張 琴，黃世安，林 欣，羅登燦，彭俊森，朱守亮，董曉慶,*

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州省果樹工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省果樹蔬菜工作站，貴州 貴陽 550025）

李（L）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（）植物，是多年生核果類水果，果肉酸甜可口且營養(yǎng)價(jià)值高，富含多種糖、有機(jī)酸、氨基酸、維生素、膳食纖維和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，具有治療疾病、心管疾病、增強(qiáng)免疫、抗氧化等多種生理功能。與其他果實(shí)相比，李果實(shí)中的膳食纖維、酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性均相對較高。

植物初生代謝物包括糖類、氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸等物質(zhì)，是植物生長發(fā)育和繁殖等生命活動必不可少的基礎(chǔ)物質(zhì)和能量來源，主要作用是參與細(xì)胞的能量代謝。糖、有機(jī)酸和氨基酸等初生代謝物含量是評價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。代謝組學(xué)發(fā)展至今，其研究手段更加高效準(zhǔn)確，在環(huán)境科學(xué)、毒理學(xué)研究、食品與營養(yǎng)學(xué)、疾病診斷、植物代謝研究等學(xué)科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Francini等利用代謝組學(xué)對不同品種的蘋果干進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兒茶素、表兒茶素和綠原酸等酚類物質(zhì)是區(qū)別不同品種的重要物質(zhì)，與苦澀味密切相關(guān)。方賢勝等利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)對淺黃色和紫色核桃內(nèi)種皮代謝物進(jìn)行了研究，為核桃內(nèi)種皮中化學(xué)物質(zhì)表征和功能成分研究提供了參考。Wang Dandan等基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對黑芝麻中的營養(yǎng)成分及其在中藥中發(fā)揮作用的相關(guān)代謝物進(jìn)行了鑒定。Zou Shicheng等利用廣泛靶向代謝組學(xué)鑒定了枇杷的關(guān)鍵味覺成分，為枇杷味覺變異的潛在代謝原因提供了新的見解。王夢琪等采用UPLC-MS/MS技術(shù)分析比較了不同香型綠茶非揮發(fā)性成分差異。但是運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析不同品種李果實(shí)初生代謝成分及其差異的研究尚鮮見報(bào)道。

本研究以蜂糖李、空心李和脆紅李果實(shí)為研究材料，采用UPLC-MS/MS技術(shù)，從差異代謝物的角度著手，對3 個李品種果實(shí)的初生代謝物進(jìn)行定性定量分析，揭示其氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸和糖類等物質(zhì)組成及各成分差異，旨在為李果實(shí)中的化學(xué)物質(zhì)表征和功能成分研究提供參考，對提高李產(chǎn)量以及增強(qiáng)果實(shí)品質(zhì)有非常重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以蜂糖李（‘Fengtang’，F(xiàn)TL）、空心李（‘Kongxin’，KXL）、脆紅李（Lindl. c.v‘Cuihong’，CHL）的果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，其中，蜂糖李于2020年6月27日采自貴州省鎮(zhèn)寧縣六馬蜂糖李種植農(nóng)民專業(yè)合作社果園（105.52 E，25.37 N），空心李于2020年7月12日采自貴州省沿河土家族自治縣農(nóng)民專業(yè)合作社果園（108.32 E，28.32 N），脆紅李于2020年8月24采自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所百宜實(shí)驗(yàn)基地（106.59 E，26.48 N）。采后4 h內(nèi)運(yùn)回貴州大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)室，挑選大小、色澤及成熟度一致（8 成熟）、無機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行處理。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；二甲基亞砜 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-100F凍干機(jī) 寧波新芝公司；MM 400研磨儀 德國Retsch公司；Nexera X2超高效液相色譜日本島津公司；4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將蜂糖李、空心李、脆紅李果實(shí)去皮，各3 個生物學(xué)重復(fù)，迅速置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移到－80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。對超低溫冷凍保存? 組供試樣品放置于凍干機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥；研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液提取液中；每30 min渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6 次，置于4 ℃冰箱過夜；12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS分析

