魏宏宇， 李 怡， 彭帥英， 黃 林， 張 寶， 李昆太， 程 新

(1.江西農業(yè)大學應用微生物研究所，江西 南昌 330045； 2.江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045； 3.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的水溶性多糖，屬于微生物的次級代謝產物[1]，可以分為由一種單糖構成的同多糖和由2種以上單糖構成的雜多糖，對微生物的生長、定殖、抗逆等生理學過程有重要意義[2]，近年來已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等多領域[3]。

多糖類物質在誘導植物抗逆性方面的應用正日益引起人們的關注。相對于其他外源添加物，多糖不僅具有較好的環(huán)境友好特性，同時由于其本身結構的特殊性和分子內活性基團的多樣性，多糖也具有改善土壤特性[4]、提高作物抗逆性[5]、吸附重金屬離子等復合效應，是一種非常具有應用前景的農業(yè)生物材料。相比于其他來源的多糖，微生物所產生的胞外多糖具有產量高、易分離、周期短等特性，但目前對其研究主要集中于食品醫(yī)藥領域，對其在農業(yè)領域的應用研究尚處于起步階段。結合近年來在本領域的研究成果，對目前應用于農作物脅迫領域的產胞外多糖菌株進行了歸納(表1)，并總結了胞外多糖對鹽、干旱、重金屬等脅迫條件下農作物的影響，進而對其影響機理進行總結，并對本領域相關的研究熱點進行展望，旨在推進胞外多糖在農業(yè)領域應用的相關研究。

表1 應用于農作物脅迫領域的產胞外多糖菌株

1 胞外多糖對不同脅迫條件下農作物生長的影響

在農作物生長過程中，環(huán)境變化對農作物所產生的脅迫效應一直是困擾當今農業(yè)發(fā)展的主要問題[46]。不良環(huán)境會造成農作物產量的降低，重金屬等污染物還會對農產品質量安全造成嚴重的威脅[47]。近年來的研究結果表明，胞外多糖的應用可以顯著提高農作物對不同脅迫環(huán)境的抗逆能力[48]，提高作物產量，胞外多糖在農業(yè)生產中具有良好的應用前景[49]。

1.1 胞外多糖調節(jié)鹽脅迫下農作物的生長特性

世界上大約有20%的灌溉土壤受到鹽脅迫的影響，且呈不斷惡化的趨勢[50]，鹽脅迫已成為農作物面臨的重要脅迫之一。近年來，胞外多糖被發(fā)現(xiàn)具有限制Na+流動以及提高植物滲透脅迫耐受性等功能，展現(xiàn)出其在植物耐鹽領域中的非凡潛力[51]。胞外多糖不僅可以顯著降低Na+和Cl-的吸收，提高作物地上部分N、P和K的積累，改善水稻、小麥、玉米、向日葵等農作物在鹽脅迫下的生長性能，提高作物的活力指數，而且胞外多糖的加入對農作物體內光合色素、脯氨酸等物質的含量變化也有著顯著影響，對鹽脅迫下農作物耐鹽性的提高有巨大的作用[7,20,24,31,33,36]。

除單一胞外多糖之外，多種胞外多糖聯(lián)用被證實具有更好的誘導農作物耐鹽脅迫的性能。Upadhyay等[8]將3株產胞外多糖的菌株同時接種到鹽脅迫下小麥幼苗盆栽的土壤中，發(fā)現(xiàn)小麥幼苗的各項生長性能均得到了不同程度的提高，并且相較于接種單一菌株，多菌株聯(lián)用具有更顯著的促進效果。此外，胞外多糖與其他物質聯(lián)用也被發(fā)現(xiàn)具有更好的促生效果。Isfahani等[9]在鹽脅迫下的番茄栽培過程中添加了納米硅、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)及其所產胞外多糖，結果表明，3種物質聯(lián)用能顯著降低脯氨酸含量與抗氧化酶的活性，提高番茄的生長發(fā)育指標。但有趣的是，單一添加菌懸液時該現(xiàn)象卻沒有發(fā)生，這也間接說明胞外多糖在農作物抗鹽脅迫中具有良好的誘導作用。上述研究結果均表明，聯(lián)合使用多種類型胞外多糖或胞外多糖與其他物質聯(lián)用在保護農作物免受鹽脅迫危害方面具有更好的效果，未來胞外多糖與同類型植物逆境保護劑(硅肥、水楊酸、納米硒等物質)聯(lián)用，在保護農作物免受鹽脅迫危害方面將是一種新思路。

