閆曉俊， 王冬來

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系， 北京 100005)

“橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳”。宏觀事物的發(fā)展固然有賴于其所處的環(huán)境，而微觀分子的生物學(xué)功能也不乏取決于其所在的細(xì)胞“土壤”。免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)本是一類表達(dá)在免疫細(xì)胞表面的抑制性分子，對(duì)于自身免疫耐受的建立、防止免疫反應(yīng)的過度激活、維持生理?xiàng)l件下免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用。應(yīng)用單克隆抗體靶向免疫檢查點(diǎn)的免疫療法業(yè)已在多種進(jìn)展期腫瘤治療中取得了矚目的成就[1, 2]。有趣的是，近年的研究顯示，一些關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)分子，例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)和程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)，在某些類型的腫瘤細(xì)胞中也存在表達(dá)；而這些表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中的免疫檢查點(diǎn)分子，被稱為“腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子(cancer cell-intrinsic immune checkpoint molecules)”。名雖相似，質(zhì)卻不同：由于離開了免疫細(xì)胞的“土壤”，這些分子顯然不再具備傳統(tǒng)意義上“免疫檢查點(diǎn)”的功能；然而，這些“異位”表達(dá)的檢查點(diǎn)分子可以對(duì)腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為或者微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用產(chǎn)生復(fù)雜的影響。因此，這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)拓展了免疫檢查點(diǎn)分子研究的范疇，推動(dòng)了免疫檢查點(diǎn)分子在腫瘤細(xì)胞中生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制的新探索和再認(rèn)識(shí)，為制定基于靶向免疫檢查點(diǎn)分子的腫瘤精準(zhǔn)干預(yù)策略提供了新的思路。本文對(duì)腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的研究脈絡(luò)作一梳理，并以CTLA-4和PD-1為例，闡述腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的功能和調(diào)控機(jī)制，最后對(duì)腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的研究前景作一展望。

1 腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子研究的主要脈絡(luò)

在過去十余年中，領(lǐng)域內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了從慢到快的過程。早在2005年，就在多種類型的實(shí)體瘤中檢測到CTLA-4轉(zhuǎn)錄本，但彼時(shí)其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的意義尚不明確[3]；直到2012年的一項(xiàng)臨床相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)CTLA-4高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者死亡率較低，推測這一現(xiàn)象可能由于高表達(dá)CTLA-4的腫瘤細(xì)胞與肺癌組織中表達(dá)CTLA-4配體的細(xì)胞相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。這一研究首次將腫瘤細(xì)胞固有CTLA-4表達(dá)與腫瘤的預(yù)后進(jìn)行聯(lián)系，提示腫瘤細(xì)胞固有CTLA-4的表達(dá)及其調(diào)控具有重要的生物學(xué)意義[4]。值得注意的是，不同類型的腫瘤細(xì)胞中CTLA-4表達(dá)的結(jié)果及調(diào)控機(jī)制可能完全不同[5, 6]。腫瘤細(xì)胞固有PD-1的發(fā)現(xiàn)源于2010年一項(xiàng)對(duì)致瘤性ABCB5+黑色素瘤(melanoma)細(xì)胞亞群的研究[7]。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)的研究在2015年證實(shí)，在不同黑色素瘤細(xì)胞亞群及多個(gè)黑色素瘤細(xì)胞系中均存在PD-1的表達(dá)；更為重要的是，該研究首次提出了黑色素瘤細(xì)胞固有PD-1的表達(dá)，可通過獲得性免疫反應(yīng)非依賴的方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。在當(dāng)時(shí)，靶向PD-1的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)如火如荼的大背景下，這一發(fā)現(xiàn)無疑起到里程碑式的作用，直接推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子、特別是腫瘤細(xì)胞固有PD-1的研究。目前，在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)、非小細(xì)胞肺癌中均發(fā)現(xiàn)腫瘤固有PD-1的表達(dá)，并且以不同方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)[9-11]。除了CTLA-4和PD-1，其他免疫檢查點(diǎn)分子包括淋巴細(xì)胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3, LAG3)、T細(xì)胞免疫球蛋白3(T-cell immunoglobulin 3, TIM3)、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域(T-cell immunoglobulin and ITIM domain, TIGIT)在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和功能近年來也陸續(xù)被報(bào)道[12-14]，進(jìn)一步豐富了腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的研究內(nèi)容和理論體系。近年，還將目光聚焦到腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的調(diào)控機(jī)制方面。例如，在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)了抑癌蛋白p53調(diào)控肺癌細(xì)胞中PD-1表達(dá)的分子機(jī)制[15]；在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)現(xiàn)了RNA去甲基化酶肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞中PD-1 mRNA穩(wěn)定性的分子機(jī)制[16](Fig.1)。