利用UPLC-MS/MS聯(lián)用儀對樣本進(jìn)行分析。

UPLC條件：SB-C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.0～9.0 min，95%～5% A、5%～95% B，維持1 min；10.0～11.10 min，5%～95% A、95%～5% B，并平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 °C；進(jìn)樣量4 μL。

MS條件：電噴霧離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V；離子源氣體I、氣體II和簾氣分別設(shè)置為50、60、25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。三重四極桿掃描使用多反應(yīng)檢測模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。在三重四極桿中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測。

1.3.3 質(zhì)控（quality control，QC）樣本

QC樣本是由所有樣本提取物等量混合制備而成（mix），3 個重復(fù)。在每10 個檢測分析樣本中插入一個QC樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于邁維（武漢）生物技術(shù)有限公司自建MWDB數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，通過三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式對代謝物定量。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析對代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）預(yù)測模型的穩(wěn)定可靠性，同時利用多維統(tǒng)計(jì)變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值、單維統(tǒng)計(jì)值及差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）篩選差異代謝物。對差異顯著的代謝物進(jìn)行歸一化處理，通過R軟件中的pheatmap程序?qū)Ψ涮抢睢⒖招睦詈痛嗉t李的差異代謝物進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對相應(yīng)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 個李品種果實(shí)初生代謝物總體分析

如圖1所示，QC樣品總離子流圖的基線穩(wěn)定，其重復(fù)性好，峰分離度高。

圖1 QC樣品總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of quality control samples

表1 3 個李品種果實(shí)的初生代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of primary metabolites in three varieties of plum

在3 個李品種果實(shí)中，共檢測到12 類307 種初生代謝物，如表1所示，包括74 種氨基酸及其衍生物、55 種有機(jī)酸、41 種核苷酸及其衍生物、40 種游離脂肪酸、35 種糖類、20 種溶血磷脂酰膽堿、12 種維生素、12 種醇類、10 種溶血磷脂酰乙醇胺、6 種甘油酯、1 種磷脂酰膽堿及1 種鞘脂。3 個李品種果實(shí)檢測到的共有代謝物290 種，有17 種代謝物未在3 個品種中都檢測到，分別是6 種有機(jī)酸（磷酸二乙酯、2-羥基丁酸、2-羥基肉桂酸*、乙基丙二酸、珀酸單甲酯、2-呋喃甲酸），4 種核苷酸及其衍生物（2-氨基嘌呤、環(huán)-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、2’-脫氧鳥苷、次黃嘌呤），3 種氨基酸及其衍生物（-甲基甘氨酸、-乙酰--亮氨酸、-苯乙酰甘氨酸），2 種溶血磷脂酰膽堿（溶血磷脂酰膽堿15:1、溶血磷脂酰膽堿16:2），1 種糖類（松三糖--鼠李糖苷）和1 種維生素（抗壞血酸（VC））。其中，在空心李中檢測到了特有的代謝物質(zhì)環(huán)-3’,5’-腺嘌呤核苷酸，脆紅李中檢測到了溶血磷脂酰膽堿16:2，這2 種物質(zhì)在蜂糖李果實(shí)內(nèi)并沒有檢測到。表明不同品種李果實(shí)的初生代謝物存在差異。

空心李特有代謝物質(zhì)環(huán)-3’,5’-腺嘌呤核苷酸可以作為其特征成分，是一類環(huán)狀核苷酸，在植物細(xì)胞分化和分裂的過程中起著重要的調(diào)控作用。脆紅李特有代謝成分溶血磷脂酰膽堿16:2，是溶血磷脂酰膽堿的一種，廣泛存在于人體細(xì)胞內(nèi)外的一類具有多種生理功能的生物活性信號分子。其含量變化與疾病類型、疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，在臨床病理研究、疾病診斷及預(yù)防等方面發(fā)揮著重要作用。

2.2 PCA結(jié)果

圖2 3 組樣品PCA得分圖（A）和相關(guān)性圖（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and correlation heatmap (B) of three sets of samples and quality control

