蛋白多克隆抗體效價測定Fig.5 Titer determination of mouse polyclonal antibodies against RABV M protein

(a)感染RABV-CVS毒株N2A 細胞 (b)未感染RABV-CVS毒株N2A細胞圖6 鼠抗RABV M蛋白多克隆抗體鑒定Fig.6 Identification of mouse polyclonal antibodies against RABV M protein

3 討 論

狂犬病是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，該病對于所有溫血動物來說都是非常致命的.感染狂犬病會引起神經(jīng)性腦炎，最后會因為呼吸衰竭、無法吞咽而窒息死亡，對發(fā)展中國家人群健康造成嚴(yán)重威脅[14].RABV基因組編碼N、P、M、G和L共5種結(jié)構(gòu)蛋白.狂犬病毒M 蛋白是最小的RABV結(jié)構(gòu)蛋白，也是一個發(fā)揮著多種功能的高豐度蛋白[15].M蛋白在整個狂犬病生命周期中扮演著一個必不可少的角色，它在病毒粒子的裝配、出芽以及病毒形態(tài)的形成這些過程中發(fā)揮著重要作用，也可以調(diào)節(jié)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制之間的平衡，在宿主細胞蛋白合成過程中抑制蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)細胞凋亡[16-17].另外，街毒Nishigahara(Ni)株的M基因被Mita等替換成了Ni-CE株的M基因后，重組病毒使NA細胞產(chǎn)生了細胞病變(CPE);比較這兩株病毒中的M蛋白后發(fā)現(xiàn)，Ni-CE株M蛋白的第95位氨基酸是細胞產(chǎn)生CPE的關(guān)鍵位點，且對病毒的致病性有一定的影響[18].Ito等也證實Ni-CE株M蛋白的第95位氨基酸在細胞病變中發(fā)揮著重要作用，而第29位氨基酸不能使細胞產(chǎn)生明顯的CPE[19]，進而說明M蛋白的第95位氨基酸在病毒致病過程中發(fā)揮著重要作用，Shimizu反向替換這兩株病毒的M基因，發(fā)現(xiàn)Ni-CE株替換Ni株M基因后，重組病毒CE(Ni M)可致死成年小鼠[20].由此可以說明，M蛋白可以影響狂犬病毒的致病性.那么在狂犬病毒致病過程中，單獨的M蛋白分子發(fā)揮著什么作用呢？基于此問題的研究對進一步探討 M 蛋白在RABV致病性中的作用以及研究RABV的致病機制具有重要意義.本項研究誘導(dǎo)表達的RABV-M蛋白正好為研究M 蛋白對RABV致病性的影響以及研究RABV的致病機制提供一個有力的工具.

