王 攀， 李 昭， 趙蓋晴， 武玥冉， 豆麗茹， 于 榮*

(1)首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 北京 100048；2)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院， 北京 100193)

氣孔主要位于植物葉表，它是植物體與外界進(jìn)行水分和氣體交換的窗口。氣孔可以靈敏地感知激素、光、干旱和低溫等外源信號(hào)，經(jīng)過(guò)一系列信息傳遞，使氣孔有序開(kāi)閉，從而調(diào)節(jié)植物光合、蒸騰以及植物免疫等多種生理活動(dòng)[1, 2]。殼梭孢素(fusicoccin，F(xiàn)C)是扁桃殼梭孢菌(FusicoccumamygdaleDel.) 產(chǎn)生的一種次生代謝物，可引起絕大多數(shù)高等植物氣孔開(kāi)放和種子萌發(fā)[3]，以及誘導(dǎo)楓葉槭培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生一系列逆境響應(yīng)，例如DNA片段化、脂類過(guò)氧化反應(yīng)和細(xì)胞凋亡蛋白酶的激活等[4]。在動(dòng)物細(xì)胞中，殼梭孢素甚至可以誘導(dǎo)諸如乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C能夠高親和地結(jié)合質(zhì)膜上H+-ATPase/14-3-3蛋白復(fù)合體，穩(wěn)定二者之間的相互作用，并強(qiáng)力激活H+-ATPase酶的活性，使大量H+外流，刺激K+內(nèi)流，促進(jìn)氣孔開(kāi)放[6]。除了H+-ATPase，F(xiàn)C的其它作用靶物也不斷被發(fā)現(xiàn)。例如擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞液泡膜上的一個(gè)NO3-/H+液泡載體蛋白 (vacuolar transporter)—AtCLCa (ArabidopsisthalianaChloride Channel a)，也可以響應(yīng)FC，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的pH值，修正胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài) (cytosolic homeostasis) 及氣孔運(yùn)動(dòng)[7]。楓葉槭培養(yǎng)細(xì)胞中，F(xiàn)C可以誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2和一氧化氮NO，以及它們的反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧硝酸鹽 (ONOO-) ，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)熱激蛋白90 (heat shock protein 90，Hsp90)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白 (binding protein，Bip)和胞質(zhì)14-3-3蛋白的水平變化。此外，在3%蔗糖浸泡下，不論是異位分化形成的聚集成簇保衛(wèi)細(xì)胞(ectopically-differentiated and clustered guard cells)，還是分散氣孔保衛(wèi)細(xì)胞(spaced stomata)，F(xiàn)C誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)微管骨架仍均為輻射狀排布，氣孔開(kāi)放，但氣孔開(kāi)度總體小于無(wú)蔗糖浸泡的對(duì)照[8]。FC作為具有五十多年研究歷史的植物毒素 (phytotoxin) ，其在植物上的分子作用機(jī)制研究，不僅能夠加深人們對(duì)它在植物中的功能的理解，而且也有助于拓展FC針對(duì)14-3-3靶蛋白在動(dòng)物及藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用前景[6]。

另一方面，在氣孔運(yùn)動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架 (microfilaments，MF或actin filaments, F-actins)是一個(gè)活躍的信息傳遞者。在脫落酸ABA (abscisic acid) 、光、二氧化碳、干旱、病原體入侵、滲透壓等多種因素引起的氣孔運(yùn)動(dòng)中，均發(fā)揮重要作用[9-12]。保衛(wèi)細(xì)胞已經(jīng)成為研究單一細(xì)胞內(nèi)早期信號(hào)傳遞事件 (early signaling events)與微絲動(dòng)態(tài)之間相互作用特征的強(qiáng)有力實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较到y(tǒng)[13]。Shimono等[10]利用高分辨率的定量圖像分析技術(shù)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，不論在日常的光/暗循環(huán)，還是致病菌 (flg22和clitin)侵染條件下，反映保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)微絲精細(xì)定位的度量參數(shù) (例如成束程度-bundling、密度-density、方向-orientation)均會(huì)隨著氣孔的開(kāi)關(guān)發(fā)生相應(yīng)變化，微絲骨架這種在時(shí)間、空間上高度有序的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于維持氣孔正常開(kāi)關(guān)和植物免疫激活均有重要意義。其中，微絲結(jié)合蛋白家族(actin-binding proteins, ABPs) 是微絲動(dòng)態(tài)組裝最直接的調(diào)控者和實(shí)施者，在氣孔運(yùn)動(dòng)過(guò)程中不斷發(fā)現(xiàn)微絲結(jié)合蛋白的參與[14]。例如，擬南芥微絲結(jié)合蛋白SCAB1 (stomatal closure-related actin binding protein1) 功能缺失會(huì)阻礙保衛(wèi)細(xì)胞微絲動(dòng)態(tài)重排，導(dǎo)致ABA、H2O2、CaCl2誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉延遲，對(duì)干旱脅迫超敏感[15]。保衛(wèi)細(xì)胞中的另一種微絲結(jié)合蛋白ARP2/3 (actin-related proteins, ARPs)復(fù)合體突變后，破壞了保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)ABA、CaCl2及光/暗信號(hào)的響應(yīng)，抑制ABA引起的保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架纖維的快速崩解。ARP2/3在ABA經(jīng)H2O2信號(hào)使氣孔關(guān)閉的信號(hào)通路中是必需的[16]。此外，在ABA和干旱引起的氣孔運(yùn)動(dòng)中，蛋白激酶CKL2 (casein kinase1-like protein2)直接磷酸化微絲解聚因子ADF4 (actin depolymerizing factor 4)，抑制其解聚微絲的活性，調(diào)節(jié)微絲穩(wěn)定性以及氣孔關(guān)閉運(yùn)動(dòng)[17]。

