楊志敏，陳 源，劉淑坡，李 飛，李四中

（1.華僑大學(xué)a.分析測試中心；b.土木工程學(xué)院；c.材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.譜優(yōu)科技（福州）有限公司，福州 350009）

0 引言

甜味劑作為一種無能量的蔗糖替代品，它的甜度可能是蔗糖的1.3 萬倍，廣泛應(yīng)用于食品和飲料當(dāng)中［1］。據(jù)估計(jì)，全球28%的人每天都食用甜味劑［2］。傳統(tǒng)的甜味劑有甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖等，近年來又出現(xiàn)紐甜、甜菊糖苷等新型甜味劑。隨著甜味劑種類不斷增加以及應(yīng)用領(lǐng)域的逐漸拓寬，其存在的問題也日益彰顯［3］。一些研究表明，大量食用甜味劑可能會(huì)對人類產(chǎn)生不良影響，如代謝紊亂、腎功能紊亂，甚至引發(fā)癌癥等疾病［4］。又因?yàn)樘鹞秳┐蠖嘁詮?fù)配形式添加，因此，建立一種同時(shí)檢測食品中多種甜味劑的方法至關(guān)重要。

甜味劑的檢測方法較多，主要有氣相色譜法［5-6］、高效液相色譜法［7-8］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［9-11］。這些傳統(tǒng)方法往往不能很好地分離多種甜味劑，而且檢出限較高，前處理過程復(fù)雜，容易受基質(zhì)干擾出現(xiàn)假陽性的結(jié)果［12］。超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-QTOF-MS）結(jié)合了超高效液相的高分離能力和四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的高分辨功能，它不僅可以提供母離子精確分子質(zhì)量，還可以提供大量多級(jí)碎片離子及其精確分子質(zhì)量信息［13］，憑借其高通量、高分辨率、譜庫檢索、不依靠標(biāo)準(zhǔn)品也可分析等能力［14］，成為食品安全、藥物分析等領(lǐng)域重要分析手段。

本研究選取安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、三氯蔗糖和甜菊糖苷8 種甜味劑作為研究對象，采取直接過濾進(jìn)樣的方式，建立了基于UPLCQTOF-MS檢測市售10 種碳酸飲料和茶飲料中8 種甜味劑的分析方法，并以實(shí)際樣品為代表，對這一新方法進(jìn)行了考察，還就UPLC-QTOF-MS 不依靠標(biāo)準(zhǔn)品就能定性的特點(diǎn)對其他10 種文獻(xiàn)中報(bào)道過的甜味劑進(jìn)行定性分析，為食品安全監(jiān)測提供了新方法和技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色譜儀（美國Agilent公司產(chǎn)品），二元泵（G7120A）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置（G7167B）、柱溫箱（G7116B）；Agilent 6545 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司產(chǎn)品），配有Mass Hunter Data Acquisition 實(shí)時(shí)采集工作站（Version B.06.01 Build 6.01.6172 SP1），Qualitative Analysis離線分析軟件（Version B.07.00 Service Pack2）。Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司產(chǎn)品）。

甲醇、乙腈（色譜純）為德國Merck 公司產(chǎn)品；醋酸銨（色譜純）為美國阿拉丁公司產(chǎn)品。安賽蜜（純度99.8%）為美國CATO 公司產(chǎn)品；甜蜜素（純度99.9%）、糖精鈉（純度85.68%）、阿斯巴甜（純度94.49%）為德國Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品；阿力甜（純度99.4%）、鈕甜（純度95.2%）、甜菊糖苷（純度90.4%）為北京曼哈格BePure公司產(chǎn)品；三氯蔗糖（純度99.6%）為北京壇墨公司產(chǎn)品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相：A為超純水溶液，B為甲醇溶液，梯度洗脫程序0～7 min，5%B升到50%B；7.01～9.00 min，70%B；9.01～12 min，100% B 流速0.4 mL／min；柱溫不控溫；平衡時(shí)間3 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用鞘流雙電噴霧電離源，電噴霧離子源干燥氣采用高純氮，干燥氣溫度和流速分別設(shè)定為300 ℃和10 L／min，霧化氣壓力0.2 MPa，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速10 L／min，碎裂電壓130 V，毛細(xì)管電壓4 kV。一級(jí)質(zhì)譜離子掃描范圍m／z100～1 100，掃描頻率1 張／s譜圖；二級(jí)質(zhì)譜離子掃描范圍m／z50～1 100，掃描頻率2 張／s譜圖，碰撞能量設(shè)為10～40 eV，延遲時(shí)間設(shè)置為1 min。