Fig.1 The timeline and the milestones of the studies on cancer cell-intrinsic immune checkpoint molecules

2 腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的功能和調(diào)控機(jī)制

2.1 CTLA-4

CTLA-4是早期發(fā)現(xiàn)的可表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)分子。CTLA-4主要表達(dá)在T細(xì)胞表面，屬于CD28免疫球蛋白家族成員[17]。當(dāng)它以“免疫檢查點(diǎn)”的身份工作時(shí)，CTLA-4主要作為T細(xì)胞表面的免疫抑制性受體，與抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)表面的CD80或CD86配體分子結(jié)合，向T細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的激活[18]。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)表面高表達(dá)CTLA-4分子，通過競爭性結(jié)合APCs表面的CD80或CD86分子，抑制APCs的功能，進(jìn)而阻礙其他類型T細(xì)胞，例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的激活，最終抑制腫瘤免疫[19]。Ipilimumab是第一個(gè)被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)的靶向CTLA-4的單克隆抗體，目前已用于治療皮膚黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌等[20]。近年來，研發(fā)了一些新的靶向CTLA-4的抗體，例如Tremelimumab和Quavonlimab，已經(jīng)進(jìn)入晚期黑色素瘤和NSCLC治療臨床實(shí)驗(yàn)階段[21, 22]。

而作為“腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子”登場的CTLA-4，已被發(fā)現(xiàn)表達(dá)在多種人類惡性實(shí)體瘤(例如黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤等)或其來源細(xì)胞系中[3]。應(yīng)用重組的CTLA-4配體CD80或CD86處理CTLA-4陽性的腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示除了“耗竭”T細(xì)胞以外，CTLA-4還能通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在部分NSCLC患者癌細(xì)胞中，存在CTLA-4的高表達(dá)；且在缺乏獲得性免疫的條件下，使用抗CTLA-4抗體可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤[4, 5]。這一發(fā)現(xiàn)表明，腫瘤細(xì)胞固有CTLA-4的表達(dá)直接參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗CTLA-4抗體可激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號(hào)通路，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)程序性死亡蛋白配體1(programmed death ligand 1, PD-L1)，這也部分解釋為何在缺乏獲得性免疫的條件下，使用抗CTLA-4抗體會(huì)“出人意料”的促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[5]。上述研究提示，在獲得性免疫存在的條件下，聯(lián)合靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1可能會(huì)產(chǎn)生“1+1>2”的效果。例如，在抗PD-1/PD-L1免疫治療失敗的黑色素瘤患者中，同時(shí)給予抗CTLA-4抗體Ipilimumab和抗PD-1抗體Pembrolizumab的治療效果要優(yōu)于單獨(dú)給予抗PD-1/PD-L1的治療[23]。這可能是由于抗CTLA-4抗體的治療上調(diào)了腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了抗PD-1/PD-L1治療的敏感性。

