張敬峰， 董永毅， 盧鳳英， 劉青濤， 徐 彬， 趙 莎， 孫華偉， 吳 坤， 張小飛

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)診斷檢測中心，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210036)

鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里氏桿菌(Rimerellaanatipestifer，RA)引起的一種接觸性傳染病，多發(fā)于1～8周齡鴨，可導(dǎo)致大批鴨發(fā)病死亡以及生長遲緩[1]。鴨傳染性漿膜炎不但常見于肉鴨各個(gè)生長階段，還會(huì)引起成年蛋(種)鴨發(fā)病，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，是目前危害中國鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一。RA在自然界尤其是鴨場廣泛分布，其血清型較為復(fù)雜，在世界范圍內(nèi)存在20余種[2]，不同血清型及同型的不同毒株間毒力與免疫保護(hù)率有較大差異。中國目前流行的RA血清型主要以1型為主，也有2型、3型等報(bào)道。由于一般的鴨場、設(shè)施以及飼養(yǎng)方式相對落后，加之RA易形成耐藥性，而上市的含某些RA血清型滅活疫苗因不同地區(qū)流行菌株的不同往往臨床應(yīng)用效果不佳，導(dǎo)致該病的防控較為困難。

本研究對2019年7月-2020年6月在江蘇省、山東省等不同地區(qū)32個(gè)規(guī)模鴨場采集分離的RA菌株進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性研究，了解上述地區(qū)RA感染的優(yōu)勢血清型情況，并針對分離的1型RA流行菌株進(jìn)行交叉攻毒保護(hù)等免疫原性研究，以期對RA的疫苗研發(fā)以及科學(xué)免疫防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

病料樣品為無菌采集的發(fā)病/死亡鴨腦、肝臟等組織。7日齡健康非免疫鴨(經(jīng)間接血凝法測定血清1型RA抗體為陰性)來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院句容黃梅動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 主要試劑

TSA、TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司，馬丁氏湯培養(yǎng)基購自北京奧博星公司，新生牛血清購自呼和浩特草原綠野公司，DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司，SS、MAC培養(yǎng)基、微量生化發(fā)酵管等均購自杭州微生物試劑公司。1型、2型RA標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，礦物油佐劑由南京兆豐華生物科技公司提供。

1.3 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察

無菌操作挑取病死鴨腦組織、心血等病料接種于MAC平板、TSA平板(含2%新生牛血清)以及SS平板，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)菌生長及菌落特征，選取典型菌落分別進(jìn)行純培養(yǎng)，挑取符合特征的單菌落，革蘭氏染色并觀察其形態(tài)。

1.4 分離菌PCR鑒定

參照文獻(xiàn)[3]方法合成RA 16S rRNA鑒定引物，對各分離菌DNA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳觀察分析PCR產(chǎn)物后由南京金斯瑞公司測序。運(yùn)用BLAST將測序結(jié)果與GenBank上登錄的RA進(jìn)行基因序列比對分析[4]。

1.5 分離菌生化試驗(yàn)

按照微量生化反應(yīng)試劑盒說明書，對各株分離純培養(yǎng)物進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.6 細(xì)菌血清型鑒定

載玻片上各滴加生理鹽水20 μl，用接種環(huán)分別挑取方法1.3中純化培養(yǎng)的各菌株菌落2～3個(gè)，在水中混勻后，滴加1型或2型RA陽性血清20 μl，混勻，進(jìn)行凝集法血清分型鑒定。

1.7 分離株致病性試驗(yàn)

1.7.1 菌液制備 分別挑取5株RA1分離株(JP01、JP02、SD02、GY01、XZ01)單菌落各接種于5 ml改良馬丁湯培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫箱振蕩培養(yǎng)24 h。對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后用無菌生理鹽水稀釋成約2.0×109CFU/ml菌液備用。

1.7.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取上述配制好的菌液，頸部皮下注射15日齡健康非免疫鴨各10只，每只注射1 ml，另設(shè)空白對照5只。連續(xù)觀察10日，記錄試驗(yàn)鴨發(fā)病、死亡等情況，剖檢觀察病理變化。參照方法1.3～1.6分別對回收細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.7.3 最小致病劑量的測定 根據(jù)方法1.7.2結(jié)果，選擇其中3株致病力較強(qiáng)的RA1分離菌株，將其培養(yǎng)物分別稀釋為2.0×109CFU/ml，再作2倍、5倍、20倍、100倍稀釋，各稀釋液分別取1 ml皮下注射15日齡健康非免疫鴨。其中試驗(yàn)組鴨分為4組，每組5只，另5只作為陰性對照。接種后連續(xù)觀察10 d，根據(jù)各組鴨發(fā)病及死亡情況統(tǒng)計(jì)出致實(shí)驗(yàn)鴨全部發(fā)病的最小劑量。