擬南芥加帽蛋白 (Arabidopsiscapping protein，AtCP) 是一種異二聚體蛋白質(zhì)，由α亞基 (CPA) 以及β亞基 (CPB) 構(gòu)成[18]，兩個(gè)亞基相互協(xié)同，完成微絲正極的加帽封端。CPA的C端區(qū)域先與微絲末端酸性氨基酸殘基通過(guò)靜電反應(yīng)而吸引，隨后β亞基C端疏水面結(jié)合在微絲末端疏水“裂縫”處 (hydrophobic cleft)。加帽蛋白與微絲末端結(jié)合后，抑制游離單體肌動(dòng)蛋白(G-actin)向微絲纖維末端的進(jìn)一步添加聚合或者微絲解聚，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)[19]。在擬南芥中，CPA和CPB存在于所有組織中，但表達(dá)水平明顯不同。GUS染色發(fā)現(xiàn)，擬南芥幼苗AtCPA主要表達(dá)在下胚軸和子葉，AtCPB則出現(xiàn)在整個(gè)幼苗[20]。利用擬南芥CP的過(guò)表達(dá)植株和敲低植株研究發(fā)現(xiàn)，提高或降低CP的表達(dá)水平，可以改變下胚軸表皮細(xì)胞中微絲的密度和成束程度，以及末端具不同伸長(zhǎng)速率的微絲比例 (proportion of filament ends with different elongation rate)，調(diào)節(jié)微絲長(zhǎng)度和組裝周期 (lifetime)，與黑暗中下胚軸表皮細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)正相關(guān)。CP還是一種膜連接蛋白質(zhì)，也是目前已知唯一可以與磷脂信號(hào)分子—磷脂酸 (phosphatidic acid，PA) 結(jié)合的微絲結(jié)合蛋白質(zhì)。PA與CP結(jié)合會(huì)抑制CP與F肌動(dòng)蛋白(F-actin)末端結(jié)合的封端活性，從而刺激微絲持續(xù)組裝生長(zhǎng)，參與花粉管頂端生長(zhǎng)[21]。在植物免疫應(yīng)答過(guò)程中，活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 可以通過(guò)CP將信號(hào)傳遞至微絲骨架，參與植物先天免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[22]。不論是擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育還是植物先天免疫中，CP都扮演著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器 (transmitter) 的角色。那么在氣孔運(yùn)動(dòng)龐大而復(fù)雜的信號(hào)通訊網(wǎng)絡(luò)中，CP是否也同樣發(fā)揮作用呢？關(guān)于AtCP的可見(jiàn)報(bào)道，主要集中于下胚軸及花粉管伸長(zhǎng)、微生物入侵植物免疫反應(yīng)以及植物熱激脅迫等方面[18,20,23]，其在氣孔運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路中的作用尚不明晰。結(jié)合Wang等[20]發(fā)現(xiàn)，擬南芥熱激 (45℃,40～45 min)處理下，與CPA相比，只有AtCPB表現(xiàn)出明顯的負(fù)調(diào)節(jié)植物熱激耐受性的作用。cpb突變體細(xì)胞內(nèi)微絲的完整性和穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于野生型和cpa，顯示AtCPB亞基基因表達(dá)下調(diào)對(duì)于提高植物耐熱性的獨(dú)特意義，以及該亞基在植物應(yīng)答逆境脅迫中的重要作用。因此，本文以CP-β亞基為切入點(diǎn)，以CP-β亞基突變體cpb-3為主要材料，運(yùn)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)、激光共聚焦掃描顯微鏡術(shù)、非損傷微測(cè)技術(shù)等從氣孔開(kāi)度、離子流動(dòng)以及微絲排布變化等不同的角度，初步探討CPB在氣孔運(yùn)動(dòng)中的作用機(jī)制，以及其上下游可能的信號(hào)因子。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥野生型植株 (Col) 、CP-β亞基T-DNA插入 (SALK_101017) 功能缺失突變體cpb-3、GFP-ABD2轉(zhuǎn)基因植株以及帶有GFP-ABD2標(biāo)記的cpb-3突變體。以上植物材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)毛同林教授和清華大學(xué)黃善金教授贈(zèng)予，突變體均為經(jīng)三引物法鑒定后的純合突變體。將成熟飽滿種子加入適量蒸餾水置于4 ℃環(huán)境下春化3～5 d，播種于1/2 MS培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中 (16/8，溫度22 ℃/18 ℃，光照強(qiáng)度120 μmol/ m2s，相對(duì)濕度75%) ，待長(zhǎng)出4片葉片時(shí)將幼苗移植到滅菌的含有蛭石的培養(yǎng)土中，無(wú)任何脅迫條件下繼續(xù)生長(zhǎng)4周左右供實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 試劑