選擇負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，參比離子質(zhì)荷比（m／z）為1 033.988 1，每天采集數(shù)據(jù)前先使用調(diào)諧液（含125 μmol／L 三氟乙酸銨、5 μmol／L 嘌呤和1.25 μmol／L六甲氧基磷腈溶液，溶劑為乙腈∶水＝95∶5）進(jìn)行質(zhì)量軸的校準(zhǔn)。

1.3 樣品前處理

取50 mL樣品，使用超純水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，最后經(jīng)過0.22 μm尼龍濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相選擇中，首先考慮了甲醇與乙腈作為有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)采用同一個(gè)洗脫梯度，當(dāng)乙腈作為有機(jī)相時(shí)，雖然化合物保留時(shí)間普遍提前，但是安賽蜜、甜蜜素和糖精鈉的峰形較寬且分離度較差，此結(jié)果與文獻(xiàn)［15］一致。因此選擇甲醇作為有機(jī)相。

然后考察了以純水以及水相中添加2 mmol／L 醋酸銨，5 mmol／L醋酸銨，10 mmol／L醋酸銨的水溶液對8 種甜味劑響應(yīng)情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水相加入醋酸銨溶液后色譜峰形普遍提高，但是響應(yīng)強(qiáng)度大大減小，而且緩沖鹽體系容易造成對色譜柱和泵的堵塞［16］，故選擇水相中不添加緩沖鹽。又因安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜等化合物呈堿性，容易與C18柱殘留硅醇基發(fā)生吸附作用造成峰拖尾［17］，所以考慮在水相中添加體積分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸和體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水相中添加甲酸后，弱酸性流動(dòng)相確實(shí)改善了化合物的拖尾現(xiàn)象，但是化合物的響應(yīng)強(qiáng)度大大降低，故最終選擇純水-甲醇作為流動(dòng)相。經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，8 種甜味劑的提取離子流圖如圖1所示。

圖1 8種甜味劑的提取離子流圖（mg／L）

2.1.2 柱溫箱溫度選擇

考察了柱溫箱溫度為20，25，30，35，40 ℃時(shí)，對8種甜味劑響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 種柱溫箱溫度下8 種甜味劑的響應(yīng)強(qiáng)度無明顯差別。一般認(rèn)為提高柱溫雖然可以縮短分析物的分離時(shí)間，但是分析物的分離度可能隨之下降。所以，不特別設(shè)置柱溫箱溫度，柱溫箱溫度接近儀器室室溫，即22 ℃左右。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 一級(jí)質(zhì)譜正負(fù)離子采集范圍的確定

盡管阿斯巴甜、阿力甜、紐甜在正、負(fù)離子模式下都可以得到很好的響應(yīng)，但是糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜在正離子模式下響應(yīng)不好，因此本文選擇使用負(fù)離子電離模式采集數(shù)據(jù)。

2.2.2 一級(jí)質(zhì)譜傳輸區(qū)電壓的確定

比較了傳輸區(qū)電壓為80，100，120，140，160，180 V時(shí)對8 種甜味劑響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物的響應(yīng)強(qiáng)度隨著傳輸區(qū)電壓的升高呈現(xiàn)先增加再降低的情況；紐甜和甜菊糖苷在180 V時(shí)響應(yīng)強(qiáng)度最高，略高于120 V 和140 V 時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度；另外6 種甜味劑在120 和140 V響應(yīng)強(qiáng)度最高。實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步考察了傳輸區(qū)電壓為120，130 和140 V時(shí)8 種甜味劑的響應(yīng)強(qiáng)度，綜合考慮8 種甜味劑的響應(yīng)情況，最終確定將傳輸區(qū)電壓設(shè)置為130 V。

