陶 旺 陳金秀 陳 聰 吳 湘

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000）

急性肺損傷（ALI）是由各種肺內(nèi)外致病因素引起的以肺泡上皮細(xì)胞和肺內(nèi)毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致肺間質(zhì)及肺泡彌漫性水腫，臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、進(jìn)行性呼吸困難等一系列肺部感染及低氧血癥［1］。中醫(yī)典籍中并無ALI的記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸為“咳嗽”“喘證”等范疇。其病機(jī)關(guān)鍵在于熱毒壅肺、痰瘀互結(jié)；病理產(chǎn)物主要為痰、熱、水、瘀等，病性屬熱［2］。中醫(yī)藥多途徑多靶點(diǎn)的特點(diǎn)對(duì)于ALI的治療有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。明代醫(yī)家李時(shí)珍［3］稱之為“瀉肺諸方之準(zhǔn)繩”的瀉白散，出自北宋·錢乙《小兒藥證直訣·卷下諸方》。該方由桑白皮、地骨皮、甘草、粳米4味藥組成，是治療肺熱喘咳的經(jīng)典方劑。方中君藥桑白皮，辛甘而寒，獨(dú)入肺經(jīng)，不僅能清熱肅肺，尚可利水導(dǎo)火熱從小便而出，且氣薄質(zhì)液不剛不燥，祛邪而不損正；臣藥地骨皮，甘寒入肺肝腎經(jīng)，既助桑白皮清降肺中伏火，又養(yǎng)陰生津止渴，退骨蒸除五心煩熱；君臣相合，清肺熱養(yǎng)肺陰，以達(dá)金清氣肅之妙；甘草、粳米護(hù)胃調(diào)中，補(bǔ)脾益肺以培土生金，共為佐使藥，使瀉白散瀉肺而不傷正，寒涼而不傷胃［4］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從基因靶點(diǎn)層面分析中藥復(fù)方活性成分與疾病多靶點(diǎn)之間的相互作用，通過檢索數(shù)據(jù)庫以構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖，并預(yù)測(cè)其治療疾病的有效成分和機(jī)制通路。故本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，篩選瀉白散治療ALI的相關(guān)分子機(jī)制，以期為瀉白散治療ALI提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瀉白散相關(guān)靶點(diǎn)篩選 在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫［5］中，以“桑白皮”“甘草”和“地骨皮”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)有效成分信息，并以類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為條件對(duì)有效成分進(jìn)行篩選。篩選結(jié)束后，在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）蛋白數(shù)據(jù)庫中，限定物種為“Homo sapiens”，將所有靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因名稱，并剔除重復(fù)及無法檢索的靶點(diǎn)，獲得中藥有效成分靶點(diǎn)。

1.2 ALI相關(guān)靶基因的確定 Genecards數(shù)據(jù)庫自動(dòng)整合了約150個(gè)網(wǎng)絡(luò)資源的基因中心數(shù)據(jù)，包括基因組、蛋白質(zhì)組、臨床和功能信息。為獲取疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)，在Genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中，以“acute lung injury”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲得ALI疾病基因靶點(diǎn)。

1.3 瀉白散與ALI疾病的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為明晰瀉白散相關(guān)靶點(diǎn)與ALI疾病靶點(diǎn)的相互作用，利用Venny 2.1取瀉白散相關(guān)靶點(diǎn)與ALI疾病基因靶點(diǎn)的交集。進(jìn)而將兩者共同靶基因輸入Cytoscape3.7.2中，借助bisogenet插件繪制瀉白散成分-ALI靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用CytoNCA插件對(duì)該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行相關(guān)拓?fù)浞治?，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）以及緊密度（Closeness），獲得瀉白散作用于該疾病的潛在蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，再分析其發(fā)展過程中的作用。

1.4 功能與通路的富集分析 Metascape平臺(tái)為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)家提供了全面的基因列表注釋和分析資源［6］。將瀉白散治療ALI疾病的潛在基因?qū)隡etascape平臺(tái)，設(shè)置P＜0.01，分析可能的生物學(xué)過程和代謝通路并進(jìn)行富集分析，將相關(guān)數(shù)據(jù)用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 瀉白散與ALI疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 見表1。共獲得桑白皮的有效成分32個(gè)，甘草的有效成分92個(gè)，地骨皮的有效成分13個(gè)。按照OB值大小排列，表1展示了排名前15的活性成分。從Genecards數(shù)據(jù)庫中共獲得223個(gè)疾病基因靶點(diǎn)，score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切。