原核表達系統(tǒng)與真核表達系統(tǒng)的區(qū)別在于能否修飾表達的蛋白，但原核表達系統(tǒng)有成本較低、簡便以及蛋白表達量高等優(yōu)點，經(jīng)常用來表達原核蛋白或者不用翻譯后修飾的真核來源蛋白[21].而桿狀病毒表達系統(tǒng)等方法成功表達RABV-M蛋白，但成本較高，操作繁瑣，并且病毒侵染導(dǎo)致的細胞崩解會造成胞內(nèi)蛋白降解[22].大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，繁殖快、抗污染能力強，表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物分離純化較簡單、穩(wěn)定性好等特點[23].結(jié)合以上表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點，我們選擇了大腸桿菌原核表達系統(tǒng).因此,在本項研究中，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建pET-28-CVS-M原核表達載體，成功實現(xiàn)了M蛋白的原核表達，但在蛋白的誘導(dǎo)表達過程中，M蛋白主要以包涵體形式存在.包涵體有聚集目的蛋白且能抵抗蛋白酶的降解作用,以及對宿主細胞毒性小的優(yōu)點，但也有純化出來的蛋白生物活性較低的缺點[24].因此在誘導(dǎo)表達過程中，我們可以通過降低誘導(dǎo)劑IPTG的濃度、誘導(dǎo)溫度和轉(zhuǎn)速等方法來提高蛋白的可溶性表達[25].在M蛋白的誘導(dǎo)過程中，我們嘗試 1 mM IPTG、16 ℃、120 r/min 誘導(dǎo) 12 h，上清中的M蛋白表達量依然有限，可能與M蛋白的89-107疏水區(qū)有一定的關(guān)系[26].最終，選擇 1 mM IPTG、4 ℃、50 r/min 誘導(dǎo) 12 h,此時M蛋白的表達量最高.在非變性條件下純化出來的重組M蛋白與His-tag多克隆抗體進行間接ELISA反應(yīng)時，結(jié)果不太理想；而在變性條件下純化出來的M蛋白與His-tag多克隆抗體進行間接ELISA反應(yīng)良好；但無論是非變性條件下還是變性條件下純化出來的重組M蛋白與與His-tag多克隆抗體進行Western bloting反應(yīng)時，條帶單一且大小與預(yù)期值符合，說明誘導(dǎo)表達出來的蛋白就是我們需要的目的蛋白.因此，猜測可能在非變性條件下純化重組M蛋白時，重組 M蛋白C末端的 His標(biāo)簽被折疊到重組 M 蛋白空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部，或被其他空間結(jié)構(gòu)掩蓋住，所以重組M 蛋白的 C末端的 His 標(biāo)簽就無法暴露出來，所以重組M蛋白與His-tag多克隆抗體進行間接ELISA時，實驗結(jié)果不太理想.而在變性條件下，幾乎蛋白都失去其空間結(jié)構(gòu)，肽鏈之間或肽鏈內(nèi)部相互作用的化學(xué)鍵斷開，肽鏈被展開，重組M蛋白C末端的 His 標(biāo)簽便裸露出來，所以與His-tag多克隆抗體進行反應(yīng)時，結(jié)果比較理想[22].

當(dāng)前，對于狂犬病毒的檢測主要包括抗原檢測和抗體檢測.其中抗原檢測方法包括病原學(xué)檢查、病毒分離、內(nèi)基氏小體檢查、瓊脂擴散實驗以及熒光抗體病毒中和試驗(FAVNT)[27]等，而對腦組織和唾液等進行直接免疫熒光檢測(FAT)[28]及乳鼠腦內(nèi)接種實驗(MIT)[29-30]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測[31]、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、快速酶免疫診斷(PREID)[32-33]、免疫組織化學(xué)等方法；針對抗體的檢測方法包括血清和細胞病變中和實驗檢測.而在上述的檢測方法中，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)相較于其他檢測方法，操作方法更加簡便，檢測周期更短，不需操作復(fù)雜的儀器以及對周邊環(huán)境要求較低等優(yōu)點，采用間接ELISA的檢測方法時，酶標(biāo)二抗更可放大抗原抗體的結(jié)合效果，提高了靈敏性，更適用于實驗室以及醫(yī)院臨床檢測[34].因此，本研究成功制備了RABV-M蛋白的多克隆抗體，且制備的鼠抗M多克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性，為研制基于M蛋白的RABV間接ELISA抗體檢測方法奠定基礎(chǔ).

4 結(jié) 論

本文通過原核系統(tǒng)成功制備了重組M蛋白，以純化后的M蛋白作為抗原制備相應(yīng)的多克隆抗體，獲得以下主要結(jié)論：

1)通過PCR、雙酶切和測序鑒定，獲得pET-28a-CVS-M原核表達載體.

2)重組表達菌株在 4 ℃、 1 mM IPTG和 50 r/min 條件下誘導(dǎo)表達出M蛋白，純化后蛋白濃度為 1 mg/mL.

3)重組M蛋白免疫Balb/c小鼠獲得多克隆抗體，ELISA和IFA檢測確定抗體具有較高的效價和良好的特異性.