通過對(duì)腫瘤細(xì)胞系百科全書(Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE)大數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞固有CTLA-4在功能上可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[24]。然而具體到個(gè)例，情況卻不盡相同。例如，在一項(xiàng)針對(duì)黑色素瘤干細(xì)胞(melanoma stem cell)研究中發(fā)現(xiàn)，其固有表達(dá)的CTLA-4可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[6]。此外，有meta分析表明，腫瘤微環(huán)境中CTLA-4表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后差密切相關(guān)[25]。目前，對(duì)于調(diào)控CTLA-4的分子機(jī)制報(bào)道較少，且主要基于對(duì)免疫細(xì)胞的研究。例如，在濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper, Tfh)中，轉(zhuǎn)錄因子TCF1(transcription factor T cell factor 1)的HDAC(histone deacetylase)結(jié)構(gòu)域突變能促進(jìn)CTLA-4表達(dá)[26]。表觀遺傳機(jī)制，例如DNA甲基化修飾也可調(diào)控CTLA-4的表達(dá)[27]；一項(xiàng)基于黑色素瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的水平可以作為預(yù)測抗CTLA-4抗體治療敏感性的生物標(biāo)志物[28]。雖然目前對(duì)腫瘤細(xì)胞是否存在特異性調(diào)控CTLA-4表達(dá)的分子機(jī)制仍不甚清楚，已有的研究初步表明，腫瘤細(xì)胞固有CTLA-4的功能在不同類型的腫瘤細(xì)胞中存在異質(zhì)性，因此，應(yīng)用多種腫瘤系統(tǒng)或模型來探索腫瘤細(xì)胞固有CTLA-4的調(diào)控機(jī)制和分子功能網(wǎng)絡(luò)是十分必要的。

2.2 PD-1

PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的可表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)分子，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[29]。PD-1，又稱CD279，于1992年首次在白細(xì)胞介素3(interleukin 3, IL-3)缺乏的小鼠造血祖細(xì)胞系LyD9和小鼠雜交瘤細(xì)胞系2B 4-11中被鑒定[30]。作為“免疫檢查點(diǎn)”的PD-1分子主要表達(dá)在外周激活的T細(xì)胞表面；其他種類的免疫細(xì)胞，例如B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和中央樹突狀細(xì)胞也存在PD-1的表達(dá)[31]。當(dāng)表達(dá)在T細(xì)胞表面的PD-1與表達(dá)在腫瘤細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞表面的受體分子PD-L1或PD-L2結(jié)合時(shí)，可抑制T細(xì)胞受體(T-cell receptor, TCR)下游的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的功能[32]。

腫瘤細(xì)胞固有PD-1的表達(dá)最早在黑色素瘤患者的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[7]。值得注意的是，PD-1的表達(dá)主要存在于ABCB5陽性的惡性黑色素瘤起始細(xì)胞(malignant melanoma initiating cells, MMICs)，而非組織中所有的腫瘤細(xì)胞[7]。這種腫瘤細(xì)胞“非均一”的PD-1表達(dá)模式也在后來的研究中被進(jìn)一步證實(shí)：(1)只有約60%的黑色素瘤樣本中組織活檢存在腫瘤細(xì)胞固有PD-1的表達(dá)；(2)只有部分黑色素瘤細(xì)胞系中的部分細(xì)胞亞群存在PD-1的表達(dá)[8]。在小鼠來源的黑色素瘤細(xì)胞系B16F0或B16F10中過表達(dá)外源PD-1會(huì)顯著促進(jìn)上述細(xì)胞系形成腫瘤的能力，而敲減腫瘤細(xì)胞固有PD-1或使用抗PD-1抗體封閉腫瘤細(xì)胞固有PD-1則會(huì)抑制腫瘤的形成[8, 33]。重要的是，這種PD-1對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系成瘤能力的改變無論在正常的受體小鼠還是在免疫缺陷的受體小鼠中均可被穩(wěn)定觀察到。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于，揭示了腫瘤細(xì)胞固有PD-1可以通過“獲得性免疫非依賴”這一途徑，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為，并可能以此為基礎(chǔ)在靶向PD-1的腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。由于微環(huán)境中的黑色素瘤細(xì)胞或其他浸潤細(xì)胞存在PD-L1的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞表面的PD-1與自身或鄰近細(xì)胞表面的PD-L1相結(jié)合，激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)通路下游效應(yīng)子核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6, RPS6)的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成[8](Fig. 2A)。盡管這是一種合理的解釋，但是由于RPS6是許多上游信號(hào)的效應(yīng)分子，因此，腫瘤細(xì)胞固有PD-1有可能還受到其他信號(hào)通路或分子機(jī)制的調(diào)控。