對蜂糖李、空心李、脆紅李進(jìn)行PCA，了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣品之間的變異度大小。如圖2所示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為33.84%和24.88%，各組之間代謝物分離趨勢明顯，表明蜂糖李、空心李和脆紅李在代謝水平上有較大的差異。且各樣品及mix組內(nèi)的Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.9，說明組內(nèi)的重復(fù)樣本相關(guān)性極強(qiáng)、重復(fù)性好，可以用于后續(xù)差異代謝物分析。

2.3 OPLS-DA結(jié)果

圖3 3 個比較組OPLS-DA得分圖和驗(yàn)證圖Fig. 3 OPLS-DA score plot and permutation test plot

2.4 差異代謝物篩選與鑒定

基于OPLS-DA結(jié)果，以VIP≥1、FC≥2和FC≤0.5篩選出不同比較組的差異代謝物。通過火山圖可以清晰看出代謝物在各比較組中數(shù)目及變化情況，如圖4所示，F(xiàn)TL_vs_CHL篩選到的差異代謝物有70 種（上調(diào)43 種、下調(diào)27 種），F(xiàn)TL_vs_KXL和KXL_vs_CHL分別篩選到96 種（上調(diào)84 種、下調(diào)12 種）和75 種（上調(diào)19 種、下調(diào)56 種）。

圖4 3 個比較組差異代謝物火山圖Fig. 4 Volcano map of differential metabolites among three varieties

2.4.1 蜂糖李與脆紅李差異代謝物分析

表2 FTL_vs_CHL果實(shí)中差異代謝物Table 2 Differential metabolites in Fengtang_vs_Cuihong

由表2得知，F(xiàn)TL_vs_CHL之間篩選到9 類70 種差異代謝物，包括26 種氨基酸及其衍生物（19種上調(diào)、7 種下調(diào)），16 種有機(jī)酸（7 種上調(diào)、9 種下調(diào)），8 種核苷酸及其衍生物（4 種上調(diào)、4 種下調(diào)），6 種糖類（2 種上調(diào)、4 種下調(diào)），4 種溶血磷脂酰膽堿上調(diào)，4 種維生素（1 種上調(diào)，3 種下調(diào)），3 種游離脂肪酸上調(diào)，2 種溶血磷脂酰乙醇胺上調(diào)，1 種甘油酯上調(diào)。結(jié)果表明：與蜂糖李相比，脆紅李中上調(diào)的物質(zhì)多于下調(diào)物質(zhì)，有多種氨基酸及其衍生物上調(diào)表達(dá)且相對含量增加，其次是溶血磷脂酰膽堿和游離脂肪酸。其中纈氨酸可以根據(jù)其構(gòu)象分為-纈氨酸和-纈氨酸，是人體必需氨基酸之一，通常以-纈氨酸的形式在人體中存在。有研究表明-纈氨酸參與多種生理反應(yīng)，影響炎癥和腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸。維生素中僅有吡哆醛上調(diào)表達(dá)，為VB的組成成分，而吡哆醛激酶是VB代謝的關(guān)鍵酶。相較于蜂糖李，脆紅李有多種有機(jī)酸和糖類物質(zhì)表達(dá)下調(diào)且相對含量降低，可能是脆紅李果實(shí)口味酸甜適中的原因之一。

2.4.2 蜂糖李與空心李差異代謝物分析

表3 FTL_vs_KXL果實(shí)中差異代謝物Table 3 Differential metabolites in Fengtang_vs_Kongxin