1.8 不同分離株免疫原性測定

1.8.1 疫苗制備 將RA1分離株JP01、SD02、GY01分別接種含2%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。按體積加入0.2%甲醛，37 ℃滅活24 h，經(jīng)滅活檢驗(yàn)合格后做為水相，按水相∶油相為1.0∶2.5(體積比)分別制備疫苗，使3個(gè)菌株疫苗的最終含菌量均為3.0×109CFU/ml左右。

1.8.2 分組與免疫 將60只7日齡健康非免疫鴨平均分為4組，其中3個(gè)組為免疫組，1個(gè)組為對照組，每組15只。分別頸背部皮下注射JP01、SD02、GY01菌株滅活疫苗，每羽0.3 ml。另設(shè)一組注射同劑量生理鹽水作為對照。

1.8.3 交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn) 上述實(shí)驗(yàn)鴨免疫后14 d，進(jìn)行交叉攻毒試驗(yàn)。將每一組實(shí)驗(yàn)鴨(包括免疫組和對照組)平均分為3組，每組5只，分別用JP01、SD02、GY01菌株最小致病劑量菌液(1只1 ml)進(jìn)行皮下接種攻毒。在攻毒后10 d內(nèi)，連續(xù)觀察，記錄發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品的細(xì)菌分離及形態(tài)鑒定

病料樣品接種培養(yǎng)24 h后，23株分離菌中有16株在MAC平板、SS平板上未見細(xì)菌生長，但在含2%新生牛血清TSA培養(yǎng)基上生長出大小均勻的小菌落，呈圓形、微突起，直徑約1～2 mm。16株細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，多為單個(gè)排列，培養(yǎng)及形態(tài)符合RA菌落特征[1]。

2.2 分離菌株的PCR鑒定

16S rRNA特異性引物PCR結(jié)果顯示，16個(gè)菌株均可擴(kuò)增出與目的片段800 bp大小一致的條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明與登錄的RA相應(yīng)基因序列同源性均≥99%。根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)，確定該16株分離菌為 RA。

2.3 分離菌株的生化特性

16個(gè)RA分離株均不發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、果糖、蔗糖等多種碳水化合物，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，產(chǎn)生硫化氫，甲基紅(MR)試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性。生化特性均符合RA特征[1]。

2.4 分離菌株的血清型

16個(gè)分離株中有11株與1型RA標(biāo)準(zhǔn)陽性血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，與2型RA標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，表明該11株分離菌為血清1型RA(表1)。

表1 16株RA分離鑒定結(jié)果

2.5 RA分離株的致病性

動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，5株RA1分離株菌液(約2.0×109CFU/ml)分別皮下接種15日齡非免疫鴨后24 h均引起實(shí)驗(yàn)鴨發(fā)病和死亡。其中有3株RA1分離株JP01、GY01、SD02發(fā)病率和死亡率較高，達(dá)到80%～100%，為強(qiáng)毒力菌株；2株RA1分離株JP02、XZ01引起部分鴨發(fā)病和死亡，死亡率為40%～60%，為中等毒力菌株。發(fā)病鴨死亡前期可見精神沉郁、臥地不起、食欲廢絕、眼瞼流淚等癥狀。死亡鴨剖檢觀察顯示：24 h內(nèi)死亡的實(shí)驗(yàn)鴨無明顯病理變化；24～72 h死亡鴨部分肝臟出血，大部分死亡鴨心臟、肝臟表面有灰白色纖維素性滲出物，形成包膜；從病死鴨腦部、肝臟均分離回收到 1 型 RA。

表2 RA1動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

5株RA1分離株最小致病劑量測定結(jié)果(表3)顯示，3株分離強(qiáng)毒力菌株(JP01株、GY01株、SD02株)引起實(shí)驗(yàn)鴨全部發(fā)病的最小致病劑量分別為1.0×108CFU、4.0×108CFU、1.0×109CFU，JP01株毒力最強(qiáng)，其次為GY01、SD02株。

