張 嵐，朱 迪,2，姜國(guó)忠 (.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052；2. 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052)

我國(guó)是食管癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，食管鱗癌約占總確診病例的90%[1-2]。食管鱗癌作為高侵襲性惡性腫瘤，其疾病進(jìn)展迅速，患者預(yù)后較差，5 a總體生存率較低，Ⅳ期患者的中位生存期不足1 a，大多數(shù)食管鱗癌患者早期不易發(fā)現(xiàn)，初次確診時(shí)已處于中晚期階段[3-5]。近年來(lái)，雖然在食管鱗癌的診斷和治療方面取得了突破性進(jìn)展，但其患者的生存率并沒(méi)有顯著提高[5-6]。因此，更好了解食管鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制，識(shí)別新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高食管鱗癌的早期診斷和治療水平顯得尤為重要。

人類(lèi)基因組研究項(xiàng)目的結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，有超過(guò)70%的人類(lèi)基因組可轉(zhuǎn)錄為RNA，但大多數(shù)是非編碼RNA，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)作為一類(lèi)新的內(nèi)源性非編碼RNA，是通過(guò)反向剪接方式產(chǎn)生的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏5’帽結(jié)構(gòu)和3’多聚腺苷酸尾，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和進(jìn)化保守性等特點(diǎn)，對(duì)多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程均有影響[7-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro RNA，miR)是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)寡核苷酸的非編碼小RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制參與靶基因的調(diào)控，而circRNA可作為miR分子海綿以發(fā)揮其調(diào)控作用。研究[10-15]證實(shí)circRNA在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，具有作為腫瘤標(biāo)志物的可能性。同樣，對(duì)circRNA全方位、多層面的研究將有助于我們對(duì)食管鱗癌的深入了解，并對(duì)食管鱗癌的早期診斷及其靶向治療提供新思路。

課題組前期已對(duì)所提取的73對(duì)食管鱗癌腫瘤組織及其癌旁正常組織的總RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)circRNA的表達(dá)在食管鱗癌組織中存在顯著差異性，hsa_circ_0009244(circ-9244)便是其中之一[5]。因此，本研究通過(guò)對(duì)食管鱗癌腫瘤組織及癌旁正常組織中circ-9244的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)circ-9244在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)水平，且與食管鱗癌患者預(yù)后不良有關(guān)，并進(jìn)一步探討下調(diào)circ-9244的表達(dá)水平對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、臨床標(biāo)本及主要試劑

1.1.1 細(xì)胞 食管鱗癌細(xì)胞系及正常食管上皮細(xì)胞Het-1A均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 臨床標(biāo)本 來(lái)自安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院食管鱗癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，標(biāo)本均在術(shù)中快速液氮凍存。本研究中入組的所有患者均簽署了知情同意書(shū)，并在術(shù)前沒(méi)有進(jìn)行任何放療、化療和靶向治療。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25% EDTA胰蛋白酶消化液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine?2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；T4-DNA連接酶及EcoRI-HF/AgeI-HF內(nèi)切酶均購(gòu)自中國(guó)NEB公司；PLKO.1-TRC克隆載體購(gòu)自廣州吉賽生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、MTS試劑購(gòu)自北京普瑞金科技有限公司；Transwell小室及Matrigel基質(zhì)膠均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；實(shí)驗(yàn)用引物均有北京擎科生物技術(shù)有限公司鄭州分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)Circular RNA Interactome網(wǎng)站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)設(shè)計(jì)circ-9244的siRNA序列，并依據(jù)addgene網(wǎng)站(https://www.addgene.org/protocols/plko/)中PLKO.1-TRC克隆載體的要求設(shè)計(jì)目的基因circ-9244的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA ，shRNA)序列(表1)。其shRNA設(shè)計(jì)原則如下：正向引物：5’CCGG--21 bp sense--CTCGAG--21 bp antisense--TTTTTG 3’；反向引物：5’AATTCAAAAA--21 bp sense--CTCGAG--21 bp antisense 3’；各取5 μL正反引物(20 μm)，退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；用AgeI-HF和EcoRI-HF對(duì)PLKO.1-TRC克隆載體進(jìn)行37 ℃過(guò)夜雙酶切；用T4-DNA 連接酶將線(xiàn)性化載體和 shRNA 目的片段按照1：10比例16 ℃過(guò)夜連接；按 1：10 比例將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化并置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜孵育；挑取單菌落進(jìn)行菌液鑒定并送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)構(gòu)建成功的PLKO.1-circ-9244-shRNA質(zhì)粒進(jìn)行提取和保存。

