魏圣潔, 竇留瑞, 劉 煒, 時明月, 肖夢宇, 李 丹, 牛曉娜, ?？? 白炎亮, 孫 愷

(1. 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院, 河南 鄭州, 450003; 2. 河南省兒童醫(yī)院 血液腫瘤科, 河南 鄭州, 450000;3. 河南省人民醫(yī)院 血液科, 河南 鄭州, 450003)

急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)是兒童最常見的血液系統(tǒng)惡性疾病，具有高度異質(zhì)性。隨著預(yù)后危險度分層和治療策略的不斷完善, B-ALL患兒5年生存率高達(dá)90%, 而緩解后復(fù)發(fā)仍是治療失敗的根本原因[1]。微小殘留病(MRD)是指白血病治療后體內(nèi)殘存白血病細(xì)胞低于常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測閾值的狀態(tài)，常用的檢測方法包括流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RQ-PCR)和二代測序(NGS)技術(shù)[2]。國內(nèi)外多項研究[3-4]顯示, MRD陽性是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，在B-ALL患兒預(yù)后評估、復(fù)發(fā)預(yù)測、風(fēng)險分層及個體化治療指導(dǎo)中具有重要作用。目前，臨床大多通過有創(chuàng)性操作方式骨髓穿刺抽取新鮮骨髓液進(jìn)行MRD檢測，但檢測時機(jī)尚不完全統(tǒng)一。美國癌癥綜合網(wǎng)(NCCN)指南[5]已明確將誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD作為調(diào)整兒童B-ALL危險度分層的依據(jù)，而中國關(guān)于早期外周血MRD檢測在B-ALL患兒危險度分層及預(yù)后中應(yīng)用效果的研究尚較缺乏。本研究基于美國國家癌癥研究所(NCI)支持的TARGET公共數(shù)據(jù)庫[6]探討誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD檢測在B-ALL患兒預(yù)后評估中的意義，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取TARGET數(shù)據(jù)庫(https://ocg.cancer.gov/)中2000—2010年初診的359例B-ALL患兒作為研究對象?；純壕?jīng)FCM檢測誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD和誘導(dǎo)治療第29天骨髓液MRD，敏感度為0.01%。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡1～18歲者; ② 符合B-ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]者; ③ 誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD和第29天骨髓MRD均檢測者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 臨床資料不完整者; ② 合并其他惡性腫瘤者。

1.2 治療方法

所有患兒接受B-ALL標(biāo)準(zhǔn)方案治療，即美國兒童腫瘤協(xié)作組(COG)治療方案(AALL0331、AALL0232和P9906)[5], 均采用甲氨蝶呤、阿糖胞苷、地塞米松鞘內(nèi)注射以預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，其中誘導(dǎo)治療方案以VDLP方案為基礎(chǔ)，包括長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、糖皮質(zhì)激素。

1.3 療效評估及隨訪

數(shù)據(jù)庫隨訪截止日期為2022年1月26日，平均隨訪時間為8(4, 9)年，分析5年無事件生存(EFS)率，療效評估標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5, 7]。完全緩解(CR): ① 骨髓原始淋巴細(xì)胞<5%; ② 外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)>1.0×109/L, 血小板計數(shù)>100×109/L, 無原始淋巴細(xì)胞; ③ 無髓外白血病。復(fù)發(fā): CR后重新出現(xiàn)骨髓原始淋巴細(xì)胞>5%, 或外周血出現(xiàn)原始淋巴細(xì)胞，或出現(xiàn)白血病髓外侵犯。EFS時間: 自確診日期至誘導(dǎo)治療失敗、復(fù)發(fā)、死亡或末次隨訪日期的時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

分別采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0.1軟件對入組患兒臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析、繪圖。非正態(tài)分布的計量資料以[M(P25,P75)]表示，計數(shù)資料以[n(%)]表示。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法; 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以Log-rank檢驗分析EFS率的組間差異; 采用Cox單因素及多因素回歸分析探討預(yù)后的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征分析

359例B-ALL患兒中，男219例，女140例，男女比例為1.6∶1, 平均年齡10.1(3.9, 14.3)歲;TCF3-PBX1基因陽性38例,ETV6-RUNX1基因陽性35例, 4號和10號染色體三倍體陽性35例,MLL基因重排陽性22例,BCR-ABL1基因陽性6例; 初診時平均白細(xì)胞計數(shù)為24.8(8.0, 112.0)×109/L, 平均DNA指數(shù)為1.0(1.0, 1.1); 第8天骨髓原始細(xì)胞占比為10.0(2.0, 40.0)%, 第29天骨髓原始細(xì)胞占比為0(0, 1.0)%, 第8天外周血MRD為0.5(0.1, 2.3)%, 第29天骨髓MRD為0(0, 0.1)%。見表1。至數(shù)據(jù)庫隨訪截止日期，未發(fā)生事件者223例，發(fā)生事件者136例(誘導(dǎo)治療失敗3例，死亡9例，復(fù)發(fā)124例)，總體5年EFS率為(62.2±2.6)%。