如表3所示，F(xiàn)TL_vs_KXL篩選出差異代謝物共10 類96 種，包括21 種有機(jī)酸、18 種核苷酸及其衍生物、17 種氨基酸及其衍生物、13 種溶血磷脂酰膽堿、9 溶血磷脂酰乙醇胺、5 種維生素、5 種糖類、4 種醇類、3 種游離脂肪酸、1 種甘油酯。其中上調(diào)物質(zhì)有84 種，占87.50%；下調(diào)物質(zhì)12 種，占12.50%。說明與蜂糖李相比，空心李中絕大多數(shù)代謝物質(zhì)相對含量增加，少數(shù)降低。糖酸含量及其配比是果實(shí)風(fēng)味形成的關(guān)鍵，其中糖含量在很大程度上決定了果實(shí)的甜度，有機(jī)酸含量決定了果實(shí)酸度。有機(jī)酸在空心李果實(shí)中上調(diào)且相對含量增加，相反在蜂糖李中下調(diào)且相對含量降低，表明了蜂糖李的酸度要低于空心李。這與李剛鳳等的研究空心李酸（2.06%～3.90%），董曉慶等的研究蜂糖李的酸（0.15%～0.32%）結(jié)論相致。蜂糖李果實(shí)有機(jī)酸含量低但含有較高的糖類（如-果糖、-葡萄糖、甘露糖、-蔗糖*、葡萄糖酸葡萄糖-1-磷酸*等），具有低酸高糖的特點(diǎn)，所以造就成其獨(dú)特的風(fēng)味因而具有較高的商品價(jià)值?？招睦罟麑?shí)中氨基酸及其衍生物上調(diào)12 種，其含量高于蜂糖李，這與李剛鳳等研究結(jié)果相一致。

2.4.3 空心李與脆紅李差異代謝物分析

表4 KXL_vs_CHL果實(shí)中差異代謝物Table 4 Differential metabolites in Kongxin_vs_Cuihong

由表4可知，在KXL_vs_CHL比較組篩選到差異代謝物10 類75 種，包括核苷酸及其衍生物19 種、氨基酸及其衍生物17 種、有機(jī)酸14 種、血磷脂酰膽堿7 種、維生素7 種、糖類4 種、醇類4 種、溶血磷脂酰乙醇胺1 種、游離脂肪酸1 種、甘油酯1 種。結(jié)果顯示上調(diào)表達(dá)19 種，下調(diào)表達(dá)56 種，其中差異較大的是核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸3 種類別，分別占比25.33%、22.67%和18.67%。與空心李相比，核苷酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，有機(jī)酸等這類物質(zhì)在脆紅李中下調(diào)表達(dá)，在空心李中上調(diào)表達(dá)。在KXL_vs_CHL的19 種核苷酸及其衍生物中，只有2 種上調(diào)，其他均下調(diào)。其中腺苷、鳥苷、腺苷-5’-單磷酸等相對含量較高。氨基酸及其衍生物下調(diào)10 種，上調(diào)7 種。氨基酸類物質(zhì)的種類和含量是判斷果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)之一，與果實(shí)的營養(yǎng)及風(fēng)味形成密切相關(guān)。張紹陽等對空心李果實(shí)營養(yǎng)進(jìn)行分析，檢測出的15 種氨基酸中天冬氨酸含量最高，其次為丙氨酸、谷氨酸與賴氨酸，組氨酸最少，本研究結(jié)果與此一致。其中谷氨酸與天冬氨酸是鮮味氨基，甘氨酸、丙氨酸等為甜味氨基。此外谷氨酸還是腦組織生長代謝中的重要物質(zhì)，參與多種生理活性物質(zhì)的合成，在大腦、肌肉、肝臟等組織中發(fā)揮重要的解毒作用，還可保護(hù)肝臟。

2.5 差異代謝物通路分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，通過對差異代謝物進(jìn)行通路富集分析有助于理解差異代謝物在代謝途徑的變化機(jī)制。如圖5A所示，F(xiàn)TL_vs_CHL的70 種差異代謝物共注釋到57 條代謝通路，主要分布在20 條代謝途徑中，前5 條富集代謝物數(shù)量多且顯著差異的代謝通路（＜0.05）分別為代謝通路、氨酰-tRNA生物合成通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路和賴氨酸降解通路，富集到的差異代謝物主要為氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物。其中有6 種氨基酸及其衍生物、2 種有機(jī)酸參與了多個代謝途徑。在顯著差異的5 條代謝通路中硫代葡萄糖苷的生物合成途徑最為顯著（值最?。?，參與硫代葡萄糖苷的生物合成通路有6 個差異代謝物，分別是-纈氨酸、-異亮氨酸*、-亮氨酸*、-甲硫氨酸、-酪氨酸、-色氨酸。其中-色氨酸是營養(yǎng)中重要的氨基酸，人體內(nèi)自身不能合成需要從外界攝取，-酪氨酸是多種重要的次級代謝物的通用前體，可以用作帕金森氏病藥物左旋多巴的合成。

