李婧雯，戢凱倫，陳苗苗，張修華，王升富

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

miRNA-141作為miRNA-200家族中的一員，是一種具有22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA信號(hào)分子，可作用于不同靶點(diǎn)調(diào)控相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而參與細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡、新陳代謝等多種生命活動(dòng)[1]. 研究表明，miRNAs-141的異常表達(dá)與多種癌癥直接相關(guān)[2]，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等，可作為疾病標(biāo)志物在癌癥的早期診斷、預(yù)后及治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力. 然而，由于miRNA-141的序列短、易降解，在生物體中的豐度低以及各種miRNA之間的高度相似性等特點(diǎn)[3]，使得高靈敏和特異性地分析檢測(cè)miRNA-141成為了一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù). 目前，電化學(xué)[4]、熒光[5]、光電化學(xué)[6]和電化學(xué)發(fā)光(ECL)[7]等多種分析方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-141的檢測(cè). 其中，ECL作為光譜法及電化學(xué)法相結(jié)合的一種技術(shù)[8]，憑借其良好的可控性、超高的靈敏度以及較低的背景信號(hào)等優(yōu)點(diǎn)在生物分析中受到了科研工作者的廣泛關(guān)注.

硫量子點(diǎn)(SQDs)作為一類(lèi)新興發(fā)光硫納米材料，具有優(yōu)異的水分散性、低毒性、易于修飾及良好的生物活性等突出優(yōu)勢(shì)[9-10]. 然而，由于合成時(shí)間長(zhǎng)、發(fā)光效率低且長(zhǎng)期穩(wěn)定性差的問(wèn)題，限制了其在ECL方面的應(yīng)用. 由無(wú)機(jī)金屬節(jié)點(diǎn)與有機(jī)配體通過(guò)自組裝相互連接而形成的金屬有機(jī)框架(MOFs)多孔材料[11]，不僅具有比表面積大，孔隙率高，晶格穩(wěn)定，易于設(shè)計(jì)和合成等優(yōu)點(diǎn)，且其內(nèi)腔可以裝載不同類(lèi)型的功能納米材料而表現(xiàn)出更為優(yōu)異的性能，而被陸續(xù)開(kāi)發(fā)并被廣泛應(yīng)用在光學(xué)、傳感、氣體吸附、催化等眾多領(lǐng)域[12]. 基于此，將MOFs作為載體對(duì)SQDs進(jìn)行封裝，可以提升SQDs發(fā)光效率及長(zhǎng)期穩(wěn)定性，為拓寬SQDs在ECL中的分析應(yīng)用提供思路.

信號(hào)放大作為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物痕量檢測(cè)的關(guān)鍵策略之一，如滾環(huán)擴(kuò)增[13]、鏈置換擴(kuò)增[14]、雜交鏈反應(yīng)[15]等已被廣泛用于生物傳感器. 雖然這些信號(hào)放大策略可以顯著提升低濃度目標(biāo)物檢測(cè)的靈敏度但仍然存在一些缺陷，包括重現(xiàn)性較差、易受環(huán)境影響、操作復(fù)雜等. 而催化發(fā)卡自組裝(CHA)[16]是一種基于無(wú)酶等溫DNA反應(yīng)而進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的一種策略，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、放大效果好等優(yōu)勢(shì)，在核酸傳感器的設(shè)計(jì)上發(fā)揮了重要的作用.

本研究結(jié)合CHA信號(hào)放大策略，采用ZIF-8作為基質(zhì)對(duì)SQDs進(jìn)行封裝，通過(guò)鏈霉親和素(SA)和生物素(Biotin)之間的特異性識(shí)別能力，將二茂鐵(Fc)標(biāo)記的發(fā)卡DNA H1修飾到電極上，構(gòu)建了基于ZIF-8/SQDs納米復(fù)合材料的ECL生物傳感器用于miRNA-141的分析檢測(cè)(圖1). Fc與SQDs之間的能量轉(zhuǎn)移可以猝滅傳感器ECL信號(hào)，當(dāng)目標(biāo)物miRNA-141存在時(shí)，發(fā)卡DNA H1打開(kāi)，F(xiàn)c遠(yuǎn)離電極表面，使ECL信號(hào)恢復(fù). 當(dāng)修飾有Au NRs的發(fā)卡DNA H2與DNA H1堿基互補(bǔ)配對(duì)后，釋放出miRNA-141進(jìn)入循環(huán)，捕獲更多的DNA H2-Au NRs，Au NRs不僅具有良好的導(dǎo)電性，還可作為SQDs的ECL共反應(yīng)促進(jìn)劑，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大. 該傳感器對(duì)miRNA-141具有良好的響應(yīng)行為、出色的抗干擾性能以及長(zhǎng)期穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了miRNA-141高靈敏檢測(cè)，拓寬了SQDs基的材料在ECL中的生物分析應(yīng)用.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)，六水合硝酸鋅(Zn(NO)2·6H2O)，二甲基咪唑(2-Methylimidazole)，殼聚糖(CS)，氫氧化鈉(NaOH)，升華硫粉(S)，磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)，磷酸氫二鉀(K2HPO4·12H2O)，硼氫化鈉(NaBH4)，氯金酸(HAuCl4·3H2O)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，四氯鉑酸鉀(II)(K2PtCl4)，硝酸銀(AgNO3)，L-抗壞血酸(AA)，聚乙二醇(PEG, Mn=400 Da)和6-巰基-1-己醇(MCH)購(gòu)于上海阿拉丁科技股份有限公司. 本研究所涉及到的試劑均為分析純，且未進(jìn)一步純化. 使用過(guò)程中的超純水(18.25 MΩ·cm)由Ukpro水凈化系統(tǒng)產(chǎn)生. 所用的DNA脫氧核糖核苷酸鏈與RNA核糖核苷酸鏈均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，具體序列如下：