所用表皮條緩沖液：10 mmol/L MES，50 mmol/L KCl，100 μmol/L CaCl2，pH 6.1；微絲特異性藥物Jas (Jasplakinolide) 以及LatB (LatrunculinB) 由DMSO溶解，使用時(shí)表皮條緩沖液分別稀釋至20 nmol/L和10 nmol/L；殼梭胞素FC (fusicoccin) 使用時(shí)表皮條緩沖液稀釋至10 μmol/L。

1.3 失水率以及氣孔密度統(tǒng)計(jì)

突變體失水率分析：分別從生長(zhǎng)狀態(tài)良好4周的cpb-3突變體與野生型的擬南芥植株摘取發(fā)育階段、生長(zhǎng)狀態(tài)相似的蓮座葉 (rosette leaves) 9片，放置于同一通風(fēng)干燥環(huán)境中，每30 min稱其質(zhì)量，根據(jù)其占初始鮮重的百分比計(jì)算葉片失水率。

氣孔密度的分析：分別從10株生長(zhǎng)狀態(tài)良好的cpb-3突變體與野生型的擬南芥植株取完全展開(kāi)的10片蓮座葉，在葉的不同位置 (基部、頂部、中部) 測(cè)量面積為0.12 mm2遠(yuǎn)軸下表皮氣孔個(gè)數(shù)，氣孔的密度 (氣孔數(shù)量/0.12 mm2) 為10組圖片數(shù)據(jù)的平均值。

1.4 氣孔開(kāi)度統(tǒng)計(jì)

取生長(zhǎng)4周的cpb-3 突變體以及野生型植株第二對(duì)葉片，置于MES緩沖液中。先將葉片經(jīng)黑暗處理90 min，使氣孔基本關(guān)閉后再進(jìn)行如下處理: (1) 10 μmol/L FC；(2) 10 μmol/L FC+10 nmol/L LatB；(3) 10 μmol/L FC+20 nmol/L Jas處理30～90 min，并在多功能顯微鏡 (Leica DMRE2) 下記錄氣孔開(kāi)度。測(cè)量時(shí)隨機(jī)選取8個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)氣孔。每個(gè)處理至少重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)平均值，以野生型擬南芥植株為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)氣孔開(kāi)度，并經(jīng)SPSS軟件分析差異顯著性。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

分別取生長(zhǎng)4周雜交得到的cpb-3突變體 (GFP-ABD2為背景) 以及普通GFP-ABD2 (對(duì)照) 為實(shí)驗(yàn)材料。取第二對(duì)葉片放置于黑暗環(huán)境處理90 min，在10 μmol/L FC處理60 min，用ZEISS7.0激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察處理前后保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架排布的變化(物鏡63×oil，488 nm激發(fā))，采集圖片后用Photoshop CS5.0進(jìn)行圖像編輯處理。每種處理采集保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)目n≥150，分別統(tǒng)計(jì)含有3種不同微絲組織排布類型 (TypeⅠ/Ⅱ/Ⅲ) 的保衛(wèi)細(xì)胞所占比例。

1.6 非損傷技術(shù)測(cè)定保衛(wèi)細(xì)胞離子流動(dòng)情況

取生長(zhǎng)4周的cpb-3突變體以及野生型植株第二對(duì)葉片，置于表皮條緩沖液中。先將葉片經(jīng)黑暗處理90 min，使氣孔基本關(guān)閉，在10 μmol/L FC中分別處理一定時(shí)間進(jìn)行非損傷Ca2+、K+、H+離子微測(cè)[24]，具體測(cè)量操作在北京旭月公司協(xié)助下完成。

1.7 構(gòu)建ProCPB native:CPB/cpb3功能互補(bǔ)回復(fù)系

提取擬南芥總基因組DNA，通過(guò)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物以擬南芥總基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物回收，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-Blunt Simple Cloning Vector連接。用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)，隨后pEASY-Blunt simple連接體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選出抗性菌落。通過(guò)堿裂解法小提質(zhì)粒，對(duì)菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切驗(yàn)證。用Kpn I/Sal I雙酶切的CPB-pEASY-Blunt Simple與植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300，回收目的片斷、連接、轉(zhuǎn)化并篩選抗卡那霉素的陽(yáng)性克隆，得到最終的包含有目的基因植物表達(dá)載體CPB-pCAMBIA1300。對(duì)CPB-pCAMBIA1300載體進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆及酶切驗(yàn)證。

