李 丹，韓亞楠，陳寬益，李鑫洋

（1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.河北師范大學(xué) 分析測試中心，河北 石家莊 050024）

果皮蠟質(zhì)存在于果實表面，是果實與周圍環(huán)境的第一道屏障，在果實發(fā)育和貯藏階段，具有防止果實水分散失、防止紫外線曬傷、防止病原微生物侵染和害蟲啃食、防止果實開裂、防止果實營養(yǎng)流失、延長貨架期、以及改善果實外觀和內(nèi)在品質(zhì)性狀的功能[1]。其主要由脂肪族化合物和次生代謝產(chǎn)物構(gòu)成，前者包含烷烴、烯烴、初級醇、次級醇、脂肪酸、脂肪醛、酮；后者包含三萜類、甾醇和黃酮類[1]。目前果實蠟質(zhì)的研究多集中于采收期和貯藏期果實蠟質(zhì)組分分析及其功能的研究[2-3]。如TRIVEDI P等[4]研究發(fā)現(xiàn)，越橘果實的外觀光澤與蠟質(zhì)中三萜類組分比例的升高有關(guān)。CHU W J等[5]研究發(fā)現(xiàn)，去除藍莓表面蠟質(zhì)使其失水嚴(yán)重，果實外觀亮藍色變淡，口感和營養(yǎng)品質(zhì)降低，果實抗氧化能力下降，貨架期縮短。CHAI Y等[6]的研究結(jié)果表明，不同品種蘋果貯藏期間蠟質(zhì)組分烷烴與果實失水和營養(yǎng)品質(zhì)保持密切相關(guān)。另外乙烯抑制劑1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）在延緩低溫貯藏新紅星蘋果蠟質(zhì)總量增加的同時，延緩可滴定酸和果實硬度下降[7]。以上研究說明在采后及貯藏階段，果實蠟質(zhì)對于延緩品質(zhì)劣變具有重要作用，但對于發(fā)育階段果實蠟質(zhì)與果實品質(zhì)形成關(guān)系的研究卻鮮見報道。

此研究以鴨梨和其芽變品種金墜梨為材料，與鴨梨相比，金墜梨果皮光滑且果點少[8]。據(jù)報道果實外觀品質(zhì)（顏色、質(zhì)地、果點）受果實蠟質(zhì)組分特征的影響[9]。另外有研究發(fā)現(xiàn)多酚是梨果實（尤其是果皮）中含量豐富的化合物[10]。因此選擇這兩種梨作為供試材料，是分析果實蠟質(zhì)與果實營養(yǎng)指標(biāo)總酚和黃酮含量關(guān)系的理想材料。通過分析盛花后60 d兩種果實蠟質(zhì)組分的差異，以及測定果實不同部位總酚和黃酮的含量，并對兩者進行相關(guān)性和主成分分析（principal component analysis，PCA）。這一項研究將對進一步探究發(fā)育期果實蠟質(zhì)在果實品質(zhì)形成中發(fā)揮的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金墜梨和鴨梨：產(chǎn)地為河北邯鄲魏縣東南溫村；N-O-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（分析純）：日本東京化成工業(yè)株式會社；正二十四烷標(biāo)準(zhǔn)品：美國AccuStandardTM公司；吡啶：北京索萊寶生物科技有限公司；氯仿和無水乙醇（均為分析純）：天津永大化學(xué)試劑公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大BioBasicInc公司；福林酚（分析純）：北京酷來搏科技有限公司；硝酸鋁（分析純）：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津博迪化工股份有限公司；0.22 μm針筒微孔濾膜：北京酷萊搏有限責(zé)任公司；棕色樣品瓶：美國安捷倫公司。

2021年6月6日于河北省魏縣東南溫村采集盛花后60 d的金墜梨和鴨梨，兩種梨各自隨機選取21個，分成3組，每組7個，分別進行果實總蠟質(zhì)提取、測定前處理及氣相色譜-質(zhì)譜檢測；另外隨機選取20個分別取果皮、果肉和果心凍于液氮（-196 ℃），儲存于超低溫冰箱，用于果實不同部位總酚和黃酮含量的測定。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-3000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器有限公司；RZK-S24水浴氮吹儀：北京億陽潤澤科技有限公司；Thermo DSQⅡ氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）分析儀（配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、ThermoHeraeus Multifuge X1R離心機：美國塞默飛世爾科技有限公司；A11 basic分析研磨機：德國IKA公司；KS-100B旋鈕超聲波清洗器：昆山潔力美超聲儀器有限公司；HH2恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；T6紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實總蠟質(zhì)提取和GC-MS檢測

