聶士昊，張志偉，汪俊卿，王瑞明，張子洋，申作樹，王龍祥，李丕武

（1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250300；2.山東福瑞王酒業(yè)有限公司，山東 臨沂 276600）

醬香型白酒在我國已有上千年歷史，因其香味獨(dú)特、應(yīng)用廣泛、獨(dú)具魅力而受到大眾喜愛，同時(shí)其產(chǎn)香機(jī)理及風(fēng)味成分復(fù)雜，使得眾多研究者致力于醬香風(fēng)味成分的研究[1-4]。醬香型白酒具有“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、貯存周期長(zhǎng)”四高兩長(zhǎng)的工藝特點(diǎn)[5]。以耐熱真菌、細(xì)菌為主的發(fā)酵菌群形成了醬香型白酒獨(dú)特的風(fēng)味，其酒體具有“醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，空杯留香持久”的風(fēng)味特征，深受消費(fèi)者青睞[6]。

微生物及其酶系的作用關(guān)系是影響香型白酒風(fēng)味特征形成的重要因素。這些微生物產(chǎn)酶及代謝活動(dòng)相互作用，最終形成了白酒特殊風(fēng)味物質(zhì)。釀酒微生物研究水平直接影響白酒生產(chǎn)技術(shù)水平，進(jìn)而影響白酒的質(zhì)量、微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其是風(fēng)味微生物菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)于白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量起著決定性的作用。醬香型白酒特殊的酒體風(fēng)格就在于其獨(dú)特釀造工藝所形成的特殊微生物區(qū)系[7]。酸性蛋白酶首先能夠促進(jìn)微生物生長(zhǎng)；其次能夠提高原材料的利用率；還能夠提供生香前體物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)。目前，已有關(guān)于產(chǎn)醬香微生物的研究報(bào)道，結(jié)果表明，芽孢桿菌與產(chǎn)醬香風(fēng)味關(guān)聯(lián)度比較大[8-9]，這些微生物的代謝活動(dòng)與發(fā)酵過程中物理化學(xué)反應(yīng)的相互重迭作用，最終形成了醬香型白酒中一系列特殊的風(fēng)味物質(zhì)[10]。王鵬[11]將地衣芽孢桿菌強(qiáng)化后的大曲應(yīng)用到窖池中，改變了酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，顯著提高了酒醅中芳香族化合物的含量。黃曉寧等[12]將優(yōu)選得到的具有產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）B.L-1和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B.S-1分別應(yīng)用于清香型白酒釀造過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過強(qiáng)化發(fā)酵后均出現(xiàn)了差異代謝物，且4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和四甲基吡嗪含量均顯著增加。胡寶東等[13]從醬香型大曲中分離出了甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）（現(xiàn)已歸屬于貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）），因其能產(chǎn)高活性的中性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶等，對(duì)提高醬香型大曲的品質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。芽孢桿菌的種類和數(shù)量將直接決定曲的優(yōu)劣，在白酒發(fā)酵中起著增香、特別是改善白酒后味的重要作用，進(jìn)而影響酒醅發(fā)酵程度和酒的風(fēng)格特征。關(guān)于堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過程酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)研究有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)醬香型白酒發(fā)酵機(jī)理及生產(chǎn)特性[14]。

高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，又稱第二代測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全面的分析，因此也有人把它稱為深度測(cè)序[15]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)在各個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有很廣泛的應(yīng)用[16]，如人體微生物、水中微生物、土壤微生物等領(lǐng)域[17-18]。高通量測(cè)序技術(shù)用于環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)研究具有明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢(shì)，它能夠快捷方便地讀取樣品中復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)，有利于對(duì)樣品中微生物群落多樣性進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，具有高通量、速度快、準(zhǔn)確定量、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[19-20]。通過高通量測(cè)序技術(shù)，能夠從種的水平上鑒定出樣品中微生物菌種的組成，并能體現(xiàn)出生產(chǎn)工藝對(duì)菌屬數(shù)量變化的影響，為更好地研究醬香型白酒微生物的功能、對(duì)醬香風(fēng)味的貢獻(xiàn)提供技術(shù)支持[21]。

