胡萍，童周，肖雪洋，孔璐琦，胡琳珍

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)湖北省重點實驗室， 湖北 武漢430062)

0 引言

病毒性肝炎是由不同肝炎病毒引起的一種傳染病，或?qū)⑦M(jìn)一步惡化為肝纖維化和肝癌[1]等疾病.據(jù)WTO數(shù)據(jù)顯示，每年大約有145萬人死于病毒性肝炎[2].目前，治療病毒性肝炎的藥物主要有干擾素、核苷酸類似物等，但由于它們易產(chǎn)生耐藥性，臨床應(yīng)用非常受限制.中草藥作為我國歷史悠久的傳統(tǒng)藥物，具有多成分、多靶點及毒性低等特點[3].田基黃注射液是由地耳草水提物制取的單味制劑，具有清熱解毒、散痰化腫和保肝護(hù)肝等功效，臨床上常用于治療小兒黃疸和各類急慢性肝炎等疾病.文獻(xiàn)報道田基黃注射液具有抑菌、抗腫瘤和抗病毒性肝炎等藥理活性[4].然而，田基黃注射液抗病毒性肝炎的具體作用機(jī)制尚少見報道.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于文獻(xiàn)調(diào)研和各類數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)而構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，從而將中藥-疾病-靶點聯(lián)系起來，進(jìn)而系統(tǒng)分析中藥多組分對疾病多靶點的作用機(jī)制[5-6].本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接工具對田基黃注射液抗病毒性肝炎的活性成分及作用機(jī)制進(jìn)行探索，為未來進(jìn)一步深入研究奠定理論基礎(chǔ)和研究方向.

1 方法

1.1 田基黃注射液活性化合物獲取從TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 數(shù)據(jù)庫中篩選田基黃注射液的活性化合物.采用口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選閾值.

1.2 活性化合物的相關(guān)靶點STITCH (http://stitch.embl.de/)、SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/)、PharmMapper (http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/) 3個數(shù)據(jù)庫中以“Homo sapiens”和概率值≥0.7為標(biāo)準(zhǔn)篩選潛在活性化合物的預(yù)測靶點.去除每個數(shù)據(jù)庫中的重復(fù)基因后，將3個數(shù)據(jù)庫的并集基因?qū)氲経niprot (http://www.uniprot.org/) 數(shù)據(jù)庫中，獲得各個基因的ID格式；在GeneCards (https://www.genecards.org/) 數(shù)據(jù)庫中篩選病毒性肝炎的已知靶點；再用OmicShare (https://www.omicshare.com/) 將篩選后得到的化合物預(yù)測靶點與疾病已知靶點取交集，得到化合物和疾病的重疊靶點.

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將重疊靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫 (https://www.string-db.org)，以“Homo sapiens”和置信度0.4為標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò).

1.4 GO和KEGG富集分析在DAVID數(shù)據(jù)庫中 (https://david.ncifcrf.gov/) 對重疊靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析.GO分析主要從生物過程，細(xì)胞組分和分子功能進(jìn)行分析；運用Graphpad軟件對GO結(jié)果進(jìn)行可視化.對重疊靶點進(jìn)行KEGG富集分析，選擇排名前十的KEGG通路為可能的信號通路.

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建“活性化合物-重疊靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，并運用Cytoscape3.7.2的Network Analyzer分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù).

1.6 分子模擬對接分別從TCMSP數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫中下載活性化合物的分子結(jié)構(gòu)和重疊靶點的蛋白結(jié)構(gòu).運用DS20程序進(jìn)行化合物-靶點虛擬對接，并用PyMOL進(jìn)行化合物-蛋白復(fù)合物的3D可視化分析.

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的獲取田基黃注射液主要成分為地耳草的水提取物，在TCSMP數(shù)據(jù)庫中，輸入“diercao”按照OB≥30%、DL≥0.18為閾值共篩選出8種活性化合物，分別是quercetin、mairin、kaempferol、β-sitosterol、sitosterol、tetramethoxyluteolin、poriferasterol monoglucoside_qt和3,5,7,3′,5′-pentahydroxy flavonol.

2.2 篩選重疊靶點利用STITCH、SwissTargetPrediction和PharmMapper 3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測8種活性化合物的相關(guān)靶點，篩選標(biāo)準(zhǔn)為活性化合物與假定靶點之間的相互作用≥0.7.去除重復(fù)后，共獲得243個假定靶點.從GeneCards數(shù)據(jù)中篩選已知病毒性肝炎的靶點，并將已知靶點與假定靶點進(jìn)行交集，共獲得5個重疊靶點(圖1)，分別是F2、MET、EGFR、AKT1和MAPK1.

圖1 重疊靶點

2.3 重疊靶點GO和KEGG通路分析為了闡釋活性化合物與重疊靶點之間的關(guān)系，我們進(jìn)一步探究了這些重疊靶點可能具有的生物功能.我們將5個重疊靶點進(jìn)行GO和KEGG分析.圖2是GO對化合物的生物學(xué)功能注釋結(jié)果.此外，KEGG的結(jié)果(圖3)顯示了關(guān)鍵靶基因(MAPK1、AKT1、 EGFR、MET)在Rap1信號通路、Ras信號通路和PI3K-AKT信號通路上有較多富集.

圖2 重疊基因富集結(jié)果

圖3 KEGG富集分析結(jié)果

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將5個重疊靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)中，得到重疊靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4).該網(wǎng)絡(luò)是由5個節(jié)點和7條邊組成.其中，平均節(jié)點度為3.2，平均局部聚類數(shù)為0.867，PPI富集值P值為0.109.