表1 瀉白散的活性成分（排名前15）

2.2 瀉白散有效成分網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 利用Cytoscrape 3.7.2構(gòu)建“瀉白散-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（如圖1），節(jié)點(diǎn)之間的連線代表藥物與有效成分、有效成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系。有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)越多，其形狀也越大。圖中A2、A3、B1為瀉白散中聯(lián)系最緊密的活性成分，分別為“quercetin槲皮素”“kaempferol山柰酚”“naringenin柚皮素”?；蛐蛄蠱OL004328、MOL000449、MOL012681、MOL000296、MOL001792、MOL000239 所代表的基因靶點(diǎn)之間節(jié)點(diǎn)最多，連接最緊密，可能為瀉白散發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖1 瀉白散-有效成分-靶點(diǎn)

2.3 瀉白散成分-ALI靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 用Venny 2.1對(duì)活性成分靶點(diǎn)與ALI靶點(diǎn)取交集后，共得到194個(gè)共同靶點(diǎn)，即為瀉白散治療ALI的潛在靶點(diǎn)，包括PTGS1、CHRM3、SCN5A、PIK3CG等（如圖 2）。使用Cytoscape3.7.2將瀉白散與ALI的共同靶基因輸入bisogenet插件中，繪制瀉白散成分-ALI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，得到初始PPI網(wǎng)絡(luò)共1 779個(gè)節(jié)點(diǎn)，58 260條邊，節(jié)點(diǎn)（node）代表活性成分、靶點(diǎn)、藥物及疾病名稱。邊（edge）代表各中藥與活性成分、活性成分與靶點(diǎn)、疾病與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。運(yùn)用CytoNCA插件對(duì)該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行相關(guān)拓?fù)浞治?，?Degrees＞56，Betweenness＞1 241.2212，Closeness＞0.086289056為篩選條件進(jìn)一步精簡(jiǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，得到339個(gè)節(jié)點(diǎn)，11 464條邊，再進(jìn)行二次篩選得到160個(gè)節(jié)點(diǎn)、3 958條邊的PPI核心網(wǎng)絡(luò)（如圖3）。最終篩選得出6個(gè)核心靶點(diǎn)（如圖4），藥物與ALI相關(guān)核心蛋白包括 NPM1、TP53、COPS5、MCM2、CUL1、CUL3（如表2）。

表2 瀉白散治療ALI關(guān)鍵靶點(diǎn)（排名前5）

圖2 瀉白散活性成分靶點(diǎn)與ALI靶點(diǎn)venn圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)精簡(jiǎn)圖

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 運(yùn)用Metascape平臺(tái)對(duì)瀉白散治療ALI疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，借助微生信平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。瀉白散治療ALI疾病潛在通路主要包括靶向腫瘤細(xì)胞凋亡通路（Pathways in cancer）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK信號(hào)通路）、FoxO轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia通路）以及JAKSTAT信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路等（見圖5），與調(diào)控炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能密切相關(guān)。瀉白散主要參與的生物學(xué)過程有激素反應(yīng)（response to hormone）、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)（cellular response to nitrogen compound）、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)（cellular response to lipid）、對(duì)外來刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）等（見圖6）；相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)血脂的功能主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）、脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等。

圖5 瀉白散-ALI KEGG通路分析

圖6 瀉白散-ALI GO功能富集分析

3 討論

《小兒藥證直訣·卷下諸方》記載瀉白散“既可瀉肺之實(shí)熱，又可瀉肺之虛熱”，其配伍之妙主要在于桑白皮與地骨皮。首先，兩者一清一透：桑白皮以清透為主，性寒能清肺熱，辛又透肺中郁火，兼益元?dú)夤瘫?；地骨皮既清?shí)熱又清虛熱，兩藥配伍使之清而不傷正，透而不郁，滋而不膩。其次，兩者一氣一血：桑白皮走氣分，清泄肺部實(shí)熱；地骨皮走氣血兩分，王好古謂其能“降肺中伏火，清胞中火，退熱”；又清血分之熱，清熱涼血止血，防肺熱灼傷血絡(luò)出血。最后，兩皮配伍法：清代《成方便讀·卷三》所言“桑白皮皮能行皮，根者入土最深；地骨皮直入黃泉，涼血退蒸”。邪氣多從皮毛而入，郁閉肺氣使肺失于宣降，皮能散表，故二皮運(yùn)用取其象形思維，更有利于宣散邪氣、暢達(dá)氣機(jī)，可用于治療肺中伏火所致皮膚蒸熱、日晡尤甚之皮膚病。《本草害利》曰“地骨皮甘淡而寒，涼血清三焦，降肺中伏火，用地骨皮走表又走里”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ALI的臨床表現(xiàn)與《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載“故肺病者，喘息鼻張”“肺高者上氣，肩息咳”相類似，在病機(jī)上與“熱毒壅肺、痰瘀互結(jié)”密不可分。桑白皮與地骨皮兩者配伍不僅散外邪又清肺熱，表里兼顧；同時(shí)氣血兩清，防瘀血形成及出血等并發(fā)癥。故瀉白散對(duì)于治療ALI從理論角度有一定治療作用。