1.2 胞外多糖調節(jié)干旱脅迫下農作物的生長特性

隨著全球變暖的趨勢逐漸增快，各地干旱化情況不斷惡化，土壤含水量急劇下降，農業(yè)生產受到嚴重威脅[52]。有研究結果[11,29-30,32,42]表明，胞外多糖在保持土壤濕度、提高農作物抗旱性等方面具有顯著作用。接種產胞外多糖微生物或直接外源施加胞外多糖，不僅可以促進玉米、小麥、小米等農作物的根長、芽長、干質量、葉面積等生長指標，同時，對作物的根系附著土壤與根系組織比(RAS/RT)、土壤團聚體的穩(wěn)定性、葉片的相對含水量(RWC) 等指標也起到顯著改觀的作用，而植物體內與抗旱相關的基因的相對表達量也會大幅度上升，進一步激活農作物的抗旱性。當采用產胞外多糖菌株及其所產胞外多糖進行復合處理時，植株的抗旱性均表現(xiàn)為增強，與單一接種菌懸液相比差異顯著[10]，證明胞外多糖是誘導農作物抗旱能力提高的關鍵因子。

另有研結果究表明，干旱脅迫下微生物胞外多糖的產量與其在農作物根部的定殖作用呈正相關[28]，這表明胞外多糖在根際微生物與植物溝通過程中可能扮演著中間者的角色，是干旱脅迫下根際微生物與植物共生關系中關鍵的一環(huán)，但目前有關這一過程的機制研究尚不多見，有待進一步深入。

1.3 胞外多糖調節(jié)重金屬脅迫下農作物的生長特性

重金屬不僅對農作物造成強烈的氧化脅迫，危害農作物的健康生長，同時還會通過食物鏈進入人體，嚴重威脅人類的健康[53]，尋求合適的處理方式以緩解重金屬對農作物的脅迫效應已成為目前的研究重點。大量研究結果[12,43-44,54-56]表明，胞外多糖對環(huán)境中的Cu、Cd、Pb等重金屬離子具有良好的吸附性，能有效緩解重金屬離子在農作物體內的積累效應，使得農作物的安全性大大提升；同時，胞外多糖還具有改善重金屬脅迫條件下農作物生長發(fā)育的功能，水稻、菠菜等農作物的常規(guī)形態(tài)學指標(根長、芽長、干質量、鮮質量等)均得到明顯改觀，葉綠素a、葉綠素b等光合色素含量均顯著增加，并且代表農作物營養(yǎng)程度的磷酸鹽含量、氮含量等也有所提升。

但值得注意的是，胞外多糖對重金屬的吸附過程受到pH等環(huán)境因素的調節(jié)[57]，而不同類型土壤具有不同的理化性質，因此其應用效果會隨著使用環(huán)境的不同而發(fā)生相應的變化。

