王春美，任艷嬌，盛光耀 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是兒童常見的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，因其較高的復(fù)發(fā)率及治療相關(guān)的死亡率，5 a無病存活率僅為40～50%左右[1-3]，伴有FMS樣酪氨酸激酶3-內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(FMS-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication, FLT3-ITD)突變的患者預(yù)后更差[4-6]。雖然FLT3抑制劑索拉菲尼、舒尼替尼、吉瑞替尼已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但因?yàn)樗幬锏陌踩约澳退幮詥栴}，部分患者不能使用上述藥物治療。同時(shí)對(duì)于腫瘤的治療，單個(gè)藥物的作用是有限的，臨床上多采取多種藥物聯(lián)合化療方案。我們前期研究證實(shí)，AML細(xì)胞株THP-1細(xì)胞中存在FLT3/p65/核輔抑制子維甲酸/甲狀腺受體沉默因子(silencing medtiator for retinoic acid and thyroid hormone receptor, SMRT)信號(hào)通路的異?；罨?，p65小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、FLT3 siRNA均可有效抑制THP-1細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討聯(lián)合阻斷FLT3、p65對(duì)THP-1細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株THP-1細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫，使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、0.05 mol/L 2-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑FLT3 siRNA、p65 siRNA、control siRNA、鼠抗人FLT3單克隆抗體、鼠抗人核因子κB (nuclear factor κappa B, NF-κB)p65單克隆抗體和山羊抗人SMRT多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)、兔抗山羊IgG-HRP和3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-Diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8(cell counting kit-8, CCK-8)試劑盒和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 細(xì)胞增殖的檢測收集處于指數(shù)期生長的THP-1細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μL/孔)，100 μL含有4 000個(gè)細(xì)胞。設(shè)對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)、NC-siRNA組(control siRNA轉(zhuǎn)染組)、FLT3 siRNA組、P65 siRNA組及FLT3 siRNA+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組(聯(lián)合組)，每組設(shè)3復(fù)孔，分別于0、24、48、72、96、120、144、168 h取1塊培養(yǎng)板，每孔加10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，上酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光值(A450)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4 細(xì)胞凋亡的檢測本研究采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。具體步驟如下：按照siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書的要求轉(zhuǎn)染細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，分別將含有FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA和siRNA轉(zhuǎn)染試劑的混合液與細(xì)胞共孵育6 h，后更換正常血清和抗生素2倍的培養(yǎng)基，孵育18 h后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為2～5×105個(gè)/mL，取195 μL 細(xì)胞懸液至一個(gè)干凈無菌的試管中，并加入5 μL Annexin V-FITC，暗室中孵育10 min；室溫1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重懸細(xì)胞于190 μL的結(jié)合液中；加入5 μL的PI染色液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。Annexin-V染色陽性、PI染色陰性的細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞周期的檢測離心收集FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA處理48 h的細(xì)胞，PBS洗滌后離心，棄上清，加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇1 mL，4 ℃過夜孵育。次日再次離心、棄上清、重懸細(xì)胞，依次加入RNaseA(終濃度50 mg/L)、PI(100 mg/L)，室溫避光孵育30 min；上流式細(xì)胞儀檢測各周期的細(xì)胞。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測FLT3、p65和SMRT mRNA的表達(dá)根據(jù)基因庫中靶基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，β-actin基因作為內(nèi)部參照。細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取收獲的細(xì)胞總RNA，按照實(shí)驗(yàn)操作說明反轉(zhuǎn)成cDNA第一鏈，然后取l μL cDNA、0.5 μL的FLT3、p65、SMRT及β-actin上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，體積分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析各PCR產(chǎn)物。各目的基因mRNA相對(duì)含量(M)=目地基因吸收峰面積/β-actin吸收峰面積。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 Western blotting檢測p65和SMRT蛋白的表達(dá)離心收集FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA處理48 h的THP-1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，-80 ℃冰箱凍存。Bradford法測定蛋白濃度。蛋白樣本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，使用含體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液于4 ℃環(huán)境中封閉過夜。一抗(鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體，山羊抗人SMRT多克隆抗體，1：200稀釋)室溫孵育2 h，依次使用TBST溶液、TBS溶液洗滌，對(duì)應(yīng)的二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h，依次使用TBST溶液、TBS溶液洗滌，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光，膠片掃描后使用Image-Pro Plus 5.0軟件分析灰度值結(jié)果。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測FLT3蛋白的表達(dá)離心收集FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA處理48 h的THP-1細(xì)胞，分組同前，分別加入10 μL的FLT3抗體，室溫避光反應(yīng)30 min；PBS洗滌后重懸細(xì)胞；每管加入10 μL山羊抗鼠IgG1-FITC二抗10 μL，混勻后避光反應(yīng)30 min；PBS洗滌后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測FLT3蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞增殖曲線的比較FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯(lián)合組的細(xì)胞增殖明顯受抑制，增殖曲線低平，缺乏指數(shù)增殖的特征，以聯(lián)合組的細(xì)胞增殖曲線最為顯著；第6天后，當(dāng)細(xì)胞密度≥1×106個(gè)/mL，對(duì)照組的死亡細(xì)胞數(shù)量增加，A450明顯下降。見圖1。