制備感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)凍融熱激法轉(zhuǎn)化，對(duì)轉(zhuǎn)化子的PCR和酶切鑒定，確保得到的是含有目的片段的GV3101轉(zhuǎn)化子。通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化cpb-3擬南芥突變體，轉(zhuǎn)化后收獲種子。用潮霉素抗性板篩選，對(duì)篩選出的苗進(jìn)行DNA提取鑒定，最終獲得cpb回復(fù)系植株，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用t分布理論來(lái)推論差異發(fā)生的概率，從而比較兩個(gè)平均數(shù)的差異是否顯著。

2 結(jié)果

2.1 加帽蛋白β亞基功能缺失后加速植物蒸騰失水

在cpb-3突變體和野生型植株中取相同部位、生長(zhǎng)狀態(tài)相似的葉片放置于相同條件實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。失水率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在3 h的失水過(guò)程中，突變體的失水率始終高于野生型。葉片離體3 h，突變體蒸騰失水高達(dá)63.45%，而野生型僅為48.99%，突變體高出對(duì)照14.46%，差異顯著。導(dǎo)致葉片蒸騰失水較快的因素主要有2個(gè)，一個(gè)是由于氣孔密度過(guò)高，另一個(gè)與氣孔運(yùn)動(dòng)異常有關(guān)[25, 26]。統(tǒng)計(jì)葉片下表皮氣孔密度發(fā)現(xiàn)，在0.12 mm2單位面積上，突變體cpb-3的氣孔數(shù)量可達(dá)18個(gè)，而野生型只有12個(gè)，突變體高出野生型50% (Fig.1B) ，結(jié)果差異顯著。隨后，本文對(duì)蒸騰失水的另一個(gè)因素氣孔開(kāi)關(guān)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了探究。

Fig.1 cpb-3 mutant shows faster transpirational water loss than the wild type (WT) and its stomatal density is also higher than WT (A) Water losses from detached rosette leaves of WT and cpb-3 plants. Data are mean of five independent experiments ±SEM (with nine leaves from two kinds of plants in each experiment). Statistical analysis was performed by paired t test (*P<0.05). (B) Stomatal density in WT and cpb-3 plants. Data are mean of five independent experiments ±SD (with the average stomatal density of ten leaves in each experiment). Statistical analysis was performed by paired t test (*P<0.05)

2.2 加帽蛋白β亞基通過(guò)調(diào)節(jié)微絲骨架動(dòng)態(tài)參與殼梭孢素誘導(dǎo)的氣孔開(kāi)放運(yùn)動(dòng)

本文選取FC這種廣受關(guān)注的真菌次生代謝物為外源信號(hào)，進(jìn)行氣孔開(kāi)度檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在FC處理60 min時(shí)，突變體的氣孔增大為處理前的1.5倍，高出野生型相對(duì)氣孔開(kāi)度約20%，差異顯著 (P<0.05)。隨著FC處理時(shí)間的增加，突變體與野生型相對(duì)氣孔開(kāi)度均有所增加，但突變體cpb-3始終高于野生型(Fig.2A)。反觀功能互補(bǔ)的cpb-3回復(fù)系，cpb突變體氣孔開(kāi)度的生理表型缺陷在所觀察的FC處理時(shí)間內(nèi)均可在回復(fù)系中基本得到恢復(fù)，其氣孔開(kāi)放程度與野生型持平。

Fig.2 Regulation of CPB on FC-induced microfilament reorganization and stomatal opening (A) Effects of FC treatment for indicated times on stomatal opening of wild type, cpb-3 mutants and cpb-3 gain-of-function plants. Date represent mean ±SEM from five independent experiments with 80 stomata each. Statistical analysis was performed by paired t test (*P<0.05). (B) The effect of actin filament-specific drugs on FC- involved stomatal opening. The detached rosette leaves of seedlings from WT and cpb-3 were treated with FC, JAS, and LatB for 30 minutes. Data presented are the mean± SEM of three independent biological replicates; Totally 80 stomata were analyzed per line. Statistical analysis was performed by paired t test (*P<0.05). (C) Representative images of actin networks during stomatal movement. Actin organization was classified into three groups: radial array, random meshwork, and longitudinal array. Scale bar=10 μm. (D) Percentage of these three groups was calculated for indicated genotypes and treatments. The data were collected from three groups of independent experiments, and 100-120 stomata were analyzed in each group

