練志峰，滿華盛，修麗麗，黃建穎，董麗娟

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310018）

碳量子點（carbon quantum dots，CDs）是一類新型熒光材料，具有多種優(yōu)良性質(zhì)，如較好的溶解性、熒光性能、低毒性和優(yōu)異的生物相容性，在不同領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來，對于CDs的應(yīng)用，已經(jīng)有報道在熒光傳感器、生物細胞和納米醫(yī)學等方面。不同的CDs因其制備的原料不同，在表面會形成不同的官能團，如氨基、羥基、巰基和羧基等，從而賦予其不同的特性。

西藍花（L. var.Planch.），作為常見的食材因其營養(yǎng)豐富、全面，被稱之為蔬菜皇冠，且被廣泛食用，而西藍花的莖葉作為農(nóng)業(yè)廢棄物會造成環(huán)境污染和經(jīng)濟損失。但是西藍花莖葉儲量十分巨大，且并不是無法利用。對于西蘭花制備CDs的研究，國內(nèi)鮮見報道，而國外的Arumugam等以西蘭花為原料，采用一步水熱法合成了CDs，使其具有光致發(fā)光特性，以及對銀離子較強的熒光猝滅選擇性。另一方面，有機磷農(nóng)藥（organophosphorus pesticide，OPs）目前逐漸替代有機氯農(nóng)藥被廣泛使用。但是，過度使用的同時也造成了環(huán)境污染，最終威脅到人們健康和安全。目前普遍使用的檢測方法如色譜法、光譜法需要大型儀器且費時。而酶抑制法具有低檢出限以及方便的特點，如Kumar等研制了一種固定化銀納米粒子（AgNPs）的酶介導(dǎo)生物傳感器，用于檢測有機磷OPs。該方法是基于馬拉硫磷或敵百蟲對酶的抑制作用，在固定化過程中阻止硫膽堿的生成從而使AgNPs的量上升。在添加OPs的過程中測定了酶活性的效率，且AgNPs的增加依賴于OPs的濃度，且能夠通過紫外-可見光譜法在420 nm處分別對馬拉硫磷和敵百蟲進行檢測，檢出限低至0.455 nmol/L和5.46 nmol/L。此外，該檢測方法也成功地應(yīng)用于實際樣品中OPs的檢測。

因此，為了保障食品和人們的公共健康安全，對OPs進行可靠、靈敏的定量分析十分重要。本實驗在制備了基于西藍花廢棄物的碳點后，進一步構(gòu)建了氧化還原型CDs/Fe酶抑制體系，用于檢測OPs的含量，并應(yīng)用于實際生活中的農(nóng)產(chǎn)品OPs殘留檢測，為將來綠色、快速、實時高效的熒光探針應(yīng)用提供理論依據(jù)。在實現(xiàn)對農(nóng)藥檢測的同時也很好地利用西藍花莖葉這一廢棄的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西藍花莖葉、蘋果、芹菜 市購；濃硫酸、硫酸亞鐵、30%雙氧水、硫酸奎寧、正丁醇、三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；98%的乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶 美國Sigma-Aldrich公司；敵敵畏 上海泰坦科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

榨汁機 中國九陽股份有限公司；2-16KL高速冷凍離心機 德國西格瑪公司；－80 ℃超低溫冰箱 上海汗諾儀器有限公司；QXR1200-50馬弗爐 合肥科晶材料技術(shù)有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；Smart系列純水/超純水儀 默克密理博實驗室設(shè)備（上海）有限公司；EL 204-IC電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；Labconco FreeZone立式冷凍干燥機 美國Labconco公司；UV-2600紫外-可見分光光度計、RF-5301 PC熒光分光光度計、AXIS Supra X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀 日本Shimadzu公司；Empyrean型X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 荷蘭帕納科公司；RCT型加熱磁力攪拌器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 西藍花CDs的制備

準確稱取10.0 g西藍花葉和莖，將其加入100 mL純水中。經(jīng)果汁機榨汁后，全部轉(zhuǎn)移放入聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓不銹鋼反應(yīng)釜中，在200 ℃條件下持續(xù)水熱反應(yīng)8 h。冷卻后，離心，取黃色上清液。經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾得到粗產(chǎn)品。此粗產(chǎn)品利用透析袋（截留分子質(zhì)量100～500 Da）透析，冷凍干燥后得到棕色的CDs 0.8 g。