在肝細(xì)胞癌和胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中也存在PD-1的表達(dá)，并且在功能上同樣可以通過“獲得性免疫非依賴”的方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[9, 10]，但二者的機(jī)制不盡相同。在肝癌細(xì)胞中，PD-1直接結(jié)合mTOR通路下游的真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)和RPS6，通過促進(jìn)二者的磷酸化修飾激活促增殖效應(yīng)(Fig. 2B)。在動(dòng)物模型中，聯(lián)合應(yīng)用mTOR抑制劑和抗PD-1抗體對(duì)抑制肝癌細(xì)胞成瘤的作用優(yōu)于二者單獨(dú)使用，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)[9]。在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和細(xì)胞系中，均檢測到PD-1的表達(dá)，且腫瘤組織中PD-1的表達(dá)水平與生存期成負(fù)相關(guān)，提示腫瘤細(xì)胞固有PD-1與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后相關(guān)。胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中PD-1與MOB1(mps one binder 1)結(jié)合，并抑制其磷酸化、激活Hippo信號(hào)通路下游靶基因CYR61(cysteine-rich angiogenic inducer 61)和CTGF(connective tissue growth factor)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡(Fig. 2C)。研究同樣發(fā)現(xiàn)，使用Hippo通路抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷治療的策略，在抑制胰腺癌細(xì)胞成瘤方面優(yōu)于二者單獨(dú)使用，這也提示，干預(yù)腫瘤細(xì)胞固有PD-1及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于腫瘤的免疫治療可能發(fā)揮有益的作用[10]。盡管在不同類型的腫瘤或不同特點(diǎn)的腫瘤微環(huán)境中，使用同樣的策略會(huì)得到不同的結(jié)果。

2018年，1個(gè)病例研究報(bào)道了1例非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞患者，在放療聯(lián)合抗PD-1抗體治療后不但未能使腫瘤消退，反而促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展[11]。病理檢查證實(shí)，該患者的腫瘤細(xì)胞存在PD-1的表達(dá)，推測可能由于抗PD-1抗體封閉了腫瘤細(xì)胞固有PD-1而導(dǎo)致了腫瘤的進(jìn)展。這一推測在小鼠模型上得到了證實(shí)：在表達(dá)PD-1的小鼠肺癌細(xì)胞系M109中，敲減PD-1或使用抗PD-1抗體封閉腫瘤細(xì)胞PD-1能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的活性，而過表達(dá)PD-1則起到相反的作用。重要的是，在免疫缺陷小鼠的荷瘤實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)給予抗PD-1抗體治療加速腫瘤的生長、抑制腫瘤的凋亡。這一發(fā)現(xiàn)與上述肺癌病例的情況高度相似，提示在非小細(xì)胞肺癌中固有表達(dá)的PD-1能通過“免疫非依賴”的方式抑制腫瘤的進(jìn)展，發(fā)揮類似“腫瘤抑制因子”的作用。與M109細(xì)胞中觀察結(jié)果一致的是，在人源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299或Calu-1中過表達(dá)PD-1，也觀察到體外細(xì)胞增殖、克隆形成以及體內(nèi)細(xì)胞成瘤能力的降低[34]。給予接種了NCI-H1299細(xì)胞的免疫缺陷小鼠以抗PD-1抗體處理，顯著促進(jìn)腫瘤的生長，進(jìn)一步證明了“封閉”非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞固有PD-1不利于腫瘤的治療。究其背后的分子機(jī)制，可能是由于抗體-PD-1的相互作用激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)部AKT(protein kinase B, PKB)、mTOR、ERK(extracellular regulated protein kinases)等信號(hào)通路(Fig. 2 D)。除此之外，在小細(xì)胞肺癌[35]、胃癌[36]、鼻咽癌[37]、骨肉瘤[38]和急性淋巴細(xì)胞白血病[39]中也檢測到腫瘤細(xì)胞固有PD-1的表達(dá)，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響仍有待進(jìn)一步探索和證實(shí)。