表1 359例B-ALL患兒的臨床特征分析

2.2 第8天外周血MRD與第8天骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD水平與第8天骨髓原始細(xì)胞占比呈正相關(guān)(r=0.620,P<0.001)。

2.3 第8天外周血MRD、第29天骨髓MRD水平對B-ALL患兒5年EFS率的影響

誘導(dǎo)治療第8天，外周血MRD<0.01%、0.01%～<0.10%、0.10%～<1.00%、≥1.00%的B-ALL患兒分別為45、65、114、135例, 5年EFS率分別為(76.9±6.4)%、(81.2±4.9)%、(59.8±4.7)%、(49.9±4.4)%, 不同外周血MRD水平患兒的5年EFS率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。第8天外周血MRD 0.10%～<1.00%、≥1.00%患兒的生存曲線大幅下降，提示第8天外周血MRD≥0.10%是B-ALL患兒5年EFS率低的高危因素。見圖1。

圖1 誘導(dǎo)治療第8天不同外周血MRD水平B-ALL患兒的生存曲線

誘導(dǎo)治療第29天，骨髓MRD<0.01%、0.01%～<0.10%、0.10%～<1.00%、≥1.00%的B-ALL患兒分別為227、47、54、31例，5年EFS率分別為(74.4±3.0)%、(45.4±7.4)%、(48.8±6.9)%、(20.2±7.8)%, 不同骨髓MRD水平患兒的5年EFS率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。第29天骨髓MRD 0.01%～<0.10%、0.10%～<1.00%、≥1.00%患兒的生存曲線大幅下降，提示第29天骨髓MRD≥0.01%是B-ALL患兒5年EFS率低的高危因素。見圖2。

圖2 誘導(dǎo)治療第29天不同骨髓MRD水平B-ALL患兒的生存曲線

2.4 第8天外周血MRD聯(lián)合第29天骨髓MRD檢測結(jié)果與5年EFS率的關(guān)系

以第8天外周血MRD≥0.10%、第29天骨髓MRD≥0.01%為界值，將359例B-ALL患兒分為雙陰性組90例、單陽性組157例和雙陽性組112例, 5年EFS率分別為(84.0±3.9)%、(66.8±3.9)%和(38.0±4.7)%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖3。

圖3 第8天外周血MRD與第29天骨髓MRD聯(lián)合檢測不同結(jié)果患兒的生存曲線

第29天骨髓MRD陰性患兒中，第8天外周血MRD陰性者(骨髓MRD陰性外周血MRD陰性組)90例、第8天外周血MRD陽性者(骨髓MRD陰性外周血MRD陽性組)137例, 5年EFS率分別為(84.0±3.9)%、(67.9±4.1)%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。見圖4。

圖4 第29天骨髓MRD陰性患兒第8天外周血MRD陽性、陰性者的生存曲線

第29天骨髓MRD陽性患兒中，第8天外周血MRD陰性者(骨髓MRD陽性外周血MRD陰性組)20例、第8天外周血MRD陽性者(骨髓MRD陽性外周血MRD陽性組)112例, 5年EFS率分別為(59.2±11.1)%、(38.0±4.7)%, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.095)。見圖5。

圖5 第29天骨髓MRD陽性患兒第8天外周血MRD陽性、陰性者的生存曲線

2.5 B-ALL患兒EFS的危險因素

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，初診白細(xì)胞計數(shù)≥50×109/L、DNA指數(shù)<1.16、ETV6-RUNX1基因陰性、4號和10號染色體三倍體陰性、第8天骨髓原始細(xì)胞占比≥20%、第29天骨髓原始細(xì)胞占比≥5%、第8天外周血MRD≥0.10%和第29天骨髓MRD≥0.01%是B-ALL患兒EFS的危險因素(P<0.05); 將上述變量進(jìn)一步納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示DNA指數(shù)<1.16、第29天骨髓原始細(xì)胞占比≥5%、第8天外周血MRD≥0.10%、第29天骨髓MRD≥0.01%是B-ALL患兒EFS的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

3 討 論

B-ALL是一種源自造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的惡性增殖性血液系統(tǒng)腫瘤，具有顯著個體化差異?，F(xiàn)有指南[5, 7-8]已明確提出多種因素與B-ALL患兒預(yù)后相關(guān)，如初診時年齡、外周血白細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞遺傳學(xué)特征、早期治療反應(yīng)、治療過程中骨髓緩解狀態(tài)和MRD水平等。BOROWITZ M J等[9-10]研究指出，兒童B-ALL細(xì)胞遺傳學(xué)預(yù)后取決于MRD狀態(tài), MRD是患兒預(yù)后不良的獨立危險因素。近期有學(xué)者[11]基于TARGET數(shù)據(jù)庫建立兒童B-ALL預(yù)后列線圖，再次證實MRD水平在兒童B-ALL預(yù)后評估中具有重要價值。