1.3.2 CDs的表征

1.3.2.1 粒度測定

采用Zetasizer Nano ZS激光粒度儀對CDs溶于水后的粒徑進行測定。

1.3.2.2 XRD測定

采用Empyrean XRD儀對西藍花莖葉粉以及CDs粉進行XRD表征。

1.3.2.3 XPS測定

采用AXIS Supra XPS儀對CDs進行XPS表征。

1.3.2.4 紫外吸收光譜

使用紫外-可見分光光度計測定CDs溶液的紫外吸收光譜，掃描波長范圍為200～800 nm，每個樣品做3 次平行測定。

1.3.2.5 熒光發(fā)射光譜

使用熒光分光光度計測定多個濃度的CDs溶液的熒光發(fā)射光譜，得出最佳的熒光濃度后，確定激發(fā)波長范圍為290～380 nm，掃描波長范圍為220～900 nm，狹縫寬度為3.0 nm，每個樣品做3 次平行測定。

1.3.2.6 熒光量子產(chǎn)率

選擇量子產(chǎn)率為0.54的硫酸奎寧作為標準物質(zhì)分散于0.1 mol/mL的硫酸溶液中，進行CDs熒光量子產(chǎn)率的測定。分別測出CDs溶液和硫酸奎寧相對應(yīng)的吸光度并選擇相同的激發(fā)波長（360 nm）以此計算相應(yīng)的發(fā)射峰面積，根據(jù)下式計算量子產(chǎn)率：

式中：為熒光量子產(chǎn)率；為熒光積分面積；為溶劑折射率，水的折射率為1.33，0.1 mol/L硫酸的折射率為1.33；為對應(yīng)的吸光度；下標s表示硫酸奎寧，CDs表示CDs溶液。

1.3.3 酶抑制法熒光檢測OPs

將制備得到的CDs與Fe混合得到能對HO有良好線性關(guān)系的熒光探針，其中CDs質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，F(xiàn)e濃度為5 mmol/mL。利用熒光探針進行OPs的檢測與標準曲線的繪制，將1.0 mL乙酰膽堿酯酶（0.5 U/mL，Tris-HCl，pH 7.0）分別添加到2.5 mL不同質(zhì)量濃度（1.0、0.75、0.50、0.30、0.10、0.075、0.05、0.03、0.01、0 μg/mL）的敵敵畏溶液中。將所有混合物在37 ℃輕輕攪拌10 min，然后添加0.5 mL乙酰膽堿（0.01 mmol/mL）和1.0 mL 0.25 U/mL膽堿氧化酶。在37 ℃的避光條件中進一步攪拌20 min后，將5.0 mL含有CDs（2.5 mL，1 mg/mL）和Fe（2.5 mL，20 mmol/L）的混合溶液添加到每個反應(yīng)物上。然后將溶液完全混合，然后在室溫下用熒光分光光度計記錄360 nm激發(fā)光下的熒光發(fā)射光譜，再設(shè)置兩組對照組作為比較，以敵敵畏質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標，熒光相對強度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 酶抑制法對實際食品樣品中OPs的熒光分析

參考Lin Bixia等方法，選取新鮮蘋果與芹菜為樣品，稱取樣品的表皮或莖葉2.0 g，置于離心管中并加入10 mL純水，然后4 ℃、5 000 r/min離心30 min，取上清液用0.22 μm孔（微孔）聚醚砜濾膜過濾待測。然后在試管中加入的乙酰膽堿酯酶（0.5 U/mL）1.0 mL，酶均用Tris-HCl（pH 7）緩沖溶液溶解，再加入待測液2.5 mL，將此混合溶液置于37 ℃水浴中，攪拌反應(yīng)10 min后，分別依次加入0.01 mmol/mL的氯化乙酰膽堿0.5 mL以及膽堿氧化酶（0.25 U/mL）1.0 mL，于37 ℃條件下水浴，避光攪拌反應(yīng)20 min。隨后分別加入探針溶液5.0 mL（2.5 mL的1 mg/mL CDs和2.5 mL的20 mmol/L Fe溶液），混合均勻，控制10 mL的混合溶液中CDs質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，F(xiàn)e濃度為5 mmol/L。利用熒光分光光度計，對混合溶液進行熒光檢測，設(shè)置激發(fā)波長為360 nm，根據(jù)熒光強度以及對照標準曲線推算OPs的存在量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗重復(fù)3 次平行實驗，數(shù)據(jù)分析軟件選擇Excel 2010，繪圖選擇Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDs的粒徑和量子產(chǎn)率