1.4 胞外多糖調節(jié)病原菌脅迫下農作物的生長特性

植物病原菌是引發(fā)植物發(fā)生侵染性病害的微生物，在正常農業(yè)生產中，感染植物病原菌會造成大面積的農作物生長不良，通常伴隨爛葉、爛根、爛果的發(fā)生，進而引發(fā)較大數額的經濟損失并對種植場所造成污染[58]，因此長期以來，預防和治理由植物病原菌引起的病害是農業(yè)領域中經常面臨并亟需解決的問題之一。胞外多糖具有很好的體外抑菌活性，能顯著抑制環(huán)境中致病菌的生理活性及毒性[59]，同時具有阻止病原微生物生物膜形成的能力，近年來得到了廣泛關注[60]。現(xiàn)有研究結果表明，胞外多糖對農作物中頻發(fā)的紋枯病、稻瘟病、灰霉病、細菌性斑疹病等由病原菌引起的疾病有很好的預防及防治作用[16,25-26]。外源直接添加胞外多糖或接種產胞外多糖的菌株不僅能顯著提高番茄、水稻等農作物的形態(tài)學指標，還能增強植物體內多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脂氧合酶(LOX)等的活性，提高農作物的光合速率，顯著降低各種疾病的發(fā)病率，有效緩解田間植物病原菌對農作物的毒害作用。

有趣的是，部分植物病原菌被發(fā)現(xiàn)也具有產胞外多糖的能力，并且胞外多糖的合成能力與其毒力大小直接相關，在協(xié)助病原菌抵抗植物的防御系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用[61]。因此，有學者嘗試直接采用植物病原菌所產胞外多糖激活植物體內的防御系統(tǒng)，以提高植物整體抗病能力，從而達到有效防治的作用。Keshkeih等[15]嘗試用侵染棉花的棉花角斑病病菌(Xanthomonascitripv.Malvacearum) 所產胞外多糖作為誘導劑，成功地減少了易感多毛棉品種中的細菌數量。上述發(fā)現(xiàn)給本領域的相關研究提供了一個嶄新的思路，即，不僅可從有益微生物入手，也可以利用植物病原菌所產的胞外多糖來激發(fā)植物的一系列正向應激反應。

2 胞外多糖調節(jié)農作物抗性的作用機理

胞外多糖可以提高脅迫狀態(tài)下農作物的抗逆性已得到廣泛的證實，并且有大量文獻對其作用機理進行了不同程度的闡述。綜合現(xiàn)有研究結果來看，胞外多糖對農作物抗逆性的作用機理主要包括以下幾個方面(圖1)。

圖1 胞外多糖提高農作物抗性的作用途徑Fig.1 Pathways of improving crop resistance by exopolysaccharides

2.1 胞外多糖改變土壤結構

土壤是農作物生長的基礎，土壤的理化性質直接影響農作物的生產效率和生產水平[62]。近年來，隨著化肥的大量使用，土壤結構受到了極大的破壞，板結、沙化等問題日益嚴重，一定程度上降低了農業(yè)生產效率。微生物所分泌的胞外多糖作為土粒的有效膠結劑，可以通過親水、吸水、保水的復合作用影響土壤結構[63]，在提高土壤質量方面有顯著成效。已有大量研究結果證實，胞外多糖產量與土壤結皮厚度、土壤團聚體穩(wěn)定性等土壤性質呈極顯著相關[64]。

胞外多糖改良土壤的活性取決于其獨特的結構。胞外多糖是由多個連續(xù)或不連續(xù)的單糖片段組成的網狀分子，這造就了胞外多糖強大的黏附性，能使其黏合在土壤顆粒表面，形成一個被大量土壤顆粒包圍的中間區(qū)域，土壤顆粒和胞外多糖在該區(qū)域不斷黏合，逐漸形成微團聚體(直徑<250 μm)和大團聚體(直徑>250 μm)，最終使得土壤中完全分散的土壤顆粒聚集在一起(圖2)，顯著提高土壤團聚體的比例及其穩(wěn)定性[17]，進而影響土壤的持水量、水分分布狀況及土壤水分蒸發(fā)速率等土壤水分指標[65]，起到緩解水分流失的作用。類似地，由于胞外多糖優(yōu)秀的黏合性，胞外多糖的加入同樣會對植物根系附近的土壤產生聚集作用[21]，從而導致根系附著土壤與根系組織的比例上升[19]，根系表面土壤的覆蓋范圍增大，進而在植物根系表面形成土壤鞘[41]，有效隔絕環(huán)境中生物與非生物因素所帶來的的不良影響，達到促進植物對土壤養(yǎng)分合理利用的效果[66]。