圖1 各組THP-1細(xì)胞增殖曲線比較

2.2 各組細(xì)胞凋亡的比較FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯(lián)合組處理THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞的早期凋亡率分別為(11.05±3.87)%、(14.2±4.57)%和(21.29±4.74)%，較對(duì)照組[(1.36±1.03)%]及NC-siRNA組[(1.56±0.94)%]均顯著增加(F=22.311,P<0.001)，以聯(lián)合組最為明顯。

2.3 各組細(xì)胞周期的比較FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯(lián)合組處理THP-1細(xì)胞后，G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加(F=32.705,P<0.001)，S期的細(xì)胞比例顯著減少(F=42.611,P<0.001)，但G2/M期的細(xì)胞比例無明顯變化(F=0.967，P=0.467)，以聯(lián)合組的作用最為明顯，提示細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期至S期的阻滯。見表2。

表2 各組THP-1細(xì)胞周期比較 %

2.4 各組FLT3、p65和SMRT mRNA的表達(dá)FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯(lián)合組中FLT3 mRNA的表達(dá)明顯降低(F=22.311,P<0.001)，以聯(lián)合作用最為明顯；p65 siRNA及聯(lián)合組中p65 mRNA的表達(dá)明顯降低(F=88.911,P<0.001)；p65 siRNA及聯(lián)合組中SMRT mRNA的表達(dá)均明顯增高(F=7.736,P=0.005)。見表3。

表3 各組THP-1細(xì)胞中FLT3、p65和SMRT mRNA表達(dá)比較

2.5 各組FLT3、p65和SMRT蛋白的表達(dá)FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯(lián)合組中FLT3蛋白的表達(dá)明顯降低(F=128.78,P<0.001)，以聯(lián)合作用最為明顯；p65 siRNA及聯(lián)合組中p65蛋白的表達(dá)明顯下降(F=27.591,P<0.001)；p65 siRNA及聯(lián)合組中SMRT蛋白的表達(dá)均明顯增高(F=6.123,P=0.009)。見表4。

表4 各組THP-1細(xì)胞中FLT3、p65和SMRT蛋白表達(dá)比較

3 討論

AML的發(fā)生是涉及多基因參與、多步驟累及、多因素影響的復(fù)雜的過程[9]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及基因檢測的開展，對(duì)AML分子機(jī)制的研究越來越深入，小分子靶向治療也納入了兒童AML的常規(guī)化療過程中[10]。目前已發(fā)現(xiàn)了200多種與AML發(fā)病有關(guān)的基因重排及基因突變，部分已明確與AML的不良預(yù)后有關(guān)[5,11]。目前針對(duì)不良預(yù)后基因的分子靶向治療是腫瘤研究的熱點(diǎn)，但是任何一種藥物的作用是有限的，多靶點(diǎn)聯(lián)合用藥阻斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展才有可能是根治腫瘤的有效手段[12]

目前臨床上已研發(fā)出FLT3特異性抑制劑，包括第1代的索拉菲尼、舒尼替尼等，第2代的吉瑞替尼、奎扎替尼等，但是只作為常規(guī)治療的聯(lián)合用藥，提示FLT3抑制劑的抗腫瘤作用是有限的[13-15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3和p65均可作為THP-1細(xì)胞FLT3/p65/SMRT信號(hào)通路中的分子靶標(biāo)，分別抑制FLT3、p65表達(dá)均可有效抑制THP-1細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可影響下游相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了聯(lián)合抑制FLT3和p65表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3 siRNA、p65 siRNA及兩者聯(lián)合作用均可有效抑制THP-1細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G0/G1期到S期的阻滯，聯(lián)合組的作用效果最為顯著，但并不是FLT3 siRNA、p65 siRNA單獨(dú)作用的簡單疊加，提示FLT3 siRNA、p65 siRNA可能通過某種未知機(jī)制存在的協(xié)同作用。

通過對(duì)FLT3/p65/SMRT信號(hào)通路中相關(guān)分子的研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3 siRNA、p65 siRNA及聯(lián)合組中FLT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，以聯(lián)合組的結(jié)果最為明顯；p65 siRNA及聯(lián)合組中p65mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少，但兩者間無顯著差異；p65 siRNA及聯(lián)合組中SMRT mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增高，2組間的表達(dá)無明顯差異；FLT3 siRNA組p65和SMRT mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯變化，提示雖然聯(lián)合抑制FLT3和p65表達(dá)的作用更強(qiáng)，但FLT3/p65/SMRT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并不是FLT3 siRNA、p65 siRNA影響THP-1細(xì)胞的唯一途徑，具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究在細(xì)胞水平證實(shí)了聯(lián)合抑制FLT3和p65表達(dá)治療AML的有效性，因此同時(shí)以FLT3和p65為分子靶點(diǎn)的靶向治療可作為AML治療策略的研究方向之一。