MicroRNA-141∶5′-UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G-3′

MicroRNA-21∶5′-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3′

MicroRNA -155∶5′-UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU-3′

三堿基錯(cuò)配目標(biāo)物(3MT)：5′-UAA CAC CGU CCG GCA AAG AUG G-3′

發(fā)卡DNA H1∶5′-Fc-ACT GTC TTT TCC ATC TTT ACC AGA CAG TGT TAT TTT-bition-3′

發(fā)卡DNA H2∶5′-SH-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG GAA AAG ACA GT-3′

上述DNA均離心后溶解在Tris-HCl(pH=7.4)的緩沖溶液中，在4 ℃條件下冷藏保存.

電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀：MIP-E型，西安瑞邁分析儀器有限公司；電化學(xué)工作站：CHI 660E，上海辰華分析儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-2700，日本Shimadzu公司；熒光光譜儀：RF-5301PC，日本Shimadzu公司；透射電子顯微鏡：TecnaiTMG2F30，日本Shimadzu公司；掃描電子顯微鏡：S-4800，日本Hitachi公司；超聲波清洗儀：Branson 2000，美國(guó)Branson公司.

1.2 SQDs的合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法合成SQDs[17]：三頸燒瓶中加入1.4 g升華硫粉與4.0 g NaOH，再將燒瓶密封抽出瓶中的空氣并通入氧氣，注入3.0 mL PEG(Mn=400 Da)和50 mL超純水；將混合物在70 ℃下攪拌反應(yīng)，溶液由深黃色逐漸變?yōu)榈S色，反應(yīng)10 h后將得到的SQDs進(jìn)行透析，冷凍干燥后冷藏避光保存?zhèn)溆?

1.3 ZIF-8/SQDs的合成取一定量SQDs粉末加入20 mL的Zn(NO)2·6H2O(0.897 0 mmol)水溶液中，超聲30 min混合均勻，再加入20 mL的2-甲基咪唑(7.904 mmol)水溶液，常溫?cái)嚢?4 h后離心，分別用水和乙醇洗滌多次，獲得的白色沉淀即為ZIF-8與SQDs的復(fù)合物，產(chǎn)物在60 ℃下真空干燥后密封保存[18].

1.4 Au NRs的合成將CTAB(7.5 mL, 0.1 mol/L)與HAuCl4(100 μL, 24 mmol/L)混合均勻后用超純水稀釋至9.4 mL，磁力攪拌均勻，加入新制的NaBH4(0.6 mL, 0.0 125 mol/L)，溶液的顏色立即由鮮黃色變成棕色；取120 μL溶液加入到CTAB(100 mL, 0.1 mol/L)、HAuCl4(2.04 mL, 2 4 mmol/L)、AgNO3(1.05 mL, 10 mmol/L)和AA(480 μL, 0.1 mol/L)的混合溶液中，攪拌3 min，37 ℃條件下靜置反應(yīng)12 h. 取上清液分離純化后，將得到的Au NRs分散于去離子水中4 ℃下保存[19].

1.5 ECL生物傳感器的制備玻碳電極(GCE)用氧化鋁粉末打磨、拋光，再依次用超純水、乙醇、超純水超聲處理. 先將2%的殼聚糖溶液與ZIF-8/SQDs混合均勻后取10 μL修飾于干燥后的電極表面，接著取10 μL鏈霉親和素(1 mg/mL)固定到電極表面，再將10 μL退火處理后的發(fā)卡DNA H1滴涂于電極表面，室溫下培養(yǎng)1 h后用緩沖溶液沖洗，用10 μL 1 mmol/L的MCH對(duì)電極培養(yǎng)45 min進(jìn)行封閉處理，再用緩沖溶液進(jìn)行適當(dāng)沖洗備用.