除土壤結構之外，胞外多糖還可以緩解土壤酸化，提高土壤中土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶等的活性，進而能有效分解土壤中的有機質，對土壤養(yǎng)分有明顯的改善效果[67-68]，但目前該方面的研究較少，其關鍵作用機制有待進一步深入研究。

2.2 胞外多糖促進根際微生物的生物膜形成

農作物根系與土壤等所構成的微環(huán)境是作物良好生長的核心保障，同時也是多種微生物及其代謝產物的“戰(zhàn)場”，對作物生長調節(jié)、抗逆性、營養(yǎng)物質吸收轉運等具有非常重要的調節(jié)作用[69]，而胞外多糖在這一過程中被發(fā)現(xiàn)有復雜且多變的正向效應。當具有產胞外多糖能力的微生物黏附于植物根系表面后，會通過分泌包括胞外多糖在內的多種胞外物質，以大幅度增強菌體與菌體之間、菌體與植物根系之間的黏附性，從而達到整個微生物群落富集于植物根系表面的作用[70]。并且在這一過程中，隨著黏附在植物根系表面的菌體數量不斷增多，胞外多糖含量也不斷得到增長，過多的胞外多糖便會在菌體表面形成一層水凝膠基因，最終形成生物膜覆蓋在根系表面[40,71](圖2)，從而對環(huán)境中脅迫因子起到有效隔離作用[21]，進而對作物生長產生調節(jié)作用。以假單胞菌屬為例，藻酸鹽(Alginate)是假單胞菌屬所能分泌的一類胞外多糖，主要負責黏合載體表面的菌落，也是細菌生物膜的主要成分，在Upadhyay[37]構建的Alginate合成基因alg8缺失突變株中，不僅發(fā)現(xiàn)生物膜無法有效形成，而且吲哚乙酸產量、鐵載體產量、溶磷能力等植物促生特性也急劇下降。此外，Alenezi等[34]在對具有良好生物防治性能的米氏硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillusmigulanus)Nagano及其同屬的米氏硫胺素芽孢桿菌 NCTC 7096進行全基因組比對后發(fā)現(xiàn)，NCTC 7096缺失了胞外多糖生物合成途徑中的第一個關鍵合成酶基因——聚戊烯基糖基磷酸轉移酶基因，最終導致了NCTC 7096不具備胞外多糖產生能力，無法形成生物膜，使得生物防治效果同Nagano相比較差。綜上所述，胞外多糖在土壤微生物定殖過程中扮演著不可替代的地位，能有效改變農作物根部微環(huán)境，促進生物膜的形成，在微生物-植物互作方面具有一定潛力。

圖2 胞外多糖改善土壤結構，促進生物膜形成Fig.2 Improving soil structure and promoting biofilm formation by exopolysaccharides

2.3 胞外多糖影響金屬離子吸收

土壤中含有大量的金屬離子，其中包括農作物生長所必需的各種大量或微量金屬元素，同時也包括對農作物生長形成嚴重氧化脅迫的鎘、鉛等重金屬離子[72]，在保障農作物正常生長的同時解除重金屬離子帶來的毒害作用是目前農作物栽培過程中亟待解決的問題之一?，F(xiàn)有研究結果表明，胞外多糖具有豐富的活性基團(如-OH和COO-等)，可以通過螯合作用與土壤中的金屬離子形成多糖-陽離子復合物[73]，改變金屬離子的價態(tài)和生物學活性[74]，進而影響作物對不同金屬離子的吸收效率[22,39]，最終導致金屬離子在植物不同器官與細胞上的分布發(fā)生改變[75]，以此完成對農作物響應重金屬脅迫的調節(jié)。