將得到的CDs進行透析處理之后，測得CDs的平均粒徑為30 nm左右。熒光量子產(chǎn)率是光化學反應(yīng)中光量子利用率，影響反應(yīng)物利用情況與熒光發(fā)光效果。根據(jù)1.3.2.6節(jié)公式計算可以得出所制備CDs的量子產(chǎn)率約為9.53%。

2.2 XRD分析

通過對材料進行X射線處理，在經(jīng)分析其衍射圖譜后，可以獲得材料對應(yīng)的成分與分子的結(jié)構(gòu)和形態(tài)等相關(guān)信息。CDs和凍干粉的XRD圖譜如圖1所示，在2＝28°處出現(xiàn)一個尖峰，其產(chǎn)生源于典型的石墨結(jié)構(gòu)，同時對應(yīng)層間距為0.34 nm，表明西藍花莖葉水熱處理后形成了有序的sp碳層（C＝C）。參考相關(guān)文獻，2＝32°處的尖峰可歸因于石墨層，這能夠進一步表明CDs具有較高程度的石墨化。在36°較和42°較處的峰值與半結(jié)晶或無定形碳納米顆粒有關(guān)，這與相關(guān)的報道有所不同，同時，與西藍花在2＝23°處出現(xiàn)的非晶態(tài)寬峰不同，CDs在2＝25°寬處觀察到一個產(chǎn)生了位移的非晶態(tài)寬峰，更證明了其結(jié)構(gòu)的改變。

圖1 西藍花凍干粉和CDs的XRD圖Fig. 1 XRD patterns of lyophilized broccoli powder and CDs

2.3 XPS分析

圖2 CDs的XPS測量光譜（A）以及高分辨譜C1s（B）、N1s（C）和O1s（D）Fig. 2 XPS spectra of CDs (A) and high resolution spectra C1s (B),N1s (C) and O1s (D)

XPS研究CDs的表面元素組成以及其化學狀態(tài)，進一步確定了CDs的組成和價態(tài)。制備得到的CDs中O1s、N1s、C1s、Si2s和Si2p的結(jié)合能分別為531.7、399.7、284.7、165.5、151.0 eV和101.0 eV。同時可以觀察到CDs在165.5 eV處，有相對較為微弱S2p光譜（圖2A），根據(jù)文獻可推測硫原子已摻雜到了碳原子中。如CDs的高分辨率XPS光譜（圖2B～D）所示。制備的CDs的C1s光譜中，在284.6、285.9、287.7 eV和288.5 eV處觀察到4 個峰值，結(jié)合能分別對應(yīng)C—C/C＝C、C—N/C＝O、C—S和O—C＝O。在531.6 eV和532.8 eV處的O1s峰，分別為C＝O和C—OH/C—O—C的特征氧態(tài)。在151 eV和101 eV處的峰值推測歸因于Si元素，從而證明了CDs和西藍花中存在Si元素。另外，中心位于399.6 eV和400.1 eV的兩個不同的N1s峰，根據(jù)文獻[19]推測對應(yīng)于類吡咯氮和類石墨氨基氮。這些實驗數(shù)據(jù)進一步表明，由西藍花莖葉制備的CDs具有石墨性質(zhì)的碳核和豐富的官能團。

2.4 紫外吸收光譜分析

制備的CDs溶液（0.25 mg/mL）紫外-可見光吸收光譜如圖3所示。CDs溶液在275 nm處出現(xiàn)了一個較寬的吸附峰，其產(chǎn)生的原因為石墨結(jié)構(gòu)的存在以及電子的π→π*和n→π*躍遷。同時測定了CDs溶液在普通日光燈和紫外光（360 nm）處的顯色情況發(fā)現(xiàn)分別為淺黃色且透明（插圖a），和明亮的藍色（插圖b），表明CDs表面存在良好的熒光性能的位點。

圖3 0.1 mg/mL CDs溶液的紫外吸收光譜Fig. 3 UV-vis absorption spectrum of 0.1 mg/mL CDs in aqueous solution

2.5 熒光發(fā)射圖譜分析

不同質(zhì)量濃度CDs溶液在360 nm激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜有所不同。過大或過小的CDs質(zhì)量濃度均會導(dǎo)致熒光發(fā)射強度的降低，推測是由于CDs本身的熒光性質(zhì)所引起的。同時也確定了CDs有相對較好熒光效果時的質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。

