代新紀，杜 璠，梁詠亮，朱學泰**

（1．西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070；2．寧夏賀蘭山國家級自然保護區(qū)管理局，寧夏 銀川 750021）

賀蘭山紫蘑菇是我國寧夏回族自治區(qū)賀蘭山和內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟地區(qū)著名的野生食用菌，因其個體碩大、肉質(zhì)肥厚、味道香醇、口感爽滑、營養(yǎng)豐富，被譽為“賀蘭山珍”，也是當?shù)厝嗣窬促涃F賓的特色禮品。

賀蘭山紫蘑菇主要分布于賀蘭山上，海拔為2 100 m～2 800 m的青海云杉林下[1]，其發(fā)生量受植被類型、溫度、濕度、水分、營養(yǎng)、pH和光照等因素的綜合影響[2]，迄今為止未能被成功馴化栽培。近年來，由于過度采集，野生資源日趨減少，亟需開展保護和可持續(xù)利用研究。

賀蘭山紫蘑菇在市場上已售賣多年，但其物種名稱一直存在爭議。王春穎和白明生[3-4]稱之為紫色絲膜菌（Thaxterogaster purpurascens）；對賀蘭山紫蘑菇進行活性成分研究的一些學者將其統(tǒng)稱為紫紅絲膜菌 （Calonarius rufoolivaceus）[5-6]；張靠穩(wěn)[7]基于形態(tài)特征分析，認為賀蘭山紫蘑菇可能包含紫紅絲膜菌、藍絲膜菌（Phlegmacium caerulescens）、白絲膜菌（Cortinarius albidus） 和血紅絲膜菌（Cortinarius cinnabarinus）等物種。物種名稱的混亂，影響了對賀蘭山紫蘑菇資源的研究和深度開發(fā)。因此有必要對其學名進行準確考證，促進對這一自然資源的保護和可持續(xù)開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

賀蘭山紫蘑菇樣本：zhu2908子實體，購自寧夏賀蘭山下；zhu2933、zhu2152、zhu2154和zhu3842新鮮子實體，分別采集于寧夏回族自治區(qū)賀蘭山及甘肅省景泰縣壽鹿山、青海省祁連縣八寶鎮(zhèn)。以上標本目前均保存于西北師范大學生命科學學院真菌標本室。

1.2 形態(tài)特征研究

宏觀形態(tài)特征依據(jù)新鮮子實體標本的野外觀察記錄。在解剖鏡（Motic SMZ-171）下徒手切取各部分組織，浸在5%KOH溶液中制作玻片；在光學顯微鏡（ZEISS AX10）下觀察顯微結(jié)構(gòu)；經(jīng)剛果紅染液染色，用相機（Canon 70D）拍攝顯微照片。隨機各選取20個成熟的孢子、擔子進行測量，其長、寬以（a） b～c（d） 表示，a和d分別表示測量的最大值與最小值，b和c表示90%的置信區(qū)間；孢子長寬比用Q表示，Qm的值為Q的平均值±標準差 （±SD）[8]。

1.3 分子系統(tǒng)學鑒定

1．3．1 ITS 提取與測序

用大型真菌DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek,Inc．USA） 提取樣本總DNA，對內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)片段（internal transcribed spacer） 進行擴增。PCR引物為ITS5/ITS4 （ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTACAAG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。擴增條件：94℃預變性3 min；95℃變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)38次；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京奧科鼎盛生物科技有限責任公司測序。

1．3．2 序列比對分析

將測序結(jié)果在BioEdit 7．13．0軟件上選取有效部分，上傳至GenBank獲取序列號，于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，得到20個確定種名的近源種ITS序列。同時下載賀蘭山紫蘑菇曾經(jīng)被鑒定為的物種和Calonarius屬模式種C.typicus序列[3-7]，以最大似然法 ML（maximum likelihood） 和鄰接法 NJ（neighbor joining） 采用 MEGA-X 10．2．2 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap均重復1 000次。外類群的選擇參考了Liimatainen等[9]的研究結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

對賀蘭山紫蘑菇樣品進行宏觀形態(tài)特征分析，詳見圖1。

圖1 賀蘭山紫蘑菇樣品擔子果Fig．1 The basidiocarp of Helanshan Zimogu samples

如圖1所示，擔子果傘形，中型至大型。菌蓋直徑為30 mm～160 mm，幼時半球形至扁半球形，成熟后逐漸平展，邊緣稍內(nèi)卷。表面淺紫褐色、紫褐色、紅棕色或褐赭色，中央常龜裂，周圍光滑。菌褶直生至近彎生，較密，不等長，褶緣波浪狀，幼時淺黃色，成熟后棕褐色或茶色。菌蓋中心菌肉厚度達25 mm，肉質(zhì)，污白色，稍帶紫色調(diào)；無特殊氣味，略有苦味。菌柄杵狀至紡錘狀，中實，長度為30 mm～90 mm，直徑為10 mm～40 mm，基部膨大至30 mm～50 mm；頂端常呈淺灰紫色，中部、下部常呈淺黃褐色至淺紅棕色；菌柄菌肉與菌蓋菌肉顏色相同。內(nèi)菌幕為銹褐色，密集，成熟后逐漸粘連在菌柄上部和菌蓋邊緣。