參考文獻[11]的方法，從兩種梨中各挑選21個無明顯機械和病害損傷的果型端正的果實，平均分成3組進行總蠟質(zhì)提取。每個果實連續(xù)進入兩個盛放相同體積氯仿且規(guī)格一致的容器，各自浸泡1 min。分別將每種梨兩次提取液（每一組）混合，并加入200 μL 1 μg/μL正二十四烷標(biāo)準(zhǔn)品作內(nèi)標(biāo)。將混合液旋蒸至少量并存放于棕色樣品瓶中，在40 ℃水浴條件下，由氮吹儀吹干，并密封存放于超低溫冰箱用于蠟質(zhì)組分分析和含量測定?？傁炠|(zhì)提取前測量每個果實橫徑、縱徑和高度，用于估算果實浸泡表面積。

蠟質(zhì)測定前處理參考文獻[11]的方法。在干燥后的蠟質(zhì)樣品中加入400 μLN-O-三甲基硅烷基三氟乙酰胺并在70 ℃條件下衍生化40 min。40 ℃條件下，用緩慢的氮氣（N2）流將反應(yīng)液中多余硅烷化試劑吹干，加入2.5 mL氯仿定容，使用孔徑為0.22 μm針筒微孔濾膜過濾至1.5 mL頂空進樣瓶中，準(zhǔn)備上機測定。

蠟質(zhì)組分測定參考文獻[11]的方法，由Thermo DSQⅡ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀完成。DB-1毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）用于組分分離，氦氣（He）作為載氣，流速為1mL/min。氣相程序設(shè)置：初始溫度70 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫至200 ℃，再以4 ℃/min升溫至300 ℃并保持20 min。分流比10∶1，進樣量為1.5 μL。質(zhì)譜程序設(shè)置：進樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源70 eV，質(zhì)譜掃描范圍為50～650 m/z。蠟質(zhì)組分鑒定參考質(zhì)譜庫美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）09，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算蠟質(zhì)組分含量，含量表示為μg/cm2。

1.3.2 果實不同部位總酚含量測定

參考文獻[12]的方法。分別稱取果皮、果肉和果心凍樣0.3 g、0.5 g和0.3 g，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，室溫超聲30 min得到粗提液，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸取上清液備用。取1.5 mL待測上清液，加入1 mL福林酚并振蕩搖勻，再加入2 mL 12 g/100mL Na2CO3，體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容至25 mL，避光反應(yīng)2 h，用沒食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定反應(yīng)液波長765 nm處的吸光度值?？偡佑嬎愎饺缦拢?/p>

C反應(yīng)液（mg/mL）由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。

1.3.3 果實不同部位黃酮含量測定

黃酮測定參考文獻[12]的方法，按照“1.3.2”方法制備粗提液。取2 mL待測上清液，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇并混勻，依次分別加入0.3 mL 5 g/100 mL NaNO2、和10 g/100 mL Al（NO3）3，兩步均混勻并靜置6 min，再加入4 mL 4 g/100 mL NaOH靜置12 min，最后加入0.4 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇（定容至10 mL）。用蘆丁制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定波長510 nm處反應(yīng)液的吸光度值。黃酮計算公式同上。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均包含3個重復(fù)，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”。單因素方差分析用于數(shù)據(jù)間差異分析，多重比較采用LSD和Duncan兩種方法，其中不同字母代表數(shù)據(jù)間差異顯著（P＜0.05）。單因素方差分析和相關(guān)性分析利用軟件IBM statistics SPSS 22，主成分分析使用軟件Origin2017。

2 結(jié)果與分析

2.1 盛花后60天，金墜梨和鴨梨果實蠟質(zhì)組分比例、含量及分布

盛花后60天，兩種梨果實中共鑒定出25種蠟質(zhì)組分，分別屬于烷烴、脂肪醇、脂肪醛和三萜類，除以上4種分類，總蠟質(zhì)中還含有極少量其他未鑒定組分，在金墜梨中的比例依次為5.21%、15.75%、22.00%、54.84%、2.20%，而在鴨梨中依次為5.23%、13.36%、18.86%、59.51%、3.04%（圖1）。兩種梨中三萜類含量＞脂肪醛（或脂肪醇）含量＞烷烴含量。其中烷烴、脂肪醇、脂肪醛總和為脂肪族蠟質(zhì)，且金墜梨中三萜類、脂肪族蠟質(zhì)和總蠟質(zhì)等的含量均低于鴨梨中的含量（表1）。