表3 RA1對鴨的最小致病劑量

2.6 RA1分離株的交叉免疫保護(hù)特性

將制備的JP01、GY01、SD02株滅活疫苗免疫7日齡實(shí)驗(yàn)鴨14 d后，連同對照組鴨分別用各菌株的最小致病劑量菌液進(jìn)行交叉攻毒。結(jié)果(表4)顯示：各對照組鴨于攻毒后24 h均陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病、死亡；各免疫組整體精神狀態(tài)良好，于攻毒后48 h出現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)鴨發(fā)病及死亡。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：以JP01株滅活疫苗免疫組保護(hù)率最高，為100%保護(hù)；GY01株滅活疫苗保護(hù)率為60%～80%，SD02株滅活疫苗保護(hù)率為40%～80%。由此可見，JP01株滅活疫苗免疫交叉攻毒保護(hù)性能優(yōu)于GY01、SD02株滅活疫苗，對RA1具有良好的免疫原性。

表4 3株RA1分離株滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

本研究自2019年7月至2020年6月從江蘇省、山東省等同地區(qū)規(guī)模鴨場分離到16株RA,其中11株為RA1型，占RA分離株的68.7%。中國在1997年之前，除了RA1型外，幾乎沒有關(guān)于其他血清型的報(bào)道[5]。隨后幾年間，張大丙等[6]在中國部分地區(qū)分離到2型、6型、10型、11型、13型等多種血清型。2003年程安春等[7]報(bào)道在全國29個(gè)省(市、自治區(qū))病死鴨中分離到1 842株RA，包括17個(gè)血清型，其中RA1型占比為34.9%，為主要血清型。至今鮮見國內(nèi)大范圍的RA血清型調(diào)查研究報(bào)道。2013年劉運(yùn)鎮(zhèn)等[8]報(bào)道在江蘇省多地分離的41株RA菌株中29株為1型，占分離RA的70.7%。2015-2016年袁小遠(yuǎn)等[9]在山東省等地分離的18株RA菌株全部為1型。2018-2019年王昊等[10]在江蘇省蘇北及周邊地區(qū)分離的30株RA菌株中15株為1型，占分離RA的50%。以上三者報(bào)道與本研究RA1分離情況相似，說明RA1仍然是江蘇省、山東省等省份鴨場流行的優(yōu)勢血清型。

RA血清型的準(zhǔn)確鑒定對于獲取流行病學(xué)資料以及免疫防治極其重要。自Harry[11]采用凝集試驗(yàn)進(jìn)行RA血清型鑒定至今，該方法已成為RA菌株分型的主要手段。國際上雖就RA血清型的命名形成了統(tǒng)一認(rèn)識(shí)[12]，但因國內(nèi)近年來缺乏系統(tǒng)性的標(biāo)準(zhǔn)血清相關(guān)研究，傳統(tǒng)的分型方法受標(biāo)準(zhǔn)血清來源以及抗原差異等影響，導(dǎo)致存在某些血清分型上的混淆現(xiàn)象，給RA的免疫防控等造成了一定干擾。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于RA分子學(xué)分型等方法研究也逐漸豐富[13]，期望能夠盡快得到廣泛應(yīng)用。

鴨傳染性漿膜炎在中國被發(fā)現(xiàn)以來，已成為危害鴨乃至水禽養(yǎng)殖業(yè)最主要的細(xì)菌性疾病。2019年張敬峰等[14]報(bào)道顯示鴨疫里氏桿菌陽性率占所檢測的水禽5種主要細(xì)菌性病原的36.01%，其感染發(fā)病在臨床最為常見。由于近年來水禽養(yǎng)殖過程中抗菌藥的頻繁使用以及耐藥菌株不斷產(chǎn)生等因素，導(dǎo)致在鴨細(xì)菌性疾病尤其是鴨傳染性漿膜炎的臨床藥物治療效果越來越差，而藥物殘留也威脅人類健康，影響公共衛(wèi)生安全[15]。防控該病除加強(qiáng)生物安全管理等措施外，疫苗免疫是較為有效的手段,但RA血清型眾多且各血清型之間的交叉保護(hù)作用差[16],血清型的多樣化分布也直接制約了疫苗的免疫效果發(fā)揮。本研究選取RA1流行株對雛鴨進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，從結(jié)果可看出各受試菌株制備的滅活疫苗免疫實(shí)驗(yàn)鴨后，各菌株對同型同源的交叉保護(hù)率均為80%以上，部分菌株對同型不同源的交叉免疫保護(hù)率相對較低，其中SD02菌株滅活疫苗保護(hù)率僅40%～80%，也有如JP01菌株滅活疫苗對同型菌株的攻擊顯示出良好的免疫保護(hù)率(100%)。提示在商品化RA滅活疫苗制備時(shí)除應(yīng)考慮不同血清型RA的存在與分布差異，還應(yīng)在地區(qū)優(yōu)勢血清型中選擇對同型菌株免疫率較高的代表性菌株滅活疫苗。