為改善白酒酒醅的菌系組成，本研究將芽孢桿菌加強(qiáng)菌接種至白酒酒醅中，通過高通量測(cè)序技術(shù)考察其對(duì)酒醅微生物Alpha多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響，通過解析第五輪次出池酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律提高酒醅蛋白酶活力，以期達(dá)到提高醬香型白酒品質(zhì)及產(chǎn)率的目的，進(jìn)一步為芽孢桿菌加強(qiáng)菌在釀造醬香型白酒中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

第五輪次出池酒醅樣品：由山東福瑞王酒業(yè)有限公司和濟(jì)南瑞豐生物工程有限公司提供。芽孢桿菌（Bacillus）：從高溫大曲中篩選出的芽孢桿菌。

1.1.2 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：北京百奧萊博科技有限公司；氯化鈉（分析純）：浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；MagPure土壤脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）LQ試劑盒：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；量子比特dsDNA檢測(cè)試劑盒：上海典森科技有限公司；Tks Gflex DNA聚合酶：日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biotek SynergyNeo2多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水槽：江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；FA2204B歐萊博精密天平：濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；580BR10905聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-rad公司；NextSeq 500高通量測(cè)序儀：美國illumlina公司；Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)：上海在途生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理[22-23]

福瑞王1號(hào)和瑞豐1號(hào)酒醅：未加入芽孢桿菌加強(qiáng)菌；福瑞王2號(hào)和瑞豐2號(hào)酒醅：加入芽孢桿菌加強(qiáng)菌。首先分別取酒醅固體樣品各5 g分別放入4個(gè)100 mL的燒杯中，分別向4個(gè)燒杯中加入0.9%NaCl溶液各50 mL，并在每個(gè)燒杯中加入玻璃珠后放入渦旋振蕩器中攪拌30 min后，放入離心管中在6 000 r/min 條件下冷凍離心8 min，取上清液10 mL于離心管中，備用。

1.3.2 酒醅樣品的DNA提取及擴(kuò)增子測(cè)序

采用DNA抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測(cè)DNA的濃度。以酒醅樣品的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶barcode的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。所有細(xì)菌使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[19]擴(kuò)增V4高變區(qū)。真菌使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[24]擴(kuò)增高變區(qū)。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并采用上述方法進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增，并再次使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，通過Illumina MiSeq 2500平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 序列分析

原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式。使用Trimmomatic軟件[25]對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜，去雜后的雙端序列利用FLASH[26]軟件（1.2.11）進(jìn)行拼接后進(jìn)行精準(zhǔn)去雜，利用UCHIME檢測(cè)并去除序列中的嵌合體序列。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用Vsearch軟件[27]（2.8.1），根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個(gè)操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），參數(shù)為序列相似度≥97%被歸為一個(gè)OTU。使用QIIME2（v2020.11）軟件包[28]挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋。16S rRNA、18S rRNA使用Silva（version138）數(shù)據(jù)庫比對(duì)，物種比對(duì)注釋使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）classifier[29]軟件插件的join-pairs、quantity-filter、dereplicatesequences模塊對(duì)去除引物的雙端序列進(jìn)行拼接、質(zhì)控和去冗余，保留置信區(qū)間＞0.7的注釋結(jié)果。引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribed spacer，ITS）使用Unite數(shù)據(jù)庫比對(duì)。物種比對(duì)注釋使用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）[30]軟件。基于以上檢測(cè)結(jié)果計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)。本研究將在酒醅中存在且平均相對(duì)豐度＞1%的細(xì)菌和真菌的門、屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌的門、屬；在酒醅中存在且平均相對(duì)豐度＞30%的細(xì)菌和真菌的門、屬定義為第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌的門、屬。