CDs溶液（0.25 mg/mL）在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜和光學圖像如圖4所示。由圖4A可看出，當激發(fā)波長在300～360 nm時，樣品溶液的熒光最大發(fā)射強度有明顯的增強，在激發(fā)波長為360 nm時，440 nm發(fā)射波長處的熒光達到最大。由于CDs具有較為均勻的尺寸，發(fā)射波長的紅移相對較小。當激發(fā)波長從360 nm增加到380 nm時，發(fā)射波長出現(xiàn)紅移并且伴隨著熒光發(fā)射強度的減弱，證明了制備所得的CDs具有明顯的波長可調(diào)能力。同時樣品溶液在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜表明其擁有多色發(fā)射的特性，這種激發(fā)依賴現(xiàn)象推測是因為CDs在水熱碳化反應(yīng)中，表面形成了羧基和氨基等官能團從而充當了激發(fā)能阱而引發(fā)不同的光致發(fā)光特性。另外，如圖4B所示，不同激發(fā)波長下的光學圖像證明了CDs的多色發(fā)光特性，同時發(fā)現(xiàn)CDs的顏色范圍較之前的報道寬，發(fā)射顏色從藍色、綠色、黃色到紅色，最后再回歸藍色，由此推測其能夠用于多色成像，熒光油墨等。

圖4 在不同激發(fā)波長下CDs的熒光發(fā)射圖譜（A）以及光學圖（B）Fig. 4 Fluorescence emission spectra (A) and optical spectra (B) of CDs at different excitation wavelengths

2.6 酶抑制法熒光檢測OPs

Fe對CDs的熒光有猝滅作用，OPs對乙酰膽堿酯酶活性有抑制作用，從而減少膽堿被酶解產(chǎn)生的HO量。當以敵敵畏為代表的OPs存在的情況下，酶活性被抑制，HO產(chǎn)生量會減少，溶液中Fe濃度相較于不加OPs的溶液低，CDs熒光就會增強，根據(jù)不同質(zhì)量濃度梯度的敵敵畏繪制標準曲線，從而進一步應(yīng)用于實際農(nóng)產(chǎn)品的敵敵畏殘留檢測。

圖5顯示了CDs/Fe熒光探針，對酶液添加不同質(zhì)量濃度敵敵畏的熒光響應(yīng)情況。如圖5A、B所示，在敵敵畏質(zhì)量濃度為0 μg/mL時，混合反應(yīng)液產(chǎn)生的HO將Fe氧化成Fe，導(dǎo)致CDs熒光被猝滅，而在敵敵畏存在的情況下，敵敵畏通過不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶的催化活性，影響膽堿的形成，并進一步抑制過氧化氫的生成，使體系熒光降低程度逐漸減小甚至不降低。另外可以發(fā)現(xiàn)，即使敵敵畏質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL，熒光也發(fā)生了輕微改變，證明熒光探針對體系中存在的敵敵畏十分敏感。當敵敵畏質(zhì)量濃度高達1 mg/mL時，熒光對比無HO體系也有輕微的下降，證明體系中存在微量HO，表明此敵敵畏質(zhì)量濃度下的酶并非完全失活。根據(jù)實驗結(jié)果，當體系中Fe最終濃度為5 mmol/mL，CDs最終質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時，敵敵畏質(zhì)量濃度對數(shù)的熒光強度比與CDs質(zhì)量濃度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系（＝0.991 7），回歸方程為/＝1.317 3＋0.149 4lg，其中，和分別為CDs/Fe體系中敵敵畏不存在和存在下的熒光強度。由此可見，體系的熒光強度具有質(zhì)量濃度依賴性，根據(jù)公式3/（其中為標準偏差，為線性回歸方程的斜率），預(yù)估敵敵畏的檢出限為8 ng/mL。根據(jù)公式10/，預(yù)估敵敵畏的定量限為26.7 ng/mL。所以CDs/Fe熒光探針能夠很好地用于檢測敵敵畏的質(zhì)量濃度，可以為生活中的食品樣品的OPs檢測提供一種快速、綠色、簡便的新方法。

圖5 不同質(zhì)量濃度敵敵畏對檢測系統(tǒng)中C點熒光的影響（A、B）及C點熒光強度比與敵敵畏質(zhì)量濃度對數(shù)的線性關(guān)系（C）Fig. 5 Effect of dichlorvos at different concentrations on the fluorescence of C-dots in detection system (A, B) and linear relationship between the fluorescence intensity ratio of C-dots and the logarithm of dichlorvos concentration (C)