基于微絲加帽蛋白CP對(duì)微絲解聚?聚合動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)，本文又施加了微絲特異性藥物處理。結(jié)果如下(Fig.2B)：微絲穩(wěn)定劑Jasplakinolide (Jas，an actin-stabilizing agent)，能夠特異性與微絲結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)微絲纖維，是常用的微絲特異性藥物[27,28]。Jas和FC共同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)cpb-3突變體對(duì)FC信號(hào)的敏感性。30 min時(shí)，突變體的相對(duì)氣孔開(kāi)度比FC單獨(dú)處理上升了7%，比同一條件下的野生型對(duì)照高了約13%，差異顯著 (P<0.05)。LatrunculinB (Lat B) ，是一種微絲特異性抑制劑(an inhibitor of actin polymerization) ，LatB和FC共同作用，cpb-3相對(duì)氣孔開(kāi)度比FC單獨(dú)處理下降了5.4%，在一定程度上減輕了突變體氣孔在FC條件下的過(guò)度開(kāi)放，與同期的野生型接近，可以部分恢復(fù)突變體對(duì)FC的正常反應(yīng)。顯示在FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放過(guò)程中，加帽蛋白CPB對(duì)微絲動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)節(jié)發(fā)揮著不容忽視的作用。換而言之，微絲穩(wěn)定劑Jas在一定程度上增強(qiáng)CPB突變對(duì)FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放的促進(jìn)作用；微絲解聚劑LatB則正好相反，解聚微絲削弱了突變體對(duì)FC信號(hào)的超敏感。綜上表明，相比于野生型，突變體cpb-3對(duì)改變微絲解聚聚合動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定的微絲特異性藥物更加敏感，微絲骨架動(dòng)態(tài)在FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放過(guò)程中可能在CPB下游發(fā)揮作用。

為了對(duì)氣孔開(kāi)放過(guò)程中保衛(wèi)細(xì)胞中微絲的排布進(jìn)行直接觀察和定量分析，本文依照Li等[14]的研究報(bào)道，將保衛(wèi)細(xì)胞中微絲的排布方式主要分為3種類型。例如Fig.2C所示：Ⅰ型 (輻射狀列陣) ：微絲骨架列陣排列規(guī)則，致密有序，大部分由保衛(wèi)細(xì)胞腹壁向背壁呈輻射狀排布，多出現(xiàn)在開(kāi)放氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中；Ⅱ型 (網(wǎng)狀列陣) ：微絲骨架排布出現(xiàn)一定的扭曲、相互交錯(cuò)成網(wǎng)狀；Ⅲ型 (解聚-縱向列陣) ：多數(shù)微絲發(fā)生解聚，熒光呈彌散狀或小片段隨機(jī)分布于保衛(wèi)細(xì)胞中，甚至有的微絲片段與保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)軸平行，多出現(xiàn)在關(guān)閉氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中。

隨后，本文利用激光共聚焦掃描顯微鏡，以雜交得到的cpb-3突變體 (GFP-ABD2為背景) 以及GFP-ABD2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株 (對(duì)照) 為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放過(guò)程中保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架的組織排布進(jìn)行了直接觀察，以確定CPB對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞微絲列陣的調(diào)節(jié)。結(jié)果正如Table 1及Fig.2 D所示，F(xiàn)C處理60 min，不論是cpb-3突變體還是野生型，含Ⅰ 型輻射狀微絲排布的保衛(wèi)細(xì)胞占比明顯升高，而Ⅲ 型解聚、縱向排列微絲的保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)量下降。與對(duì)照組相比，cpb-3突變體保衛(wèi)細(xì)胞含Ⅰ 型輻射狀排布微絲的比例由處理前的7.2%劇增為65.5%，增幅為58.3%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組39.8%的增量，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，差異顯著。表明突變體cpb-3保衛(wèi)細(xì)胞中微絲的動(dòng)態(tài)重排對(duì)FC信號(hào)更加敏感，該結(jié)果與 (Fig.2A) 中氣孔開(kāi)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Table 1 Different types of microfilament arrangement in guard cells induced by FC

2.3 加帽蛋白β亞基介導(dǎo)微絲動(dòng)態(tài)響應(yīng)殼梭孢素誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放信號(hào)通路中有Ca2+、K+及H+的作用

在氣孔運(yùn)動(dòng)機(jī)制這一龐大而復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架動(dòng)態(tài)不僅是一個(gè)信號(hào)的接收者，也是一個(gè)積極的調(diào)控者。已有研究表明，蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架動(dòng)態(tài)會(huì)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上Ca2+滲透通道[29]，并且FC對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞的K+和H+流動(dòng)有著顯著影響。因此，本文通過(guò)非損傷測(cè)微技術(shù)，重點(diǎn)測(cè)量了FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放過(guò)程中，突變體和野生型擬南芥植株保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+、K+、H+離子流動(dòng)情況。結(jié)果正如Fig.3中A和B所示，F(xiàn)C處理5 min時(shí)，突變體cpb-3與野生型均檢測(cè)到明顯的Ca2+外流 (數(shù)據(jù)為正值)，野生型Ca2+平均外流速度為68.76 pmol·cm-2·s-1，而突變體cpb-3為212.86 pmol cm-2s-1，明顯比野生型更加強(qiáng)烈，Ca2+的波動(dòng)幅度更大，經(jīng)SPSS軟件分析，差異顯著。同樣，依次檢測(cè)FC處理后的K+和H+流動(dòng)情況，結(jié)果如Fig.3中 C-F所示，F(xiàn)C處理后，突變體保衛(wèi)細(xì)胞中的K+內(nèi)流 (數(shù)據(jù)為負(fù)值)量為82.50 pmol·cm-2·s-1, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生型K+的流速16.33 pmol·cm-2·s-1；相應(yīng)的H+外流也比野生型高，突變體氣孔運(yùn)動(dòng)中的幾個(gè)重要的離子跨膜流動(dòng)都出現(xiàn)明顯異常。