1.3.4 酸性蛋白酶活力的測(cè)定

酸性蛋白酶活力的測(cè)定：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》。蛋白酶活力定義：在一定pH值和溫度條件下，1 mL酶液每分鐘內(nèi)酪蛋白水解所產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅樣品中真菌及細(xì)菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果

2.1.1 酒醅樣品中真菌和細(xì)菌群落分布豐度

用Chao1算法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，Chao1指數(shù)越大，說明群落分布豐度越高[31]。酒醅樣品中真菌和細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)見表1。

表1 酒醅樣品中真菌和細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)Table 1 Chao1 index of fungal and bacterial communities in fermented grains samples

由表1可知，在群落豐度方面，加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王2號(hào)和瑞豐2號(hào)）真菌菌群的Chao1值分別為174.6、55，細(xì)菌菌群的Chao1指數(shù)分別為200.4、218.9，均高于未加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王1號(hào)和瑞豐1號(hào)）的真菌、細(xì)菌菌群Chao1指數(shù)，說明加入芽孢桿菌能夠提高微生物群落豐度。

2.1.2 酒醅樣品中真菌和細(xì)菌群落分布多樣性

Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高[32]。酒醅樣品中真菌和細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)見表2。

表2 酒醅樣品中真菌和細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)Table 2 Shannon index of fungal and bacterial communities in fermented grains samples

由表2可知，在群落分布多樣性方面，加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王2號(hào)和瑞豐2號(hào)）真菌菌群Shannon指數(shù)分別為3.08、0.96，細(xì)菌菌群Shannon指數(shù)分別為1.29、2.91，均高于未加入芽孢桿菌的酒醅樣品（福瑞王1號(hào)和瑞豐1號(hào)）的真菌、細(xì)菌菌群Shannon指數(shù)，說明加入芽孢桿菌能夠提高微生物群落分布多樣性。

2.2 不同酒醅樣品微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.1 福瑞王樣品基于門、屬水平真菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計(jì)算福瑞王樣本真菌菌群物種的相對(duì)豐度，結(jié)果見圖1。

圖1 基于門水平（A）和屬水平（B）福瑞王酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 1 Analysis results of fungal community structure in Furuiwang fermented grains samples based on phylum (A) and genus (B) level

由圖1（A）可知，福瑞王1號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門，包括子囊菌門（Ascomycota）（82.53%）、擔(dān)子菌門（Basidiomy cota）（13%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（1.10%）；福瑞王2號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門，包括子囊菌門（Ascomycota）（95.54%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（2%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（1.8%）。在兩個(gè)樣品中，第一優(yōu)勢(shì)真菌門均為子囊菌門（Ascomycota）。

由圖1（B）可知，福瑞王1號(hào)共檢出5個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，包括曲霉屬（Aspergillus）（34%）、伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（12%）、紅曲菌屬（Monascus）（11%）、皮絲孢子菌屬（Cutaneotrichosporon）（9%）、青霉屬（Penicillium）（5%），第一優(yōu)勢(shì)真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）；福瑞王2號(hào)共檢出5個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，包括接合酵母屬（Zygosaccharomyces）（36%）、曲霉屬（Aspergillus）（18%）、紅曲菌屬（Monascus）（10%）、青霉屬（Penicillium）（10%）、伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（10%），第一優(yōu)勢(shì)真菌屬為接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。

2.2.2 福瑞王樣品基于門、屬水平細(xì)菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計(jì)算福瑞王樣本細(xì)菌菌群物種的相對(duì)豐度，結(jié)果見圖2。

圖2 基于門水平（A）和屬水平（B）福瑞王酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 2 Analysis results of bacterial community structure in Furuiwang fermented grains samples based on phylum (A) and genus (B) level

由圖2（A）可知，福瑞王1號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（62%）、變形菌門（Proreobacteria）（35%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（2%）；福瑞王2號(hào)共檢出2個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（84%）、變形菌門（Proreobacteria）（15%），第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）。

