游金坤，岳萬松，孫達(dá)鋒，崔佳麗，李雪松，吳素蕊**

（1．中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；3．云南省藥物研究所，云南 昆明 650000）

粉褶白環(huán)蘑[Leucoagaricus leucothites（Vittad．）]隸屬傘菌目（Agaricales） 蘑菇科（Agaricaceae） 白環(huán)蘑屬（Leucoagaricus）。目前國內(nèi)外關(guān)于粉褶白環(huán)蘑的報道較少，僅有個別形態(tài)學(xué)特征、毒理學(xué)特征[1-3]以及栽培方面的[4-5]研究報道。其中，粉褶白環(huán)蘑毒理學(xué)特征的相關(guān)報道尚存在爭議，有研究人員認(rèn)為其具有胃腸道毒性，不能食用；有學(xué)者認(rèn)為其無毒，能夠食用且氣味溫和鮮美，具有一定經(jīng)濟價值，甚至有科研人員親自食用以證明其無毒[5-8]。因此，亟需對野生的粉褶白環(huán)蘑進(jìn)行鑒定及毒性評價研究，以期為粉褶白環(huán)蘑的快速識別及食用安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

野生子實體樣品于2021年采集自云南省昆明市晉寧區(qū)。采集到的新鮮樣品先經(jīng)拍照、觀察，后分為3份。1份凍存于-20℃冰箱，1份于50℃烘箱烘干，1份直接用于DNA的提取。

1.2 品種鑒定

1．2．1 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定采用傳統(tǒng)方法，肉眼觀察野生子實體的菌柄、菌蓋和菌褶的大小、顏色等宏觀形態(tài)特征，同時使用游標(biāo)卡尺測量相關(guān)數(shù)據(jù)。通過參考《中國大型菌物資源圖鑒》[9]進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢索、對比，完成初步鑒定。

1．2．2 ITS 序列鑒定

1） 基因組DNA的提取

取子實體樣品，采用CTAB提取法[10]進(jìn)行總DNA的提取。

2） PCR擴增、純化及測序

使用PCR擴增儀進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，引物為上海生工生物工程技術(shù)公司合成的通用引物ITS1、ITS4[11]，反應(yīng)體系為50 μL。經(jīng)PCR擴增后，進(jìn)行1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增后的PCR產(chǎn)物使用Takara純化試劑盒進(jìn)行純化[12]，純化后的PCR樣品送至昆明碩擎生物科技有限公司完成測序。

1.3 急性經(jīng)口毒性試驗

1．3．1 試驗動物

SPF級ICR小鼠，6周齡～8周齡，體重18 g～35 g，同性別試驗動物個體間的體重差不超過平均體重的20%。試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙） 2019-0001，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。雌雄動物分籠飼養(yǎng)，每籠5只，每日光照12 h，自由采食和飲水。

1．3．2 給藥設(shè)計

參照參考文獻(xiàn)[13]，同時根據(jù)粉褶白環(huán)蘑毒性、研究現(xiàn)狀及試驗動物特性進(jìn)行給藥設(shè)計。最大給藥容積為40 mL·kg-1，按最大給藥容積、最大給藥濃度給藥；以給藥當(dāng)天動物禁食后的體重計算給藥量。

1．3．3 粉褶白環(huán)蘑樣品準(zhǔn)備

鮮樣品處理：取凍存于-20℃的鮮品，解凍后剪碎、研磨，加少量超純水球磨勻漿，得到均一的勻漿液。稀釋勻漿至設(shè)定的樣品質(zhì)量濃度，即0．37 g·mL-1和 0．74 g·mL-1，其中 0．74 g·mL-1為小鼠可給予的最大給藥濃度。

干樣品處理：烘干的樣品粉碎，過100目篩，獲得粉褶白環(huán)蘑粉末。稱取粉末以超純水混勻，使樣品質(zhì)量濃度分別為 0．083 g·mL-1和 0．170 g·mL-1，其中0．170 g·mL-1為小鼠可給予的最大給藥濃度。經(jīng)檢測其鮮品的水分含量為88．83%，則干樣品對應(yīng)的鮮品品的質(zhì)量濃度分別為 0．74 g·mL-1和 1．52 g·mL-1。

1．3．4 給藥試驗及給藥后觀察

將50只ICR小鼠隨機分為5個組，每組雌雄各半。組別設(shè)置為干品1組（9．96 g·kg-1）、干品2組（20．40 g·kg-1）、鮮品1組（44．40 g·kg-1）、鮮品2組（88．80 g·kg-1）及溶劑對照組。動物禁食不禁水約6小時后，每間隔4小時分別給予各劑量組粉褶白環(huán)蘑樣品，共給藥3次；于第2次給藥2小時后給予少量飼料；末次給藥后喂飼常規(guī)飼料，自由飲水。

給藥前、給藥當(dāng)天及給藥后連續(xù)14 d觀察各組動物的一般癥狀及體征。觀察動物是否出現(xiàn)與受試物相關(guān)的異常癥狀和體征，觀察至動物恢復(fù)或死亡。分別于給藥后1 d、2 d、4 d、7 d、14 d時稱量動物體重；14 d觀察結(jié)束后動物犧牲，進(jìn)行大體解剖觀察病理學(xué)變化。臨床觀察指標(biāo)包括皮膚、被毛、眼、粘膜以及呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等。觀察并記錄動物毒性癥狀產(chǎn)生的時間、程度、持續(xù)時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1．4．1 鑒定數(shù)據(jù)處理