但值得注意的是，胞外多糖的螯合作用并不具備特異性，除重金屬離子之外，各種植物所必須的金屬陽離子(鋅、銅、錳等)也會受到胞外多糖的螯合作用[76]，過度使用胞外多糖螯合金屬離子也必然會造成農作物養(yǎng)分含量的降低，因而尋求胞外多糖用量與土壤肥力之間的平衡點也是日后實際應用過程中所需解決的問題之一。

2.4 胞外多糖調節(jié)農作物生理代謝

胞外多糖對脅迫條件下農作物生理代謝的調控機理十分復雜，目前國內外尚未有學者闡明其關鍵調控路徑，但大部分研究結果表明可能與農作物體內的活性氧自由基 (ROS) 水平有關[77]。ROS在農作物體內以超氧陰離子自由基(O2·-)、過氧化氫(H2O2)等形式存在，能夠充當信號分子介導農作物的抗氧化防御系統(tǒng)，但ROS在細胞內的水平卻受到嚴格的調控，ROS過度積累往往會導致細胞不可逆的氧化損傷，嚴重危及農作物的正常生長[78]。而胞外多糖作為一種微生物源活性物質，已被多次證實是ROS的激活劑[45,79]，且作用效果在根部尤為明顯[80]。當胞外多糖外源加入時會迅速引起植物體內的ROS爆發(fā)，從而作為信號直接影響SOD、CAT、POD等抗氧化系統(tǒng)酶的活性[5,16,33,36]，而抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化影響細胞壁合成通路，進而對植物根系的細胞壁代謝起到調節(jié)作用，導致植物根系組成發(fā)生變化，影響植物根系的結構[81]，最終對植物代謝造成一系列應答反應(圖3)。上述現(xiàn)象在本課題組前期研究中同樣得到了證實[13,82]，此外，本課題組研究還發(fā)現(xiàn)，抗氧化系統(tǒng)酶活性變化與植物生長周期也有極大關系[14]，說明胞外多糖對農作物產生影響是一個動態(tài)過程。

Phe：苯丙氨酸；PAL：苯丙氨酸解氨酶；ML：木質素單體；ox.ML：木質素單體氧化態(tài)；POD：過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶； ROS：活性氧自由基；SOD：超氧化物歧化酶；APX：抗壞血酸過氧化物酶；MDHA：單脫氫抗壞血酸；ASA：抗壞血酸；GSH：谷胱甘肽(還原型)；LA：亞麻酸； LOX：脂氧合酶；JA：茉莉酸。圖3 胞外多糖調節(jié)農作物生理代謝的途徑Fig.3 The physiological metabolism pathways in crops regulated by exopolysaccharides

另外，激增的ROS也會與植物激素互作進而造成一系列正向響應[83]。諸多植物激素前體物質的含量諸如亞麻酸、新植二烯和維生素E(生育酚)等含量均會在胞外多糖的刺激下顯著增加[22]，并且在茉莉酸合成途徑中起關鍵作用的LOX及脂氧合酶(GhLOX1)活性也會受到胞外多糖的正向調節(jié)作用[15,25-26]。在植物激素與ROS的共同調節(jié)作用下，植物光合作用受到正反饋調控，各類葉綠素含量顯著提高[24,36,38]，光合速率明顯增加[27]，最終形成正反饋循環(huán)。而在接種了胞外多糖的缺陷突變株體內不僅沒有ROS爆發(fā)現(xiàn)象的發(fā)生，而且各類生理生化指標的變化均與對照無顯著差異[6,35,41]，這也直接證明了胞外多糖造成的ROS爆發(fā)是引起植物一系列響應的關鍵機制，但是就目前而言，并未有詳細的分子機制闡明胞外多糖究竟是如何引起ROS爆發(fā)的，相關研究仍有待跟進。