圖4 重疊靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與分析為了進(jìn)一步探討活性化合物與重疊靶點之間的關(guān)系，我們利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建了“活性化合物-重疊靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)(圖5).根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析選擇排名靠前的活性化合物為quercetin、β-sitosterol和sitosterol.

圖5 活性化合物-重疊靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 活性化合物和關(guān)鍵靶點分子模擬對接選擇“活性化合物-重疊靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)排名靠前的活性化合物quercetin、beta-sitosterol和sitosterol與重疊靶點基因進(jìn)行分子模擬對接，考察化合物與靶點結(jié)合能力及穩(wěn)定性.一般來說，結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定.結(jié)合能 < 0 kcal/mol，分子與靶點具有結(jié)合能力.結(jié)合能<-7 kcal/mol表示分子與靶點具有較強(qiáng)的結(jié)合能力和一定的穩(wěn)定性.Ki(抑制率常數(shù))< 10 μmol/L，分子與靶點具有較好的抑制活性.將活性化合物quercetin、β-sitosterol、sitosterol分別與MAPK1 AKT1 EGFR MET進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)quercetin、beta-sitosterol、sitosterol分別與MAPK1 AKT1 EGFR MET具有較負(fù)的結(jié)合能和較低的抑制率常數(shù)(表1).用PyMOL對化合物-蛋白的結(jié)合情況進(jìn)行可視化分析(圖6).

圖6 活性化合物與關(guān)鍵靶點分子對接3D和2D可視化

表1 活性化合物與靶點分子對接結(jié)果

3 討論

運用中藥進(jìn)行疾病治療是現(xiàn)代醫(yī)療的有力治療手段之一.然而，中藥的有效成分比較復(fù)雜，且通常作用于多個靶點，導(dǎo)致很多中藥制劑的作用機(jī)制不明確.本研究旨在通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子模擬對接工具來探討田基黃注射液抗病毒肝炎的作用機(jī)制.我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是田基黃的主要活性化合物.槲皮素是一種黃酮化合物，具有抗氧化、抗凋亡以及抗炎等藥理作用，對肝纖維化和肝硬化具有緩解作用[7].乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是一種由154個氨基酸組成的分子量為16.5 kD的病毒蛋白[8]，而槲皮素能夠有效改變HBx誘導(dǎo)的幾個關(guān)鍵癌基因表達(dá)，具有抗病毒肝炎的藥理活性[9].β-谷甾醇是存在于植物的天然甾醇[10]，具有改善糖尿病、抗癌、緩解焦慮和鎮(zhèn)靜等藥理作用[11-13]，其在較高劑量時可以有效減少肝臟膽固醇的形成[14]，具有保肝護(hù)肝的作用.山奈酚是主要存在于茶葉、花椰菜中的一種天然黃酮醇，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理活性[15-16].Kumar等人發(fā)現(xiàn)山奈酚可以通過抑制活性氧的生成，減少對細(xì)胞DNA的損傷[17]，從而發(fā)揮保肝護(hù)肝的功效.

通過對化合物靶點預(yù)測和疾病靶點分析，我們發(fā)現(xiàn)MET、EGFR、AKT1和MAPK1可能是田基黃注射液抗病毒性肝炎的關(guān)鍵作用靶點.其中，EGFR是一種膜受體，屬于受體酪氨酸激酶家族.Masanori等人發(fā)現(xiàn)，EGFR的表達(dá)與HBV的復(fù)制有關(guān)，過表達(dá)的EGFR能夠促進(jìn)HBV的轉(zhuǎn)錄[18].BH-AS1是一種長鏈非編碼RNA，通過激活MAPK通路來提高乙肝表面抗原的水平，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的形成[19].此外，HCV通過PI3K-AKT途徑促進(jìn)了AKT1的磷酸化，從而促進(jìn)了HCV的復(fù)制與翻譯.以上研究表明，田基黃注射液治療抗病毒性肝炎可能與作用于這些關(guān)鍵靶基因有關(guān).

通過構(gòu)建“活性化合物-重疊靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)上述關(guān)鍵靶基因與Rap1信號通路和Ras信號通路有關(guān).HBV可激活PI3K/AKT通路，抑制糖原合成酶激酶3-β(glycogen synthase kinase3-β, GSK3β)表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，最終促使肝癌的形成[20-21].Zhang等人發(fā)現(xiàn)HCV可通過激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，而Ras/Raf/MEK/ERK又可促進(jìn)溴結(jié)構(gòu)域包含蛋白7(bromodomain containing 7, BRD7)表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[22].Rap1是小GTP酶Ras亞家族成員之一，G蛋白偶聯(lián)受體和死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)受體等都會激活Rap1[23].而且，Rap1突變體可以調(diào)控ERK通路，如在再生障礙性T細(xì)胞中，Rap1抑制Ras-ERK介導(dǎo)的IL-2表達(dá)；而在正常T細(xì)胞中過表達(dá)Rap Gap則會增加ERK活性[24-25].最后，我們采用DS20程序，將預(yù)測的活性成分與關(guān)鍵靶點的相應(yīng)蛋白進(jìn)行分子模擬對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物能夠與蛋白有數(shù)值較負(fù)的結(jié)合能和較低的抑制率常數(shù)；通過PyMOL程序，將化合物-蛋白進(jìn)行可視化分析，發(fā)現(xiàn)化合物能較好地結(jié)合在蛋白的口袋空腔中，并能與氨基酸殘基形成氫鍵作用和疏水作用(圖6)，進(jìn)一步驗證了有效成分及靶點預(yù)測的可能性.

本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析和分子對接工具，對田基黃注射液抗病毒性肝炎的活性成分及作用機(jī)制進(jìn)行了探索，為未來進(jìn)一步深入研究田基黃的藥理作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)和方向，也為中藥有效成分分析及作用機(jī)制探討提供了研究思路.