表1 circ-9244-shRNA序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞株KYSE410、KYSE520，37 ℃水浴鍋中迅速解凍后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入3 mL完全培養(yǎng)基，巴氏管輕吹混勻后1 000 r/min離心3 min；棄上清并加入3 mL完全培養(yǎng)基，巴氏管輕吹混勻后均勻鋪至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。運(yùn)用牛鮑計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和鋪板，12孔板細(xì)胞密度以每孔細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)為宜，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)；次日按照轉(zhuǎn)染試劑與待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒2：1比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)circ-9244表達(dá)水平及shRNA下敲效果 分別對(duì)食管鱗癌細(xì)胞、正常食管上皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)染48 h的空載組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行RNA提取并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將cDNA原液用雙蒸水稀釋到100 ng/μL。選取上游引物circ-9244-F：AGGCTCAACGAGGAACTCAA、下游引物circ-9244-R：GTCCTGGCTCCATCCAAT；上游引物GAPDH-F：ACCCAGAAGACTGTGGATGG、下游引物GAPDH-R：TTCAGCTCAGGGATGACCTT。根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置qRT-PCR反應(yīng)體系，設(shè)定反應(yīng)條件，每個(gè)指標(biāo)做3個(gè)復(fù)孔。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選出下敲效率較高的PLKO.1-circ-9244-shRNA 質(zhì)粒。

1.2.4 MTS實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)分組對(duì)轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，空載組為僅轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒48 h且不涉及 circ-9244 表達(dá)量改變的細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染下敲質(zhì)粒48 h且與circ-9244表達(dá)量改變相關(guān)的細(xì)胞組。按照每孔5 000個(gè)細(xì)胞、100 μL培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)指標(biāo)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，共測(cè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)：0、12、24、36、48和60 h，計(jì)算各個(gè)實(shí)驗(yàn)組所需細(xì)胞懸液量和需補(bǔ)加的完全培養(yǎng)基的量依次鋪于96孔板中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6～8 h。然后按照完全培養(yǎng)基與MTS試劑10：1的比例配制反應(yīng)體系，避光輕吹混勻，棄去0 h組中舊培養(yǎng)基，并依次取110 μL的MTS溶液加到各個(gè)孔中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～2 h后，輕拍混勻，酶標(biāo)儀上測(cè)492 nm處的光密度(optical deasity,OD)值，作為0 h數(shù)據(jù)；每隔12 h測(cè)下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值，直至6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)完為止，將數(shù)據(jù)保存并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)分組對(duì)轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(分組同上)，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)鋪于12孔板中，每個(gè)指標(biāo)做3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。在12孔板中央均勻劃線(xiàn)，并清洗脫落的細(xì)胞，在顯微鏡下拍照保存，作為0 h劃痕結(jié)果。每隔24 h進(jìn)行拍照，依次拍攝24、48 h劃痕結(jié)果，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 首先對(duì)Transwell小室(含matrigel膠)進(jìn)行水化處理并按照實(shí)驗(yàn)分組對(duì)轉(zhuǎn)染48 h、進(jìn)行饑餓處理的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，空載組為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒48 h、進(jìn)行饑餓處理12 h且不涉及circ-9244表達(dá)量改變的細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染下敲質(zhì)粒48 h、進(jìn)行饑餓處理12 h并與circ-9244表達(dá)量改變相關(guān)的細(xì)胞組；以每小室5×104個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種于各個(gè)Transwell小室中，并在下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，每個(gè)指標(biāo)各做3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。甲醇固定30 min，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%結(jié)晶紫室溫染色0.5～1 h。顯微鏡下拍照保存，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 circ-9244在不同食管組織中的表達(dá)及其與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系隨機(jī)選取前期研究的55對(duì)食管鱗癌組織分析circ-9244表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，其表達(dá)水平在腫瘤組織中升高約3.8倍(t=2.862，P=0.005)；并根據(jù)circ-9244相對(duì)表達(dá)量分組進(jìn)行食管鱗癌患者預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，與circ-9244低表達(dá)組比較，circ-9244高表達(dá)組患者預(yù)后較差(P=0.038)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 circ-9244在不同食管組織中表達(dá)比較

2.2 circ-9244不同食管細(xì)胞中的表達(dá)circ-9244在KYSE270、KYSE410及KYSE520細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較高。見(jiàn)圖3。