將測得的ITS序列（編號BHM） 用DNAMAN進(jìn)行拼接，ITS序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對。用MEGA 5．1將獲得的多條參考序列進(jìn)行多重對位排列，并手動去除排列結(jié)果中兩端的非對位排列區(qū)，對堿基組成、保守位點、信息位點等序列特征進(jìn)行分析。用MEGA 5．1中的K-2-P（Kimura-2-parameter）模型計算遺傳距離，構(gòu)建距離矩陣。以香菇（Lentinula edodes） 為外群，用鄰接法NJ（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．4．2 急性經(jīng)口毒性試驗數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22．0分析，均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本間平均值差異采用t檢驗，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

野生新鮮大型真菌樣品子實體形態(tài)特征見圖1。

圖1 野生大型真菌樣品子實體形態(tài)Fig．1 Morphology of fruit body of wild macrofungi sample

如圖1所示，野生子實體樣品的菌蓋直徑為5 cm～11 cm，呈白色至奶油色，表面光滑，有時出現(xiàn)龜裂，中央有時淺灰色至灰色；菌肉呈白色；菌褶離生，幼時白色，成熟后米色或略帶粉色；菌柄長度為 5 cm～15 cm，直徑為 0．5 cm～2．0 cm，圓柱形，幼時白色，成熟后中下部多呈灰褐色。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步將其鑒定為白環(huán)蘑屬真菌（Leucoagaricus sp．）。

如圖1所示，拍攝時子實體不具菌環(huán)，但根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，白環(huán)蘑屬真菌應(yīng)具菌環(huán)，菌環(huán)中位，白色至奶油色，且不易脫落。因此，需要采用分子手段進(jìn)一步進(jìn)行菌株鑒定。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過rDNA-ITS鑒定方法，以樣品的ITS序列及與其高度相似的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，NJ聚類分析結(jié)果見圖2。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2 Phylogenetic tree based on ITS sequence

如圖2所示，測序比對結(jié)果表明野生子實體樣品序列BHM與GenBank中編號為OL653103、MT535726．1和MN202793的3個粉褶白環(huán)蘑菌株的ITS序列相似性高達(dá)100%；結(jié)合子實體形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果，將該野生子實體鑒定為粉褶白環(huán)蘑 [Leucoagaricus leucothites（vttad）．]。

2.3 急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

粉褶白環(huán)蘑口服急毒性試驗期間所有動物均存活，且大體解剖未發(fā)現(xiàn)任何臨床異常癥狀。在試驗期間，4個粉褶白環(huán)蘑給藥組體重及體重增長百分率與對照組間無顯著性差異。

鮮品2組ICR小鼠經(jīng)口給予粉褶白環(huán)蘑鮮品極限急性毒性劑量88．80 g·kg-1后，3/5只雌性小鼠出現(xiàn)活動減少、俯臥、弓背的動作行為影響癥狀；其中1只雌性小鼠還出現(xiàn)瞇眼、蜷縮成團的動作行為影響癥狀；以上癥狀均在給藥后2分鐘出現(xiàn)，持續(xù)13 min～33 min 后恢復(fù)正常。而干品劑量 9．96 g·kg-1（相當(dāng)于鮮品劑量88．80 g·kg-1）及干品極限急性毒性劑量20．40 g·kg-1（相當(dāng)于鮮品劑量183．00 g·kg-1）試驗組中，均未觀察到與受試物相關(guān)的異常。

試驗中粉褶白環(huán)蘑鮮品、干品的小鼠最大可耐受給藥劑量換算至人分別為683 g/人、157 g/人（相當(dāng)于鮮品1 411 g/人）。以上結(jié)果表明，粉褶白環(huán)蘑的半數(shù)致死量LD50（lethal dose 50%） 遠(yuǎn)大于實際無毒級別劑量（500 g/人）。

3 討論

粉褶白環(huán)蘑經(jīng)口急性毒性試驗結(jié)果表明，粉褶白環(huán)蘑的鮮品、干品均為實際無毒級別食品。研究結(jié)果提示，急性極限服用粉褶白環(huán)蘑鮮品情況下，雌性小鼠可能出現(xiàn)活動神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)肌肉系統(tǒng)中動作行為受抑制的癥狀；但該癥狀在更高劑量（相當(dāng)于攝入鮮品極限急性毒性劑量的2倍）的干品組中并未出現(xiàn)。由此表明粉褶白環(huán)蘑干品食用安全性高于鮮品，在其干品制備過程中可減弱或消除鮮品中可能含有的毒性成分的影響；且可能毒性成分對小鼠的影響具有性別差異。相關(guān)可能作用機制將在后續(xù)對粉褶白環(huán)蘑的開發(fā)中進(jìn)行研究。

環(huán)柄菇類真菌分類復(fù)雜，種類繁多且外形特征相似，部分環(huán)柄菇如酒紅環(huán)柄菇（Lepiota josserandii Bon&Boiffard）、褐鱗環(huán)柄菇 （Lepiota helveola Bres．）等為劇毒品種[14-15]。而環(huán)柄菇類真菌多分布于草坪、路邊、森林邊緣等極易被采食的位置，誤食有毒環(huán)柄菇導(dǎo)致中毒的風(fēng)險概率極高。通過此次研究，證明了粉褶白環(huán)蘑為實際無毒級別食品，為其快速識別及食用安全性提供了理論基礎(chǔ)。已有研究表明，粉褶白環(huán)蘑氣味溫和，味道鮮美，子實體貨架壽命比一般肉質(zhì)食用菌長2倍～3倍，且常溫下保存不易變軟或腐爛[5]，是值得進(jìn)一步開發(fā)的新型野生食用菌。因此，對粉褶白環(huán)蘑進(jìn)行鑒定及安全性評估的研究不僅具有科學(xué)和生態(tài)學(xué)意義，而且具有產(chǎn)業(yè)潛力，可為其開發(fā)利用及大規(guī)模的商業(yè)化栽培提供了科學(xué)依據(jù)。