2.7 酶抑制法檢測實際食品樣品中的OPs

根據(jù)以上的優(yōu)化與探究實驗，建立了CDs/Fe熒光探針檢測敵敵畏的酶抑制法檢測體系，并將其應(yīng)用于蘋果和芹菜中敵敵畏的測定。通過標準加入回收法對這兩種易殘留農(nóng)藥的樣品，進行測試以評估該方法的準確性。每種樣品設(shè)置3 個不同的加標量，每個加標樣品平行測試3 次，結(jié)果如表1所示。兩種食品樣品中均未檢測出敵敵畏農(nóng)藥的存在，說明超市中銷售的商品較為安全。兩種加標食品樣品中敵敵畏回收率在90%～97%之間，相對標準偏差不高于1.0%（=3），表明該方法對實際樣品中以敵敵畏為代表的OPs的檢測，具有良好的準確度和精密度，可以考慮未來將該CDs/Fe熒光傳感器應(yīng)用于生物和食品領(lǐng)域中OPs的檢測。

表1 商業(yè)水果蔬菜中敵敵畏的檢測以及回收率Table 1 Recoveries of dichlorvos in spiked commercial fruits and vegetables

3 討 論

以西藍花莖葉作為前體，經(jīng)過水熱處理后制得了量子產(chǎn)率約為9.53%的新型氮、硫、硅摻雜CDs，并具備良好的水溶性和光致發(fā)光性。實驗采用動態(tài)光散射儀，測得其粒徑約為30 nm。后續(xù)利用采用XRD、XPS等對其進行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)表征以及相關(guān)元素分析，證明制備的CDs為新型氮、硫、硅摻雜CDs并產(chǎn)生了一定的石墨烯特征，且表面存在許多功能性的官能團，這些官能團中包含了氧、氮、硫和硅等元素，使得CDs同時具備良好的水溶解性和熒光性能。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)e可以猝滅新型氮摻雜CDs的熒光，而同等濃度Fe對其影響不大，由此推斷，HO將Fe氧化為Fe，F(xiàn)e與CDs產(chǎn)生配位，同時它可以轉(zhuǎn)移到Fe的空d軌道，從而導(dǎo)致混合溶液的熒光猝滅，這是一個靜態(tài)猝滅過程，與前人的報道一致。然后依據(jù)酶抑制反應(yīng)原理，構(gòu)建了酶抑制反應(yīng)體系，優(yōu)化Fe在實驗中的濃度，將所制備的熒光傳感器利用酶抑制法熒光檢測了敵敵畏，研究了CDs/Fe的熒光強度在混合酶液之后與敵敵畏質(zhì)量濃度間的定量關(guān)系，結(jié)果表明敵敵畏質(zhì)量濃度對數(shù)與CDs的熒光強度呈良好的線性關(guān)系（=0.991 7），回歸方程為/=1.317 3＋0.149 4lg，且敵敵畏的檢出限約為8 ng/mL，對比同類文獻檢出限更低，方法更快捷簡便，更有優(yōu)勢。由此得出CDs/Fe/乙酰膽堿酯酶熒光探針能夠很好地用于檢測OPs的濃度，后續(xù)可以為實際食品樣品的OPs殘留檢測提供一種快速、綠色、簡便的新方法。然而，當前Ops農(nóng)藥品種較多，對于其他OPs檢測仍需要進一步的研究。其次需要提高反應(yīng)前體利用率，開發(fā)熒光量子產(chǎn)率較高的CDs，也需要進一步增加CDs在檢測方面的穩(wěn)定性與靈敏度。

4 結(jié) 論

以原料豐富的西藍花莖葉作為反應(yīng)前體，通過溫和的水熱處理制備得一種新型氮、硫、硅摻雜CDs，并利用Fe和HO之間的氧化反應(yīng)構(gòu)建了可用于分析HO的熒光傳感器，以及可定量檢測低濃度下的HO，具有易于操作、安全環(huán)保、線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高和響應(yīng)速度快等優(yōu)點，在食品和生物系統(tǒng)中具有巨大的應(yīng)用潛力，并進一步利用該關(guān)系構(gòu)建了可分析OPs的熒光探針，并已成功將其應(yīng)用于食品樣本中以敵敵畏為代表的OPs的檢測，結(jié)果也比較理想，為其后續(xù)應(yīng)用于實際的生產(chǎn)提供了一定理論基礎(chǔ)。