ALI的發(fā)病機(jī)制主要在于全身和肺內(nèi)炎性細(xì)胞的持續(xù)激活、炎癥與抗炎癥介質(zhì)的失衡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的一系列炎癥風(fēng)暴，治療ALI首要關(guān)鍵是控制炎癥。藥理研究發(fā)現(xiàn)，瀉白散中桑白皮總黃酮、桑白皮苷能拮抗5-羥色胺和致炎介質(zhì)組胺、抑制肥大細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)而起到抗炎作用［7］；地骨皮水提取物在脂多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞中可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)、一氧化氮、前列腺素E2和促炎細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-6的生成，從而發(fā)揮抗炎作用［8］。在通過鼻腔滴入LPS誘發(fā)的肺部組織病變中，甘草黃酮抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，而有顯著的改善作用［9］。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于基因靶點(diǎn)層面進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，瀉白散與ALI之間存在較多的共同靶點(diǎn)基因，網(wǎng)絡(luò)連接緊密，中藥活性成分以槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇連接最多。三者對(duì)ALI的炎癥反應(yīng)及肺損傷均有保護(hù)作用，槲皮素［10］能抑制細(xì)胞凋亡和減少炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生；山柰酚［11］能夠抑制促炎因子 NF-κB、IL-1β、TNF-α等的表達(dá)；β-谷甾醇［12］可防止肺組織氣道炎癥的發(fā)生，具有良好的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。PPI蛋白互做分析，核心蛋白涉及TP53、CUL3、MCM2等，研究者發(fā)現(xiàn)TP53、CUL3表達(dá)細(xì)胞的比例與炎癥強(qiáng)度相關(guān)，在ALI模型中CUL3、ERCC2、TP53等蛋白因子會(huì)顯著增加［13-14］。

交集基于KEGG通路分析Fox O家族參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、代謝及凋亡等多過程，與炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)。何靖等［15］在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中發(fā)現(xiàn)肺組織的FoxO1發(fā)生磷酸化，能上調(diào)肺組織中α亞基ENαC的表達(dá)，從而改善ALI的預(yù)后；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK信號(hào)通路）主要包括p38 MAPK、ERK和JNK 3條經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，均參與炎癥因子的調(diào)控。侯帥紅等［16］發(fā)現(xiàn)在小鼠ALI模型中MAPK家族中p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表達(dá)量也明顯上升，說明MAPK信號(hào)通路與ALI的炎癥反應(yīng)起著重要作用。JAK2/STAT3信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、炎癥基因的調(diào)控密切相關(guān)［17］，石青青等［18］發(fā)現(xiàn)通過抑制該通路能有效抑制ALI觸發(fā)的炎癥反應(yīng)，及時(shí)遏制炎癥風(fēng)暴。

綜上所述，瀉白散雖藥物精簡(jiǎn)，但配伍巧妙、內(nèi)涵豐富，臨床上經(jīng)加減廣泛運(yùn)用于多系統(tǒng)疾病。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基因靶點(diǎn)與生物信息相結(jié)合，預(yù)測(cè)瀉白散治療ALI的有效成分-靶點(diǎn)-通路機(jī)制，發(fā)現(xiàn)瀉白散可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效成分，與TP53、CUL3、MCM2等蛋白結(jié)合，通過MAPK、FoxO、cAMP或JAK-STAT等信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以及參與炎癥反應(yīng)，從而一定程度上抑制ALI。研究結(jié)果也進(jìn)一步論證中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)治療疾病，這與中醫(yī)整體觀念和辨證論治也相符合，同時(shí)為中醫(yī)治療ALI提供參考與新思路。