圖1 盛花后60 d金墜梨和鴨梨果實蠟質(zhì)組分比例Fig. 1 Proportion of waxy components in fruits of 'jinzhui' and 'yali'pears after flowering for 60 d

表1 盛花后60 d金墜梨和鴨梨果實蠟質(zhì)組分含量差異Table 1 Difference of wax components in fruits of 'jinzhui' and 'yali' pears after flowering for 60 d

對各種梨果實蠟質(zhì)組成的研究得出成熟‘紅香酥’梨、發(fā)育和成熟‘蘋果梨’及35個梨品種果實蠟質(zhì)均以三萜、烷烴和脂肪醇為主[13-16]。分析其他果實品種蠟質(zhì)組成發(fā)現(xiàn)9種藍莓[17]、不同采收期的兩種桃（‘October Sun’和‘Jesca’）[18]和4種蘋果（‘Prima’、‘Florina’、‘喬納金’和‘紅元帥’）[19-20]均以三萜、奇數(shù)碳烷烴（C23和C25）和脂肪醇為主。綜上說明品種、發(fā)育階段、生長環(huán)境均對果實蠟組分產(chǎn)生影響，但果實蠟質(zhì)卻是三萜的重要來源，優(yōu)化提取工藝從果實蠟質(zhì)中獲得更高含量的三萜類物質(zhì)，應(yīng)用于功能食品、保健品和藥品開發(fā)及抗衰老和抗氧化化妝品的研發(fā)是很有前景的。

兩種梨果實蠟質(zhì)分布相似，包含碳鏈長度C22-C29烷烴、C22-C30脂肪醇、C28-C34脂肪醛和7種三萜類物質(zhì)（圖2）。其中C29烷 烴、C28醇、C32醛、C34醛 和Urs-12-en-28-al，3-（acety loxy）-，（3β）-為主要成分，金墜梨中它們的含量依次為（8.42±1.38）μg/cm2、（16.00±1.98）μg/cm2、（27.00±4.52）μg/cm2、（8.06±1.61）μg/cm2、（86.70±16.08）μg/cm2；而鴨梨中它們的含量依次為（12.48±1.79）μg/cm2、（20.35±0.92）μg/cm2、（34.34±2.92）μg/cm2、（11.89±1.17）μg/cm2、（138.57±14.77）μg/cm2，其中金墜梨中以上主要蠟質(zhì)組分的含量均低于鴨梨中它們的含量（圖2）。

圖2 盛花后60 d金墜梨和鴨梨果實烷烴（A）、脂肪醇（B）、脂肪醛和三萜類（C）蠟質(zhì)組分分布Fig. 2 Distribution of wax components alkanes (A),fatty alcohols (B),aliphatic aldehydes and triterpenes (C) in fruits of 'jinzhui' and 'yali'pears after flowering for 60 d

前期研究發(fā)現(xiàn)C29烷烴、C22醇、C32醛、C34醛和兩種三萜（β-amyrin、Urs-12-en-28-al，3-（acetyloxy）-，（3β）-）是‘紅香酥梨’果實蠟質(zhì)主要成分[13]，這與本次研究兩種梨的蠟質(zhì)分布相似。在研究濕度及低溫對貯藏‘庫爾勒香梨’、‘雪花梨’和‘玉露香梨’蠟質(zhì)組分的影響發(fā)現(xiàn)，C29烷烴、C31烷烴、C22-C30醇（偶數(shù)碳）、C16醛、C18醛和C28醛是3種梨蠟質(zhì)的主要成分[21-22]。另外在研究其他果實蠟質(zhì)組分分布時發(fā)現(xiàn)：4種北歐越橘品種以及‘粉紅女士’蘋果蠟質(zhì)組分均以C29烷烴、C31烷烴、C18醛、C24醛-C28醛（偶數(shù)碳）、α-amyrin、β-amyrin為主要成分[23-24]。以上研究表明，不同品種梨果實蠟質(zhì)組分分布呈相似規(guī)律，表現(xiàn)為烷烴以奇數(shù)碳組分為主要成分，而脂肪醇和脂肪醛均以偶數(shù)碳組分為主要成分。

2.2 盛花后60 d，金墜梨和鴨梨果實不同部位總酚和黃酮含量

由圖3A可知，金墜梨果皮、果肉、果心的總酚含量分別為1.97 mg/g、0.74 mg/g、3.14 mg/g；鴨梨果皮、果肉、果心的總酚含量分別為2.57 mg/g、0.62 mg/g、2.74 mg/g。金墜梨果心總酚含量顯著高于鴨梨（P＜0.05），果皮總酚含量顯著低于鴨梨（P＜0.05），果肉總酚含量稍高于鴨梨但差異不顯著（P＞0.05）。