2.2.3 采集二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)提高定性能力

未避免因基質(zhì)復(fù)雜而導(dǎo)致假陽性的情況發(fā)生，在進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描得到8 種甜味劑的精確質(zhì)量數(shù)及保留時(shí)間后，將碰撞能量設(shè)置為10～40 eV，延遲時(shí)間設(shè)置為1 min，得到target MSMS 二級(jí)質(zhì)譜模式下每種甜味劑的二級(jí)質(zhì)譜圖及其特征碎片，見表1。采集二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步提高了定性能力，避免了假陽性樣品情況的發(fā)生。

表1 8 種甜味劑的色譜、質(zhì)譜信息、檢出限和定量限

2.3 線性范圍和檢出限

用純水溶液配制一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，濃度分別為1、2.5、5、10、25、50、100 μg／L，在已優(yōu)化的色譜與質(zhì)譜條件下，以對照溶液的質(zhì)量濃度（X，μg／L）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量。以3 倍儀器檢測信噪比（S／N＝3）計(jì)算各化合物的定性篩查檢出限（LOD），以10 倍信噪比（S／N＝10）計(jì)算定量限（LOQ），見表2。8 種甜味劑在相應(yīng)線性范圍內(nèi)關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 0，檢出限≤1 μg／L，8 種甜味劑的定量限均≤2.5 μg／L。

表2 8 種甜味劑在不同加標(biāo)水平下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差%

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

為考察本方法的準(zhǔn)確性，對實(shí)際樣品中添加低、中、高3 個(gè)濃度水平的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平平行測定6 次，得到不同添加水平下8 種甜味劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，在不同的加標(biāo)水平下，8 種甜味劑的平均回收率在83.9%～111%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.9%，各甜味劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2 所示。

2.5 實(shí)際樣品中安賽蜜等8 種甜味劑定性定量分析

購買市售10 份飲料，其中包括6 種碳酸飲料，分別編號(hào)1?！?＃，以及4 種茶飲料，分別編號(hào)7?！?0＃。樣品經(jīng)過1.3 中步驟進(jìn)行前處理，并根據(jù)優(yōu)化后的測試條件進(jìn)行檢測。通過對該8 種甜味劑提取色譜圖的峰面積進(jìn)行積分，得到每種甜味劑的濃度含量，結(jié)果如表3 所示。該8 種甜味劑檢出的濃度范圍為0.18～291 mg／L。6 種碳酸飲料中檢出5 個(gè)樣品含有該8 種甜味劑，其中1＃，3＃，4＃，5＃和6＃樣品中均含有安賽蜜和三氯蔗糖，其含量有較大差異。1＃樣品中除含有安賽蜜和三氯蔗糖以外還含有阿斯巴甜。所有茶飲料均未檢測出該8 種甜味劑。

表3 實(shí)際樣品檢出8 種甜味劑的含量 mg／L

2.6 實(shí)際樣品中新橙皮甙二氫查爾酮等10 種甜味劑的定性分析

本研究在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合中國食品常見甜味劑的種類，利用新方法對新橙皮甙二氫查爾酮、甜菊雙糖苷、愛德萬甜、甘素、麥芽糖醇、D-山梨糖醇、D-甘露糖、赤鮮糖醇、甘草酸、18β-甘草酸10 種甜味劑進(jìn)行了定性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1＃樣品中含有新橙皮甙二氫查爾酮和麥芽糖醇；3＃和4＃樣品中含有D-甘露糖；5＃、7＃和8＃樣品中含有麥芽糖醇；6＃樣品中含有愛德萬甜。

3 結(jié)語

本文建立了UPLC-QTOF-MS 直接檢測碳酸飲料和茶飲料中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑的方法，并對市售的10 種飲料進(jìn)行了檢測。所測飲料樣品中，5 種碳酸飲料被檢出含有該8 種甜味劑，分別是安賽蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖，茶飲料中均未檢測到該8 種甜味劑。

利用UPLC-QTOF-MS 不依靠標(biāo)準(zhǔn)品也能定性分析的特點(diǎn)對文獻(xiàn)中報(bào)道過的另外10 種甜味劑進(jìn)行了分析，得到了更全面而可靠的結(jié)果。

該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，可為市售碳酸飲料和茶飲料中甜味劑的篩查和檢測提供方法參考。