Fig.2 The signaling pathways and biological functions of cancer cell-intrinsic PD-1 (A) Melanoma-expressing PD-1 promotes tumor progression by activating phospho-RPS6. (B) PDAC-intrinsic PD-1 coordinates with MOB1 and the hippo pathway to promote tumor progression. (C) In HCC cells, PD-1 employs eIF4E and RPS6, the key downstream substrates of the mTOR pathway, to facilitate tumor progression. (D) NSCLC-intrinsic PD-1 suppresses tumor growth by inhibiting AKT, mTOR and ERK pathways

盡管在免疫細(xì)胞中調(diào)控作為“免疫檢查點(diǎn)”的PD-1的分子機(jī)制已研究得較為透徹[40, 41]，但腫瘤細(xì)胞如何在各個(gè)水平調(diào)控PD-1的表達(dá)仍遠(yuǎn)不清楚?？紤]到去分化的腫瘤細(xì)胞與特化的免疫細(xì)胞存在明顯的異質(zhì)性，因此，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部和甚至不同腫瘤類型之間，很可能存在特異性的調(diào)控PD-1的分子機(jī)制。例如，真核信使RNA(messenger RNA，mRNA)最顯著的化學(xué)修飾——m6A甲基化，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞中PD-1 mRNA的水平[16]。m6A去甲化酶FTO調(diào)控PD-1 mRNA的衰減；敲低FTO增加關(guān)鍵促瘤基因的 m6A 甲基化水平，被m6A 甲基化“閱讀器(reader)”——YTHDF2識(shí)別后促進(jìn)PD-1 mRNA降解，從而增加黑色素瘤細(xì)胞抗PD-1治療的敏感性(Fig. 3)。在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)，小RNA miR-33a與PD-1和PD-L1 mRNA的3′UTR結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)這2個(gè)基因的表達(dá)[42](Fig. 3)。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，在包括肺腺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胰腺導(dǎo)管癌來源的腫瘤細(xì)胞系中，存在抑癌蛋白p53依賴的PD-1的轉(zhuǎn)錄激活[15]。在這個(gè)過程中，由乙?；D(zhuǎn)移酶p300、CBP和TIP60介導(dǎo)的在p53第120位和164位賴氨酸殘基的乙?；揎椘鸢l(fā)揮了關(guān)鍵的作用(Fig. 3)。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細(xì)胞系NCI-H1299表達(dá)外源PD-1可誘導(dǎo)“免疫非依賴”的腫瘤抑制效應(yīng)；更為重要的是，抑制該細(xì)胞內(nèi)源性PD-1的表達(dá)顯著抑制p53依賴的腫瘤抑制效果。應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿┛擅黠@上調(diào)乙酰化p53依賴的PD-1的表達(dá)，通過激活p53-PD-1軸發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

Fig.3 The mechanistic profiles of how PD-1 is regulated in cancer cells The acetylated p53 catalyzed by p300, CBP and TIP60 is a master regulator that transcriptionally activates PD-1 expression in the nucleus, while the downregulation of PD-1 can be achieved by miR-33a and the m6A methylation-mediated mRNA decay mechanisms

綜上所述，腫瘤細(xì)胞固有PD-1的表達(dá)在不同類型的腫瘤中存在明顯差異，且可以通過影響腫瘤免疫或通過“獲得性免疫非依賴”的方式調(diào)控腫瘤微環(huán)境或腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為，最終展現(xiàn)出不同的生物學(xué)意義。這些現(xiàn)象的背后，是腫瘤細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜的調(diào)控PD-1的分子機(jī)制及控制網(wǎng)絡(luò)，也有待未來的工作中進(jìn)一步研究。