目前，臨床研究大多建議首選骨髓標(biāo)本作為MRD檢測標(biāo)本。早期國外研究[12]顯示，外周血MRD和骨髓MRD在急性T淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后評估中具有較好一致性，但在B-ALL中一致性較差。一項前體B-ALL研究[13]發(fā)現(xiàn)，外周血MRD預(yù)測復(fù)發(fā)的敏感度較骨髓MRD更高，這可能是由于前體B細(xì)胞來源于骨髓，外周血MRD陽性更能提示疾病復(fù)發(fā)。葛麗衛(wèi)等[14]亦發(fā)現(xiàn)，以骨髓形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)為金標(biāo)準(zhǔn)，外周血MRD水平在急性白血病患者復(fù)發(fā)率評估中具有較好的敏感性。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD水平在B-ALL患兒預(yù)后評估中具有重要意義，隨著第8天外周血MRD水平的升高，患兒5年EFS率降低。本研究還發(fā)現(xiàn)，第8天外周血MRD水平與第8天骨髓原始細(xì)胞占比具有強(qiáng)正相關(guān)性; 單因素Cox回歸分析顯示，第8天外周血MRD≥0.10%和第8天骨髓原始細(xì)胞占比≥20%均提示EFS差; 多因素Cox回歸分析顯示，第8天外周血MRD≥0.10%是EFS的獨立危險因素。由此提示，外周血MRD可作為B-ALL患兒較為可靠的預(yù)后指標(biāo)，是骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的有益補充。此外，從創(chuàng)傷性角度分析，由于白血病的異質(zhì)性, MRD檢測結(jié)果僅能反映穿刺部位骨髓情況，有時需多部位取材，這在一定程度上加重了患兒的痛苦，而外周血MRD檢測操作簡便且創(chuàng)傷性小，可提高患兒就醫(yī)依從性[15]。

第8天潑尼松試驗結(jié)果是早期治療反應(yīng)的重要觀察指標(biāo)，采用外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行評估，靈敏度相對較低。本研究采用FCM檢測誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD，敏感度為0.01%, 優(yōu)于潑尼松試驗。近期多項研究[16-18]顯示，與FCM、RQ-PCR等方法相比，敏感度更高的檢測方法如NGS可更加靈敏地測定骨髓MRD甚至外周血MRD水平，證實外周血作為MRD測定標(biāo)本及危險分層依據(jù)的可行性極高。同時，與骨髓間歇采樣相比，增加外周血檢測頻率可擴(kuò)大MRD動態(tài)監(jiān)測范圍，有助于全面了解疾病緩解與復(fù)發(fā)情況。

多項研究[19-23]表明，不同時點的MRD水平對B-ALL患兒預(yù)后均具有預(yù)測價值。目前，臨床醫(yī)師大多選擇誘導(dǎo)治療中期、后期和鞏固治療期作為MRD檢測時點。本研究基于TARGET數(shù)據(jù)庫分析誘導(dǎo)治療更早期(第8天)MRD在兒童B-ALL預(yù)后評估中的價值，結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD水平的升高, B-ALL患兒5年EFS率降低; 聯(lián)合檢測誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD與第29天骨髓MRD發(fā)現(xiàn)，雙陰性者預(yù)后最佳，單陽性者次之，雙陽性者預(yù)后最差，提示誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD可作為第29天骨髓MRD的有益補充評估兒童B-ALL預(yù)后。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在第29天骨髓MRD陰性患兒中，第8天外周血MRD≥0.10%者的5年EFS率顯著低于第8天外周血MRD<0.10%者，表明第8天外周血MRD≥0.10%的患兒即使在誘導(dǎo)治療第29天骨髓MRD轉(zhuǎn)為陰性，其預(yù)后仍然較差，這可能與該類患兒骨髓原始淋巴細(xì)胞清除緩慢有關(guān)。BOROWITZ M J等[10]研究顯示，在第29天骨髓MRD陰性患兒中，第8天外周血MRD≥1%者的5年EFS率較MRD<1%者降低。由此提示，本研究可進(jìn)一步細(xì)化風(fēng)險分層，識別出具有潛在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(第8天外周血MRD 0.10%～<1.00%)的患兒。本研究結(jié)果還顯示，在第29天骨髓MRD陽性患兒中，雖然第8天外周血MRD≥0.10%者的5年EFS率低于第8天外周血MRD<0.10%者，但2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與第8天外周血MRD陰性患兒樣本量較少導(dǎo)致結(jié)果偏倚有關(guān)，今后還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

綜上所述，誘導(dǎo)治療第8天外周血MRD在兒童B-ALL預(yù)后評估中具有重要的臨床意義，可作為第8天骨髓細(xì)胞形態(tài)和第29天骨髓MRD的強(qiáng)有力補充。但本研究所用數(shù)據(jù)源于國外早期回顧性資料，缺乏中國B-ALL患兒相關(guān)特征數(shù)據(jù)及進(jìn)一步驗證結(jié)果，后續(xù)亟待開展關(guān)于中國兒童B-ALL誘導(dǎo)治療早期外周血MRD檢測的研究，從而制訂符合中國B-ALL患兒的最佳檢測策略。