Fig.3 Flux of Ca2+, K+, and H+ in guard cells of wild type (WT) and cpb-3 mutants under FC treatment (A) After FC treatment for 5 minutes, the Ca2+ flux potential of guard cells of WT and cpb-3 mutants was analyzed. Each point represents the mean for Ca2+ flux potential and bars represent the standard error. (B) The mean Ca2+ flux of WT and cpb-3 guard cells before and after exposure to FC for 5 minutes. Each point represents the mean for Ca2+ flux potential and bars represent the standard error. Statistical analysis was performed by paired t test (**P<0.01). (C) After FC treatment for 10 minutes, the K+ flux potential of guard cells of WT and cpb-3mutants was analyzed. The data were the average K+ flux of guard cells in three groups of independent experiments. (D) The mean K+ flux of WT and cpb-3 guard cells before and after exposure to FC for 10 minutes. Each point represents the mean for K+ flux potential and bars represent the standard error. (E) After FC treatment for 10 minutes, the H+ flux potential of guard cells of WT and cpb-3 mutants was analyzed. The data were the average H+ flux of guard cells in seven groups of independent experiments. (F) The mean H+ flux of WT and cpb-3 guard cells before and after exposure to FC for 10 minutes. Each point represents the mean for H+ flux potential and bars represent the standard error

3 討論

3.1 加帽蛋白β亞基通過(guò)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架動(dòng)態(tài)重排參與殼梭孢素誘導(dǎo)的氣孔開(kāi)放運(yùn)動(dòng)

微絲骨架 (actin cytoskeleton) 在氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用已得到越來(lái)越多的關(guān)注，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，保衛(wèi)細(xì)胞中微絲除了具有基本的維持細(xì)胞形態(tài)、參與植物細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能之外，還表現(xiàn)出信號(hào)受體的激活與信息傳遞、保衛(wèi)細(xì)胞液泡形態(tài)建成及膜泡運(yùn)輸精確定位、葉綠體避光移動(dòng)、核質(zhì)銜接等重要作用[30-33]。保衛(wèi)細(xì)胞中微絲骨架活躍的動(dòng)態(tài)重排是其行使功能的基礎(chǔ)，該過(guò)程在時(shí)空上均受到細(xì)胞不同層面的嚴(yán)格調(diào)控[30]。其中，眾多微絲結(jié)合蛋白質(zhì)成員的作用不容忽視。在Li等[34]綜述中，將一系列微絲結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)微絲動(dòng)態(tài)的方式人為劃分為三個(gè)水平：(1)微絲骨架纖維起始 (filament initiation) ，例如微絲結(jié)合蛋白ARP2/3 (actin-related protein2/3) 和Profilin；(2)單根微絲解聚或生長(zhǎng)的隨機(jī)動(dòng)力學(xué) (stochastic dynamics) ，例如肌動(dòng)蛋白相互作用蛋白AIP1 (actin-interacting protein1)、切割蛋白ADFs(actin depolymerizing factors)、加帽蛋白CP等；(3)微絲纖維間的組織排列 (filament organization) ，例如成束蛋白 (fimbrin)、絨毛蛋白 (villin)和肌球蛋白 (myosin)。在參與氣孔運(yùn)動(dòng)的微絲結(jié)合蛋白質(zhì)中，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有促起始成核的Arp2/3、切割蛋白ADF4、成束蛋白ADF5、微絲結(jié)合蛋白SCAB1 (stomatal closure related actin binding protein1)等。作為一個(gè)異二聚體微絲結(jié)合蛋白質(zhì)，已有研究發(fā)現(xiàn)，CP其中任一亞基的表達(dá)下調(diào)均能引起另一個(gè)亞基轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的降低。免疫印跡表明，擬南芥cpb-3突變體，即使僅β亞基被突變，其CPA和CPB蛋白質(zhì)水平也均被減弱，化學(xué)計(jì)量學(xué)分析統(tǒng)計(jì)，該突變體中不僅CPB:actin的比率由野生型的1∶196下降為1∶996，而且CPA:actin的比率也隨之下降，由1∶207下降至1∶2187[35]。結(jié)合向云等[20]報(bào)道，在擬南芥熱激響應(yīng)中，CP兩亞基中唯有CPB亞基比較明顯地表現(xiàn)為一個(gè)植物熱脅迫信號(hào)傳遞中的負(fù)調(diào)節(jié)因子 (a negative regulator) 。因此本研究也選擇了cpb-3突變體為主要實(shí)驗(yàn)材料。