圖2 不同circ-9244表達(dá)食管鱗癌患者生存曲線(xiàn)比較

圖3 circ-9244在不同食管細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 PLKO.1-circ-9244-shRNA質(zhì)粒下敲效率的鑒定選取circ-9244相對(duì)高表達(dá)的KYSE410和KYSE520細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染PLKO.1-NC-shRNA質(zhì)粒(空載組)和PLKO.1-circ-9244-shRNA質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)，以篩選具有較高下敲效率的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載組比較，實(shí)驗(yàn)組PLKO.1-circ-9244-shRNA2質(zhì)?？擅黠@下調(diào)circ-9244的表達(dá)水平(KYSE410細(xì)胞：t=3.013，P=0.010； KYSE520細(xì)胞：t=5.959，P=0.004)。見(jiàn)圖4。

圖4 不同PLKO.1-circ-9244-shRNA質(zhì)粒下敲效果的驗(yàn)證

2.4 MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取下敲效率高的PLKO.1-circ-9244-shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述circ-9244高表達(dá)KYSE410和KYSE520細(xì)胞，48 h后運(yùn)用MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖效率，結(jié)果表明，與空載組比較，實(shí)驗(yàn)組食管鱗癌細(xì)胞增殖效率、劃痕愈合率及穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(KYSE410細(xì)胞：t=12.345，P<0.001；KYSE520細(xì)胞：t=7.941，P<0.001)。見(jiàn)圖5。

圖5 下調(diào)circ-9244表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取PLKO.1-circ-9244-shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KYSE410和KYSE520細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與空載組比較，實(shí)驗(yàn)組敲低circ-9244表達(dá)后食管鱗癌細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(KYSE410細(xì)胞：t=10.910，P<0.001；KYSE520細(xì)胞：t=8.499，P<0.001)。見(jiàn)圖6。

圖6 下調(diào)circ-9244表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取高下敲效率的PLKO.1-circ-9244-shRNA2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至circ-9244高表達(dá)KYSE410和KYSE52 細(xì)胞，48 h Transwell結(jié)果表明，與空載組比較，實(shí)驗(yàn)組食管鱗癌穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(KYSE410細(xì)胞：t=11.040，P<0.001；KYSE520細(xì)胞：t=10.720，P<0.001)。見(jiàn)圖7。

圖7 下調(diào)circ-9244對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

食管癌是具有高度侵襲性、高發(fā)病率和高致死率的消化道惡性腫瘤之一，食管鱗癌作為食管癌常見(jiàn)組織類(lèi)型，大多數(shù) 食管鱗癌 患者都伴有晚期疾病，5 a生存率常低于20%，病死率較高[16]，這對(duì)人類(lèi)的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。且該腫瘤早期不易發(fā)現(xiàn)，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因[17-18]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)提高食管鱗癌患者的生命質(zhì)量顯得尤為重要。

CircRNA作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA的一個(gè)亞類(lèi)，是通過(guò)反向剪接方式形成的一類(lèi)新型核糖核酸分子，具有共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以抵抗核酸外切酶的降解作用，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。且近10 a的研究[19-20]已經(jīng)表明circRNA以其獨(dú)特的生物學(xué)屬性和多樣的生物學(xué)功能對(duì)包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展均具有重要的調(diào)節(jié)功能。如circRNA可以通過(guò)miR的 “海綿”吸附作用、親本基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用及競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RNA結(jié)合蛋白等作用發(fā)揮生物學(xué)功能[21-22]，且某些circRNA可以通過(guò)m6A甲基化修飾來(lái)促進(jìn)翻譯[23]。

本研究前期對(duì)食管鱗癌腫瘤組織與癌旁配對(duì)組織中circRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具有差異表達(dá)的circ-9244[16]。Circ-9244的宿主基因SDF4，又名 Cab45，通過(guò)選擇性剪接可以形成三種不同的亞型，屬于鈣離子結(jié)合蛋白超家族中的一員[24-26]，且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Cab45 在Panc1胰腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌LIM1215細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞和食管癌細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，并促進(jìn)上述腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[27]。因此，我們猜想是否可以通過(guò)干擾circ-9244在食管鱗癌中的生物合成過(guò)程來(lái)降低其在食管鱗癌中的表達(dá)水平，從而達(dá)到抑制食管鱗癌惡性行為的進(jìn)展。

本研究以前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)circ-9244在食管鱗癌腫瘤組織中呈高表達(dá)水平，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。通過(guò)構(gòu)建circ-9244下敲質(zhì)粒并成功轉(zhuǎn)染至食管鱗癌細(xì)胞中，根據(jù)MTS實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)分別觀察空載組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的數(shù)量，結(jié)果均表明下調(diào)circ-9244的表達(dá)水平可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。由此推測(cè)抑制circ-9244的表達(dá)可以減弱食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，從而阻止食管鱗癌的惡性進(jìn)展。因此，circ-9244或可成為下一個(gè)食管鱗癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。