1.6 miRNA-141的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)電極置于含有不同濃度目標(biāo)物miRNA-141的溶液中培養(yǎng)1 h，再將其浸泡在預(yù)先混合攪拌24 h的DNA H2-Au NRs溶液中培養(yǎng)2 h后進(jìn)行ECL測(cè)試.電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)采用以修飾電極為工作電極，銀/氯化銀電極為參比電極，鉑絲為輔助電極的三電極體系，光電倍增管高壓設(shè)置為800 V，電位掃描范圍：0 ～ -1.9 V，掃描速率：100 mV/s. 電解液含有為0.1 mol/L K2S2O8的0.1 mol/L PBS(pH=7.4).

2 結(jié)果與討論

2.1 Au NRs的形貌表征采用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)合成的Au NRs的外觀形貌及尺寸大小進(jìn)行表征. 由圖2(A)和(B)可清晰地觀察到制備的Au NRs為立體棒狀結(jié)構(gòu)，尺寸均一、分散性較好. 通過(guò)粒徑統(tǒng)計(jì)可知金棒的長(zhǎng)度為(45.4±5)nm，直徑為(7.5±1) nm(圖2(C, D))，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[20].

2.2 ZIF-8/SQDs的形貌結(jié)構(gòu)表征ZIF-8/SQDs的SEM圖譜可觀察到其為多邊形狀(圖3(A)). 進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行TEM及高分辨TEM(HRTEM)表征，由圖3(B)可知合成的ZIF-8/SQDs邊界清晰，呈現(xiàn)出清晰的十二面體方鈉石結(jié)構(gòu)，尺寸較均一，平均粒徑約為200 nm. 此外，在HRTEM圖(圖3(C))中捕獲到大量的SQDs粒子，表明SQDs被成功包埋在ZIF-8腔體內(nèi)部且未對(duì)其形貌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.

圖3 SQDs/ZIF-8的掃描電鏡圖(A)；透射電鏡圖(B)及高分辨透射電鏡圖(C)；ZIF-8/SQDs和ZIF-8的X線衍射圖譜(D)

采用X線衍射(XRD)表征技術(shù)對(duì)合成的ZIF-8/SQDs進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征. 結(jié)果如圖3(D)所示，與ZIF-8的標(biāo)準(zhǔn)卡片峰進(jìn)行對(duì)比，可發(fā)現(xiàn)ZIF-8/SQDs的XRD圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜中特征峰基本重疊，表明了ZIF-8/SQDs的與ZIF-8的晶體結(jié)構(gòu)基本一致，結(jié)晶度較高.

2.3 ZIF-8/SQDs的光譜行為表征采用紫外吸收光譜和熒光光譜對(duì)ZIF-8/SQDs的光譜性質(zhì)進(jìn)行了表征研究，由圖可以看出純SQDs分別在220 nm與270 nm處存在紫外吸收(圖4(A))，ZIF-8僅在210 nm處存在紫外吸收(圖4(B))，ZIF-8/SQDs在210 nm及270 nm附近的兩個(gè)吸收分別應(yīng)該分別來(lái)自于ZIF-8、SQDs的特征吸收峰(圖4(C)).

圖4(D)為SQDs、ZIF-8及ZIF-8/SQDs的熒光光譜圖. 由圖可知，SQDs在460 nm處存在明顯的發(fā)射峰. 純ZIF-8幾乎沒(méi)有熒光發(fā)射，僅在440 nm、527 nm和570 nm處存在微弱的鋸齒狀小尖峰. 當(dāng)SQDs與ZIF-8復(fù)合后，不僅能觀察到460 nm處來(lái)自SQDs的發(fā)射峰，也同樣在440 nm、527 nm和570 nm處存在來(lái)源于ZIF-8的齒狀峰. 光譜表征結(jié)果表明所合成的材料為ZIF-8/SQDs復(fù)合物.

圖4 (A)SQDs；(B)ZIF-8；(C)ZIF-8/SQDs的紫外吸收光譜圖；(D)SQDs，ZIF-8和ZIF-8/SQDs的熒光光譜圖

2.4 傳感器對(duì)miRNA-141的識(shí)別與條件優(yōu)化如圖5(A)所示，當(dāng)無(wú)目標(biāo)物miRNA-141時(shí)，電極表面的二茂鐵(Fc)可通過(guò)能量轉(zhuǎn)移的形式猝滅SQDs的ECL信號(hào). 而存在目標(biāo)物miRNA-141時(shí)，發(fā)卡DNA-H1得以打開(kāi)，此時(shí)Fc遠(yuǎn)離電極表面，其猝滅作用降低；進(jìn)一步DNA H2-Au NRs與DNA-H1通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)而被DNA-H1捕獲，使得Au NRs靠近電極表面可作為SQDs的共反應(yīng)促進(jìn)劑，二者的協(xié)同作用大大增強(qiáng)了SQDs的ECL信號(hào).