離體葉片失水率是檢測(cè)植物葉片蒸騰失水作用的有效指標(biāo)。單位時(shí)間內(nèi)，離體葉片失水率越高代表植物葉片蒸騰失水作用越強(qiáng)，抗旱能力越差[13]。在相同的條件下，cpb-3突變體的失水率高于野生型。也就是說(shuō)，CPB缺失會(huì)影響植物葉片蒸騰失水。氣孔是植物與環(huán)境水分交換的通道，氣孔密度的多少以及其是否能夠進(jìn)行正常的開(kāi)閉運(yùn)動(dòng)，都是影響植物葉片蒸騰失水的重要指標(biāo)。通過(guò)對(duì)野生型以及突變體氣孔密度的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，突變體cpb-3氣孔密度顯著高于野生型，所以較高的氣孔密度是導(dǎo)致突變體葉片蒸騰失水異常的一個(gè)主要原因。本文發(fā)現(xiàn)，在FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放過(guò)程中，cpb-3的氣孔開(kāi)度始終大于野生型，且有差異 (P<0.05) ，氣孔開(kāi)放的速率更快，這充分說(shuō)明CPB在氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著積極的作用。而CPB缺失導(dǎo)致的氣孔開(kāi)放異常也是導(dǎo)致突變體失水較快，萎蔫程度高的一個(gè)主要原因。殼梭孢素FC是生長(zhǎng)在扁桃、桃類植株上的真菌產(chǎn)生的一種植物激素，能引起幾乎所有高等植物氣孔開(kāi)放和葉子枯萎。CP蛋白在葉片干旱失水、FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放中的實(shí)驗(yàn)表型，與已有報(bào)到中CP在熱激、病原菌入侵等逆境脅迫信息傳遞中的作用相一致。

微絲骨架的動(dòng)態(tài)變化參與氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)控。CP能夠調(diào)節(jié)微絲動(dòng)態(tài)，那么CP是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)微絲動(dòng)態(tài)排布這一方式來(lái)參與氣孔運(yùn)動(dòng)呢？通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)CPB功能缺失以后，突變體對(duì)微絲特異性藥物更加敏感，共聚焦掃描顯微鏡觀察，在開(kāi)放的氣孔中，正常保衛(wèi)細(xì)胞的微絲骨架多以整齊的輻射狀 (TypeⅠ) 排布，而關(guān)閉的氣孔中保衛(wèi)細(xì)胞的微絲逐步發(fā)生解聚或縱向排列 (Type Ⅲ) 。FC處理60 min誘導(dǎo)的開(kāi)放氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中，雖然野生型與突變體保衛(wèi)細(xì)胞中微絲的排布均隨之發(fā)生改變，但cpb-3突變體呈輻射狀密集、明亮粗大微絲束的保衛(wèi)細(xì)胞比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型。在2015年Li等[23]研究中已指出，在擬南芥下胚軸表皮細(xì)胞中，降低CP含量，會(huì)產(chǎn)生更多動(dòng)態(tài)活性的微絲末端，顯著增加微絲片段之間的粘合 (filament-filament annealing) ，微絲長(zhǎng)度增大，生命周期 (lifetime) 加長(zhǎng)，與野生型相比，cpb-1突變體表皮細(xì)胞中出現(xiàn)更密集的微絲，表明CP在植物免疫信號(hào)信息傳遞中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。同樣，在45 ℃/40 min熱激條件下，Atcpb突變體與野生型或cpa突變體相比，依然留存更多穩(wěn)定的微絲網(wǎng)格，顯示AtCPB在熱激中的負(fù)調(diào)節(jié)作用[20]。本文中觀察到突變體保衛(wèi)細(xì)胞微絲組織行為與以上結(jié)果相符。我們推測(cè)，CPB缺失后，增加了保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)單體G-肌動(dòng)蛋白重新聚合生長(zhǎng)到微絲末端的機(jī)率，增加了動(dòng)力學(xué)，加速微絲重排，使其對(duì)外源信號(hào)更加敏感，氣孔開(kāi)度更大。

本文推測(cè)，CPB可能通過(guò)調(diào)控微絲解聚和聚合的動(dòng)態(tài)特征，從而調(diào)節(jié)微絲骨架重排，一方面影響早期氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成，另一方面影響成熟保衛(wèi)細(xì)胞氣孔開(kāi)關(guān)的生理功能，最終調(diào)節(jié)擬南芥植株葉片蒸騰失水。