3 展 望

近年來，隨著對胞外多糖研究的不斷深入，其在農業(yè)生產中的應用也逐漸受到科研人員的關注。從總體來看，在以下幾個領域還需要開展系統(tǒng)的研究。

3.1 胞外多糖提高農作物脅迫抗性的機理

農作物的生長代謝受到外界環(huán)境因子的綜合調控[84-85]，胞外多糖對植物的生理調節(jié)同樣是一個非常復雜的生理過程，涉及到土壤理化性質改變、細胞結構變化、生理代謝調整等多個相互關聯(lián)又相互獨立的方面，盡管現(xiàn)有的大量研究從不同角度闡述了胞外多糖對植物抗逆性的改善和提高效應，但這些研究大多只關注于某一個或幾個方面，缺少整體性的研究。近年來，多組學研究(Multi-Omics)[86-87]、長期定點栽培[88]等技術被廣泛應用于植物生長代謝和抗逆性研究，并取得了較好的研究成果[89]。因此，選擇合適的研究工具和技術，從整體代謝的角度研究胞外多糖對植物抗逆性的影響機理，將是未來的研究熱點之一。

3.2 外界條件對胞外多糖結構及其生理活性的影響

胞外多糖是微生物改善土壤結構、提高農作物脅迫抗性的主要物質[68, 90]，微生物合成胞外多糖的能力受環(huán)境因素的影響[91]。由于微生物賴以生存的環(huán)境存在差異，因此每一種微生物所分泌的胞外多糖不同，即使是同種微生物，也會因為環(huán)境條件的差異而合成不同結構與生物學活性的胞外多糖[92-93]，碳源等營養(yǎng)物質的差異也會影響胞外多糖的生物學活性與產量[94]。研究結果表明，胞外多糖的生物學活性、功能及其結構之間存在顯著的關聯(lián)[13,94]，但從現(xiàn)有的研究結果來看，目前的研究基本上都聚焦在胞外多糖結構改變與其體外生物學活性之間的關聯(lián)方面，而有關其結構變化與誘導農作物抗性之間的研究尚未見報道，仍有待進一步研究。

3.3 胞外多糖對植物根際微生物區(qū)系及微生態(tài)系統(tǒng)的影響

根際微生物區(qū)系與植物生理代謝之間的相互作用已成為近年來的研究熱點[95-96]。在不利條件下，植物根際微生物區(qū)系會發(fā)生一定的改變，進而對植物的生理代謝產生影響[97]。而隨著外源胞外多糖的加入，植物根際土壤結構會發(fā)生很大的變化，同時會引起土著菌結構與功能的變化[98-99]。近年來，有部分研究涉及到外源性物質添加對植物根系微生物區(qū)系的影響[100]。隨著外源胞外多糖的加入，植物根系微生物區(qū)系究竟會發(fā)生何種變化，這種變化與土壤結構、植物生長之間又存在怎樣的相互影響，這些問題依然需要進行深入的研究。

3.4 寡糖類物質在農業(yè)生產中的應用

寡糖為2～10個單糖通過α或β-糖苷鍵連接組成的直鏈或支鏈天然碳水化合物[101]。與大分子多糖類物質相比，寡糖的相對分子質量低、水溶性好且易被生物體吸收，具有更廣泛的應用前景。不同來源的寡糖在植物種植領域已被證明具有促進植物生長、誘導抗病性產生及改善農產品品質等多種作用，不僅可以提高農作物的防御反應[102]，同時還可以用于水果、蔬菜的保鮮等領域[103]，是一種非常有應用前景的生物大分子活性物質。

目前，寡糖在農業(yè)生產中的應用基本上以殼寡糖[104]和海藻寡糖[105]為主，而在微生物胞外多糖領域，目前的研究與應用基本以直接使用產胞外多糖菌株或粗多糖為主，而應用微生物源寡糖的研究則少見報道，對于微生物源寡糖的制備工藝和應用效果的研究也尚不多見。