對賀蘭山紫蘑菇樣品進行顯微形態(tài)特征分析，詳見圖2。

圖2 中華絲膜菌的顯微結(jié)構(gòu)Fig．2 Microstructure of Calonarius sinensis

如圖2所示，擔孢子呈桃核狀，大小為 [（8．5）9．0～12．5 （14．0）]μm × [（5．5） 6．0～7．0 （7．5）]μm，Qm=1．60±0．02；黃棕色，有明顯疣狀突起，無囊狀體，遇KOH溶液顯銹褐色，孢子印呈銹褐色。擔子棒狀，大小為 （22．5～33．5） μm×（6．5～9．0） μm，具 4個孢子梗，無色或略帶黃灰色，壁薄，具有鎖狀聯(lián)合。菌蓋表皮交織黏毛皮狀，菌絲直徑為3．5 μm～6．5 μm，淺褐色，浸沒在膠狀基質(zhì)中，覆褐色顆粒物，附著物在KOH溶液中逐漸消失。菌褶、菌髓規(guī)則型，由直徑為 3．5 μm～7．5 μm 的無色菌絲組成。

基于ITS序列，采用最大似然法和鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，二者的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，僅支持率略有差異?；谧畲笏迫环?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，僅展示、分析BP（Bootstrap percentages） 值≥50%的結(jié)果，詳見圖3。

圖3 基于ITS序列采用最大似然法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．3 Molecular phylogenetic tree based on an ITS dataset using maximum likelihood

如圖3所示，分子系統(tǒng)學發(fā)育樹的結(jié)果綜合形態(tài)學觀察分析，均顯示檢測的賀蘭山紫蘑菇是魏鐵錚等[9]于2020年發(fā)表的中華絲膜菌（Cortinarius sinensis L．H．Sun,T．Z．Wei&Y．J．Yao 2020）。分析與Calonarius屬模式標本Calonarius typicus的比對結(jié)果可知，被測菌株所在分支與其的分支支持率較高，BP1/BP2為96/98；根據(jù)2022年最新研究，Liimatainen等[10]依據(jù)分子系統(tǒng)學將絲膜菌屬拆分為10個屬；隨著分子系統(tǒng)學的發(fā)展和絲膜菌屬分類學研究的不斷深入，大多學者也傾向于將龐大的絲膜菌屬分成若干個單系的組[11-13]。此次檢測結(jié)果中，與購入的賀蘭山紫蘑菇zhu2908和野外采集的賀蘭山紫蘑菇zhu2933、zhu2152、zhu2154、zhu3842菌株 ITS序列相似度最高的Cortinarius sinensis分支中，包含了C.sinensis品種的最新模式標本MK411466。因此，根據(jù)最新的絲膜菌分類系統(tǒng)，中華絲膜菌的學名應為Calonarius sinensis（L．H．Sun,T．Z．Wei&Y．J．Yao）X．J．Dai&X．T．Zhu comb．nov．（MycoBank 843797）。

3 討論

中華絲膜菌與Calonarius cupreorufus、Calonarius pseudocuproorufus和紫紅絲膜菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上顯示出較近的親緣關系；且其子實體大小相近，都具有粗壯的菌柄和膨大的基部，菌幕的生長狀態(tài)和顏色變化也很相似；但 C.cupreorufus和 C.pseudocupreorufus沒有顯著的紫色調(diào)[9]，而紫紅絲膜菌的子實體紫色偏紅，擔子相對較大[14]。同時，這些物種的ITS序列存在至少9個堿基的取代和indel位置的偏差。

曾有學者根據(jù)宏觀形態(tài)特征將賀蘭山紫蘑菇鑒定為紫色絲膜菌、藍絲膜菌、白絲膜菌和血紅絲膜菌等[3-7]。與這些物種相比較，中華絲膜菌的菌蓋表皮為單層，擔孢子檸檬狀至桃核狀，且表面具明顯疣狀凸起。系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果顯示，中華絲膜菌與紫色絲膜菌、藍絲膜菌、白絲膜菌和血紅絲膜菌均未聚為一支，存在較遠的遺傳差異。

研究結(jié)果顯示，除賀蘭山區(qū)外，中華絲膜菌在青海省大通縣和祁連縣、甘肅省天祝縣和景泰縣以及內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗等地的青海云杉林下均有分布。該物種的自然資源儲量和譜系地理分布特征值得進一步研究和探討。

作為外生菌根真菌，中華絲膜菌在西北地區(qū)脆弱的森林生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用。由于采集時子實體周圍的苔蘚被大片掀開，大量菌絲體因暴露于空氣中而死亡，近年來，本應大量出菇的7月～8月卻減產(chǎn)了。為防止中華絲膜菌資源枯竭，避免對森林生態(tài)系統(tǒng)帶來威脅，應號召當?shù)厝罕姴扇≌_的采摘方式，保護其賴以生存的苔蘚層。同時控制采摘量，保留一定量的成熟菇，使其完成有性生殖過程，保證中華絲膜菌野生資源的可持續(xù)開發(fā)和利用。