FTL_vs_KXL的96 種差異代謝物共注釋到53 條代謝通路，如圖5B所示，前5 條代謝通路富集差異代謝物數(shù)多且較顯著的為代謝通路、嘌呤代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路和色氨酸代謝通路，富集到的差異代謝物主要包括核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、氨基酸及其衍生物和維生素。其中有12 種核苷酸及其衍生物、6 種有機(jī)酸和4 種氨基酸及其衍生物參與多個代謝途徑。顯著差異通路有1 條為色氨酸代謝通路（＜0.05）。參與色氨酸代謝通路的有3 個差異代謝物，分別是-色氨酸、5-羥基--色氨酸、2-吡啶甲酸。其中2-吡啶甲酸是一種重要的吡啶類化合物，廣泛用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、以及日用化學(xué)品的生產(chǎn)。

KXL_vs_CHL的75 種差異代謝物注釋到52 條代謝通路，如圖5C所示，前5 條代謝通路富集差異代謝物數(shù)量多且顯著的為代謝通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、2-氧羧酸代謝通路、嘌呤代謝通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路，富集到的差異代謝物主要包括核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、維生素、氨基酸及其衍生物。其中有10 種核苷酸及其衍生物、1 種有機(jī)酸，1 種維生素及5 種氨基酸及其衍生物參與了多個代謝途徑。顯著差異通路2 條（＜0.05）：嘌呤代謝通路和硫代葡萄糖苷的生物合成通路，其中嘌呤代謝通路最為顯著（值最?。?，參與嘌呤代謝通路有10 個差異代謝物，分別是次黃嘌呤、鳥嘌呤、2’-脫氧腺苷、腺苷、2’-脫氧鳥苷、鳥苷、環(huán)-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、腺苷-5’-單磷酸、5’-肌苷酸、鳥苷-5’-單磷酸，都為核苷酸及其衍生物，其中嘌呤是一種生物堿，主要以嘌呤核苷酸的形式存在，可分為鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤等，廣泛參與人體的各種生命活動。

以上分析表明，3 組比較組之間有多條代謝通路一致，部分代謝物參與多個代謝途徑。

圖5 3 個比較組差異代謝物KEGG富集圖Fig. 5 KEGG enrichment map of different metabolites among three varieties

3 結(jié) 論

3 個李品種果實(shí)共檢測出12 類307 種初生代謝物，F(xiàn)TL_vs_CHL和FTL_vs_KXL的差異代謝物分別為70 種和96 種，且主要以上調(diào)為主；KXL_vs_CHL的差異代謝物有75 種，以下調(diào)為主。值小于0.05的顯著差異代謝途徑FTL_vs_CHL有5 條，分別為代謝通路、氨基酰-tRNA生物合成通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路和賴氨酸降解通路，F(xiàn)TL_vs_KXL僅有1 條色氨酸代謝通路，KXL_vs_CHL有2 條分別是嘌呤代謝通路和硫代葡萄糖苷的生物合成通路。

本研究成功鑒定出空心李（環(huán)-3’,5’-腺嘌呤核苷酸）和脆紅李（溶血磷脂酰膽堿16:2）的特征成分。利用UPLC-MS/MS技術(shù)對蜂糖李、空心李和脆紅李的初生代謝物進(jìn)行分析，所檢測到的物質(zhì)可為李果實(shí)的功能研究及下一步開發(fā)利用提供參考，也為李果實(shí)優(yōu)良品種選育和功能保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)，具有廣闊的開發(fā)利用前景。