2.3 其它腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子

除了CTLA-4和PD-1，近年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的其它免疫檢查點(diǎn)分子，例如LAG3、TIM3和TIGIT。LAG3主要在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)[12]。肝癌細(xì)胞中表達(dá)的TIM3可激活NF-κB(nuclear factor-k-gene binding)信號(hào)通路，進(jìn)而刺激白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)分泌和STAT3磷酸化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這提示阻斷腫瘤細(xì)胞固有TIM3可能促進(jìn)抗TIM3抗體治療的效果。最近，腫瘤細(xì)胞固有TIM3的“異位”表達(dá)被認(rèn)為是結(jié)腸癌、腎癌、肺癌、宮頸癌和前列腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，TIM3高表達(dá)通過促進(jìn)腫瘤增殖和代謝等機(jī)制，與腫瘤患者的低生存率相關(guān)[13, 43]。腫瘤細(xì)胞固有TIGIT主要發(fā)現(xiàn)表達(dá)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，具有促進(jìn)腫瘤生長的作用；其分子機(jī)制主要是通過抑制NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能來實(shí)現(xiàn)[14]。目前，對(duì)這些免疫檢查點(diǎn)分子在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制研究的仍較少。另有報(bào)道，在黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中，DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine)上調(diào)LAG3的mRNA水平，提示LAG3的甲基化水平可能作為預(yù)測抗LAG3免疫檢查點(diǎn)阻斷治療反應(yīng)性的生物標(biāo)志物[44]。最近，一些新的免疫檢查點(diǎn)分子，例如B7-H4(B7 homolog 4)，4-1BB (CD137，tumor necrosis factor receptor superfamily 9)，HVEM(herpes virus entry mediator)和GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein)在腫瘤微環(huán)境中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[45]，它們是否在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)及發(fā)揮生物學(xué)功能尚有待研究。

3 問題與展望

腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的研究方興未艾。隨著一系列關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)分子,例如CTLA-4、PD-1的表達(dá)在越來越多的腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，領(lǐng)域內(nèi)逐漸認(rèn)識(shí)到這些“不在其位，也謀其政”的檢查點(diǎn)分子在功能上存在復(fù)雜性和異質(zhì)性，在調(diào)控上也很可能存在相對(duì)性和特異性。對(duì)于腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的研究，有益于人們從“腫瘤細(xì)胞”的角度認(rèn)識(shí)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的“博弈”。對(duì)于這些“異位”檢查點(diǎn)分子在功能上的再認(rèn)識(shí)，將有助于輔助臨床設(shè)計(jì)合理的和個(gè)體化的免疫治療策略，分清“敵軍”、“友軍”，提高“殲敵效率”，避免“脫靶”或“誤傷”。此外，理清腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子在各個(gè)層次的調(diào)控機(jī)制，有利于人們開發(fā)新的或聯(lián)合的腫瘤干預(yù)策略，在傳統(tǒng)靶向“免疫檢查點(diǎn)”治療的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步豐富對(duì)抗腫瘤的“武器庫”。

值得注意的是，腫瘤細(xì)胞中一些免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平較低，需要使用高效的抗體或敏感的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究。其次，免疫檢查點(diǎn)分子多是糖蛋白，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間、不同類型的腫瘤細(xì)胞之間，糖基化修飾的酶促反應(yīng)體系和活性可能存在顯著不同。因此，系統(tǒng)鑒定腫瘤細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)分子的差異性糖基化修飾模式，對(duì)于解析腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子的細(xì)胞定位、分子功能和調(diào)控的生物學(xué)過程具有重要意義。此外，由于腫瘤細(xì)胞富集的轉(zhuǎn)錄因子及蛋白質(zhì)表達(dá)譜與免疫細(xì)胞有明顯不同，應(yīng)用高通量的染色質(zhì)免疫共沉淀-測序(chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-seq)、免疫共沉淀-質(zhì)譜-互作蛋白質(zhì)組分析(affinity purification-mass spectrometry, AP-MS)等手段，有助于揭示調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)的關(guān)鍵因子和機(jī)制。最后，考慮到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性及腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，應(yīng)用基于臨床或模式動(dòng)物腫瘤組織的單細(xì)胞測序技術(shù)，有利于全景式分析和展示腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞乃至間質(zhì)細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)及功能互作關(guān)系，有望為個(gè)體化靶向治療開展提供重要的研究依據(jù)。期待不久的將來，隨著腫瘤細(xì)胞固有免疫檢查點(diǎn)分子研究領(lǐng)域出現(xiàn)里程碑式的突破，可以為腫瘤免疫治療乃至其他腫瘤治療方法的發(fā)展提供新的途徑。