3.2 Ca2+、K+等可能參與加帽蛋白對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的信號(hào)通路

通常認(rèn)為，氣孔運(yùn)動(dòng)的基本過(guò)程是：保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上的受體感受到外界的信號(hào)刺激，通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生Ca2+、磷質(zhì)酸肌醇等第二信使，激活多種離子通道及相關(guān)的酶，激活一系列的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)[36]。Ca2+作為細(xì)胞廣泛存在的信號(hào)分子，在靜息態(tài)時(shí)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中游離的濃度較低 (<0.1-0.2 μmol/L) 。細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高主要有兩種途徑：一是由胞內(nèi)的鈣庫(kù) (例如液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)中Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，另一是細(xì)胞外的Ca2+通過(guò)離子通道進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，以此來(lái)激活相應(yīng)的靶蛋白或靶酶，引起相應(yīng)生理生化反應(yīng)。細(xì)胞骨架成份也是Ca2+信號(hào)傳遞的下游分子之一。例如，細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白質(zhì)MDP25 (microtubule-destabilizing protein 25) ，又稱PCaP1 (plasma membrane-associated cation binding protein 1) ，是位于質(zhì)膜上的一個(gè)典型的受Ca2+調(diào)節(jié)的結(jié)合蛋白質(zhì)。在Ca2+信號(hào)下，不僅可以與微管結(jié)合，在擬南芥下胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用[37]；而且還可以結(jié)合微絲，胞內(nèi)Ca2+水平可決定其亞細(xì)胞定位，并增強(qiáng)MDP25切割微絲的活性，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)擬南芥花粉管生長(zhǎng)[38-40]。

另一方面，研究也發(fā)現(xiàn)，微絲骨架的動(dòng)態(tài)變化反過(guò)來(lái)也能調(diào)節(jié)Ca2+濃度水平。在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞中，采用膜片鉗技術(shù)施加微絲特異性藥物細(xì)胞松弛素D或鬼筆環(huán)肽 (phalloidin) ，解聚微絲或穩(wěn)定微絲，會(huì)相應(yīng)激活或阻礙對(duì)滲透敏感且張力激活的Ca2+滲透通道 (osmo-sensitive and stretch-activated Ca2+-permeable channel) ，反饋調(diào)節(jié) (negative feedback)Ca2+[39]。表明保衛(wèi)細(xì)胞微絲骨架解聚聚合的動(dòng)態(tài)變化通過(guò)改變質(zhì)膜上的Ca2+通道，在Ca2+上游發(fā)揮作用。在這一過(guò)程中，微絲結(jié)合蛋白質(zhì)是否也有參與呢？本文采用非損傷微測(cè)技術(shù)結(jié)果顯示，F(xiàn)C處理短短5 min，突變體cpb-3與野生型保衛(wèi)細(xì)胞均發(fā)生Ca2+外流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，但突變體的Ca2+外流明顯比野生型更劇烈，Ca2+波動(dòng)幅度更大，表明加帽蛋白CP的β亞基 (CPB) 突變后，Ca2+的跨膜流動(dòng)產(chǎn)生異常，也就是說(shuō)FC→CPB→氣孔開(kāi)放信號(hào)通路中，CPB可能在Ca2+上游發(fā)揮作用。該結(jié)果與2007年膜片鉗在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞中的報(bào)道相符。磷脂酸 (phosphatidic acid，PA) 在膜磷脂中含量豐富，在植物響應(yīng)外界脅迫中具有重要的信號(hào)中介作用。而CP蛋白是目前已知植物微絲結(jié)合蛋白質(zhì)中，唯一一個(gè)與PA結(jié)合并受PA抑制的蛋白質(zhì)[21]，作為PA的生物感應(yīng)器 (a PA biosensor) ，將膜上的磷脂信號(hào)轉(zhuǎn)化為微絲動(dòng)態(tài)特異性的改變[41]。本文推測(cè)，同樣位于膜上的Ca2+通道，也許會(huì)是這一過(guò)程的參與者。此外，Jimenez等[35]發(fā)現(xiàn)，擬南芥加帽蛋白CP是一個(gè)與膜相關(guān)的微絲結(jié)合蛋白質(zhì) (membrane-associatedactin-bindingprotein) ，在植物細(xì)胞內(nèi)的一些膜被細(xì)胞器，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的膜上都有存在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是已知的細(xì)胞內(nèi)的Ca2+庫(kù)，對(duì)于調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度同樣有著舉足輕重的作用。以上報(bào)道均為本文CP蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞Ca2+通道影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化提供一定支持，但準(zhǔn)確具體的作用方式仍需進(jìn)一步研究。并且，細(xì)胞膜上也存在一系列與K+、H+運(yùn)輸和流動(dòng)相關(guān)的載體蛋白質(zhì)和離子通道，這對(duì)于可以直接與膜磷脂酸結(jié)合的CP蛋白來(lái)說(shuō)，其調(diào)節(jié)離子進(jìn)出的功能也不乏可能性和可行性。

綜合以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)可以初步表明CPB能夠通過(guò)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的組織重排參與FC誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而影響葉片蒸騰失水。并且在該信號(hào)通路中，還有保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+、H+和K+跨膜流動(dòng)的參與。具體通路正如Fig.4所示。

Fig.4 A model of the role of CPB in FC-induced stomatal opening

致謝感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)毛同林教授、清華大學(xué)黃善金教授贈(zèng)予的實(shí)驗(yàn)材料以及對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)。