由圖3B可知，金墜梨果皮、果肉、果心的黃酮含量分別為1.92 mg/g、0.80 mg/g、8.97 mg/g；鴨梨果皮、果肉、果心的黃酮含量分別為2.43 mg/g、0.61 mg/g、10.41 mg/g。金墜梨果心黃酮含量顯著低于鴨梨（P＜0.05），金墜梨果皮黃酮稍低于鴨梨但無明顯差異（P＞0.05），金墜梨果肉黃酮稍高于鴨梨但無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 盛花后60 d金墜梨和鴨梨果實不同部位總酚（A）和黃酮（B）含量Fig. 3 Contents of total phenols (A) and flavonoids (B) in different parts of 'jinzhui' and 'yali' pears after flowering for 60 d

研究采收期5個梨品種（‘圓黃梨’、‘紅香酥梨’、‘玉露香梨’、‘黃冠梨’、‘雪花梨’）發(fā)現(xiàn)果皮總酚和黃酮含量高于果肉和果心中它們的含量[12]。這與本研究結(jié)果部分相似，其中差異可能與梨品種、產(chǎn)地、發(fā)育和貯藏條件有關(guān)，蒙秋霞等[25]的研究表明‘玉露香梨’果皮中黃酮含量受產(chǎn)地因素影響較大。

2.3 盛花后60 d，金墜梨和鴨梨果實蠟質(zhì)組分與果實總酚和黃酮含量的PCA和相關(guān)性分析

將兩種梨6種蠟質(zhì)分類的含量和果皮、果肉和果心中總酚和黃酮含量共12個因子做PCA（圖4）。提取的主成分PC1和PC2方差貢獻率分別為79.9%和12.9%。

圖4 盛花后60 d金墜梨和鴨梨果實中蠟質(zhì)組分與果實不同部位營養(yǎng)指標(biāo)的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of wax components in 'jinzhui'and 'yali' pears fruit and nutritional indexes of different parts of fruits after flowering for 60 d

由圖4可知，蠟質(zhì)組分脂肪醛、烷烴、脂肪族蠟質(zhì)和果心黃酮均在PC1負半軸和PC2正半軸上有載荷，說明這三種蠟質(zhì)組分代表兩種梨果心營養(yǎng)指標(biāo)的特征，且它們的含量與果心黃酮含量正相關(guān)（P＜0.05）（表2）；而脂肪醇、總蠟質(zhì)、三萜類和果皮總酚、果皮黃酮均在PC1負半軸上有載荷，說明這三種組分代表兩種梨果皮營養(yǎng)指標(biāo)的特征，且它們的含量與果皮總酚和果皮黃酮含量正相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

表2 盛花后60 d金墜梨和鴨梨果實中蠟質(zhì)組分與果實不同部位總酚和黃酮含量的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between wax components in 'jinzhui'and 'yali' pears and the contents of total phenols and flavonoids of different parts of fruits after flowering for 60 d

根據(jù)品種與12種因子的關(guān)系，主成分PC1將兩種梨分成兩組。其中金墜梨組合金墜1、金墜2、金墜3位于PC1正半軸，鴨梨組合鴨梨1、鴨梨2、鴨梨3位于PC1負半軸。這種差異表現(xiàn)為金墜梨和鴨梨在蠟質(zhì)組分三萜類、總蠟質(zhì)和脂肪族含量，以及營養(yǎng)指標(biāo)果皮總酚、果皮黃酮和果心黃酮含量上的差別。

3 結(jié)論

盛花后60 d，與鴨梨相比，金墜梨果皮光滑無果點，且果皮總酚、果皮黃酮及果心黃酮含量呈下降趨勢，這可能與果實蠟質(zhì)中總蠟質(zhì)、三萜類、脂肪族類蠟質(zhì)及它們的主要組分C29烷烴、C28醇、C32醛、C34醛和Urs-12-en-28-al 3-（acetyloxy）-（3β）-含量的降低有關(guān)。此研究對進一步探究發(fā)育期果實蠟質(zhì)對果實品質(zhì)營養(yǎng)指標(biāo)的影響，及開發(fā)改變果實蠟質(zhì)組分達到促進果實營養(yǎng)品質(zhì)形成的生長調(diào)節(jié)劑等實用技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。