對(duì)Au NRs-DNA H2的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化. 由圖5(B)可知，隨著時(shí)間的增加，通過(guò)催化發(fā)卡自組裝到電極表面的Au NRs-DNA H2的量也更多，Au NRs不僅具有良好的導(dǎo)電性，還能作為共反應(yīng)促進(jìn)劑使共反應(yīng)劑過(guò)硫酸根更易得到電子，對(duì)應(yīng)的ECL信號(hào)也逐漸增大. 當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為2 h時(shí)，ECL信號(hào)達(dá)到了平臺(tái)，因此選擇2 h作為Au NRs-DNA H2的培養(yǎng)時(shí)間.

圖5 (A)ECL傳感器的可行性分析；(B)Au NRs-DNA H2培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

2.5 miRNA-141的ECL測(cè)定考察了ZIF-8/SQDs ECL生物傳感器對(duì)miRNA-141分析檢測(cè)效果. 如圖6(A)所示，隨著miRNA-141濃度的增加，發(fā)夾DNA H1被打開(kāi)的越多，隨之能結(jié)合至電極表面的Au NRs-DNA H2也更多，檢測(cè)到的ECL信號(hào)因此增強(qiáng). 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，ECL的響應(yīng)值與miRNA-141濃度的對(duì)數(shù)在10 fmol/L至1 nmol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(圖6(B))，其線性回歸方程為I=3 215.3 + 1 048.9 lgc(pmol/L)(R2=0.997 8)，檢測(cè)限(LOD)低至0.86 fmol/L(S/N=3).

圖6 (A)不同濃度miRNA-141的ECL信號(hào)；(B)miRNA-141的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度100倍于miRNA-141的干擾物，如miRNA-155、miRNA-21和3堿基錯(cuò)配的miRNA-141′(3MT)，對(duì)構(gòu)建的ECL生物傳感器選擇性和抗干擾的能力進(jìn)行了研究. 由圖7(A)可知，上述3種干擾物單獨(dú)存在時(shí)ECL響應(yīng)都較低，而miRNA-141與各種干擾物的混合液對(duì)應(yīng)的ECL信號(hào)與其單獨(dú)存在時(shí)的ECL信號(hào)相當(dāng)，表明該傳感器對(duì)miRNA-141的檢測(cè)具有良好的選擇性和優(yōu)異的抗干擾能力.

分別使用9支不同批次的電極對(duì)同一濃度的目標(biāo)物進(jìn)行平行檢測(cè)，由圖7(B)可知，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%，表明該傳感器具有較好的重現(xiàn)性. 此外，如圖7(C)所示，在相同的參數(shù)條件下連續(xù)13次循環(huán)掃描，ECL的信號(hào)幾乎沒(méi)有波動(dòng)，RSD為1.9%，表明其也具有良好的穩(wěn)定性.

圖7 (A)傳感器的選擇性：1∶3MT，2：miRNA-155，3：miRNA-21，4：miRNA-141+3MT，5：miRNA-141+miRNA-155，6：miRNA-141+miRNA-21；(B)傳感器的重現(xiàn)性；(C)傳感器的穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本研究采用自上而下的方法成功合成了具有藍(lán)色熒光的SQDs，并利用比表面積大、孔隙率高的金屬有機(jī)框架ZIF-8對(duì)其進(jìn)行封裝，構(gòu)建了以ZIF-8/SQDs作為發(fā)光體，結(jié)合催化發(fā)夾自組裝信號(hào)放大策略的ECL生物傳感器用于疾病標(biāo)志物miRNA-141的分析檢測(cè). DNA標(biāo)記的Fc與SQDs之間的能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致ECL信號(hào)猝滅，當(dāng)修飾有Au NRs的發(fā)卡DNA H2與DNA H1堿基互補(bǔ)配對(duì)后，釋放出miRNA-141進(jìn)入循環(huán)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大. Au NRs具有良好的導(dǎo)電性，并可作為SQDs的ECL共反應(yīng)促進(jìn)劑，進(jìn)而達(dá)到超靈敏定量miRNA-141的目的. 該傳感器具有良好的選擇性和重現(xiàn)性、以及較強(qiáng)的抗干擾能力. 本研究為探索基于SQDs高效可靠的ECL生物傳感平臺(tái)提供了新的思路，對(duì)疾病標(biāo)志物miRNA-141的分析具有一定的潛力.