由圖2（B）可知，福瑞王1號(hào)共檢出2個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）（58%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（32%）；福瑞王2號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）（84%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（15%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（1%），第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.2.3 瑞豐樣品基于門、屬水平真菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計(jì)算瑞豐樣本真菌菌群物種的相對(duì)豐度，結(jié)果見圖3。

圖3 基于門水平（A）和屬水平（B）瑞豐酒醅樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 3 Analysis results of fungal community structure in Ruifeng fermented grains samples based on phylum (A) and genus (B) levels

由圖3（A）可知，瑞豐1號(hào)共檢出2個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門，包括子囊菌門（Ascomycota）（86.98%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（13%）；瑞豐2號(hào)共檢出1個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門，為子囊菌門（Ascomycota）（99.7%）。在兩個(gè)樣品中，第一優(yōu)勢(shì)真菌門均為子囊菌門（Ascomycota）。

由圖3（B）可知，瑞豐1號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，包括伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（89%）、曲霉屬（Aspergillus）（7%）、紅曲菌屬（Monascus）（2%）；瑞豐2號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，包括伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）（77%）、根酶屬（Rhizopus）（13%）、紅曲菌屬（Monascus）（3%）。在兩個(gè)樣品中，第一優(yōu)勢(shì)真菌屬均為伊薩酵母菌屬（Issatchenkia）。

2.2.4 瑞豐樣品基于門、屬水平細(xì)菌菌群分析結(jié)果

分別在門水平和屬水平上計(jì)算瑞豐樣本細(xì)菌菌群物種的相對(duì)豐度，結(jié)果見圖4。

圖4 基于門水平（A）和屬水平（B）瑞豐酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig. 4 Analysis results of bacterial community structure in Ruifeng fermented grains samples based on phylum (A) and genus level (B)

由圖4（A）可知，瑞豐1號(hào)共檢出3個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（65%）、變形菌門（Proreobacteria）（30%）、放線菌門（Actinobacteria）（3%）；瑞豐2號(hào)共檢出2個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）（84%）、變形菌門（Proreobacteria）（15%）。在兩個(gè)樣品中，第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）。

由圖4（B）可知，瑞豐1號(hào)共檢出5個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，包括片球菌屬（Pediococcus）（15%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（6%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（6%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（4%）、魏斯式菌屬（Weissella）（2%）；瑞豐2號(hào)共檢出6個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）（55%）、片球菌屬（Pediococcus）（17%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（9%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（8%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（4%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（2%），第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.3 酒醅樣品的酸性蛋白酶活力

福瑞王1號(hào)樣品的酸性蛋白酶活力為2.04×104U/mL，福瑞王2號(hào)樣品的酸性蛋白酶活力為3.00×104U/mL，蛋白酶活力提高了9.6×103U/mL。瑞豐1號(hào)酸性蛋白酶活力為3.22×104U/mL，瑞豐2號(hào)樣品酸性蛋白酶活力為3.57×104U/mL，蛋白酶活力提高了3.5×103U/mL。其中，福瑞王2號(hào)樣品的酸性蛋白酶活力提高尤為明顯，增加了47.1%。因此，加入芽孢桿菌加強(qiáng)菌可以明顯影響樣品中酸性蛋白酶的活力，可以使樣品中酸性蛋白酶的活力明顯提高。

3 結(jié)論

從高通量測(cè)序結(jié)果分析來看，加強(qiáng)菌芽孢桿菌的加入明顯提升了微生物群落的分布豐度和群落分布多樣性，同時(shí)促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而能夠更好的提高白酒的風(fēng)味與品質(zhì)；加入芽孢桿菌加強(qiáng)菌的實(shí)驗(yàn)組樣品的酸性蛋白酶活力均明顯高于未加入芽孢桿菌的空白組樣品，其中，福瑞王樣品的酸性蛋白酶活力提高尤為明顯，增加了47.1%。該研究可為醬香型白酒品質(zhì)和風(fēng)味的提高鑒定理論研究基礎(chǔ)。