梁棟 ，楊洪濤

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300381；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300381）

隨著生活飲食習慣的改變，糖尿病全球患病率程上升趨勢，目前已成為威脅人類壽命的嚴重疾病。據(jù)相關(guān)流調(diào)顯示，目前中國成人2型糖尿病的患病率已達10.9%[1]。糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥。在全球范圍內(nèi)，糖尿病腎病是導致慢性腎臟?。–KD）甚至終末期腎?。‥SRD）的主要繼發(fā)性因素。在中國，既往慢性腎小球腎炎是導致慢性腎臟病發(fā)病的首要原因，隨著糖尿病發(fā)病率的持續(xù)上升，相關(guān)研究證實，糖尿病腎病已經(jīng)取代慢性腎小球腎炎成為中國導致慢性腎臟病的主要原因[2-3]。腎小管間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病主要的病理特征，而在糖尿病腎病相關(guān)病程進展中，腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（EMT）不僅促進腎間質(zhì)纖維化，而且是糖尿病腎病腎臟損傷的主要機制[4]。而轉(zhuǎn)化生長因子β1是公認的致纖維化因子[5]，其過度表達可誘導糖尿病腎病，激活其下游相關(guān)因子，加速腎間質(zhì)纖維化。最近的研究也證實抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1和 Smad相關(guān)蛋白（TGF-β1/Smad）可抑制腎纖維化和上皮細胞轉(zhuǎn)分化。既往的研究證實，高糖環(huán)境、持續(xù)炎癥狀態(tài)均可激活相關(guān)信號通路導致糖尿病持續(xù)腎損傷[6-7]。而其中白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是具有代表性的相關(guān)炎癥因子，其激活中性粒細胞并使其聚集，進一步向炎癥部位遷移、吞噬細胞、釋放卵清蛋白酶、促進細胞凋亡等，促進炎癥進一步發(fā)展，影響糖尿病患者免疫調(diào)節(jié)[8]。

梔子苷（GE）作為環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是梔子中主要活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗炎等多種生物學作用[9]，在糖尿病腎病小鼠中可改善疾病狀態(tài)[10]，有研究表明，梔子苷可以降低脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞相關(guān)炎癥狀態(tài)中TNF-α和IL-1β、IL-6等的表達和釋放[11]。但是否通過改善腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化發(fā)揮作用尚不清楚。因此，高糖誘導人近端腎小管上皮細胞HK2，探討GE對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化是否發(fā)揮作用，以初步探討GE緩解糖尿病腎病的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人近端腎小管上皮細胞HK2，購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心，資源編號：3111C0001CCC000160。

1.2 藥品、試劑及儀器 GE（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，CAS：24512-63-8）；胎牛血清、無糖DMEM培養(yǎng)液（美國Sigma公司，貨號分別為：F8318、90113）；IL-1β、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，一抗 TGF-β1、Smad3、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，英國Abcam公司，貨號分別為：ab215715、ab40854、ab21027）磷酸化 Smad3（Phospho-Smad3，p-Smad3）（美國 CST 公司，批號 9520）；RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一條鏈合成試劑盒、2×SYBR qPCR Mix（北京 TAINGEN 公司，貨號分別為：DP419、KR104、KR108）。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀（美國ABI公司，型號：7500）；蛋白凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司，型號：GelDoc 2000）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及處理 實驗分為對照組、高糖組、GE 1、10、50、100 μmol/L 組。HK2 細胞在含 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到90%左右時進行傳代，細胞處于對數(shù)期時進行實驗。

對照組在5.5 mmol/L低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，除對照組外，其余各組均于25mmol/L高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，GE 1、10、50、100 μmol/L 組同時添加 GE，使 GE 終濃度分別為 1、10、50、100 μmol/L，干預(yù)48 h。

1.3.2 顯微鏡下觀察HK2細胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察HK2細胞的形態(tài)學情況。

1.3.3 qRT-PCR檢測細胞中纖連蛋白（FN）、E-鈣黏素（E-cad）、Ⅳ型膠原（COLⅣ）mRNA 水平 RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA。qRT-PCR儀對FN、E-cad、COLⅣ、內(nèi)參 GAPDH 擴增，F(xiàn)N F：5’-CGAAATCACAGCCAG TAG-3’、R：5’-ATCACATCCACACGGTAG-3’，E-cad F：5’-CTGAGAACGAGGCTAACG-3’、R：5’-TTCAA TCCAGCACATCC-3’，COLⅣ F：5’-TATTCCTTCCT CATGCACACGGCG-3’、R：5’-CCAATTTTTGGGTT GGCACC-3’，內(nèi)參 GAPDHF：5’-AGTTCACTGGCGT CTTCAC-3’、R：5’-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3’。20 μL 反應(yīng)體系：1 μL 40 ng/μL cDNA、10 μL 2×Mix、0.5 μL/0.5μL（F/R）、8 μL ddH2O；反應(yīng)條件：95 ℃、40 s；95 ℃、30 s，（FN 59 ℃、45 s，E-cad 61 ℃、40 s，COLⅣ 57 ℃、45 s），40 個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算FN、E-cad、COLⅣmRNA相對表達水平。

1.3.4 ELISA 檢測細胞上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α水平 收集細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心5 min收集上清，離心半徑為32.3 cm。嚴格按照人IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測細胞中TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA蛋白水平 收集細胞，添加蛋白裂解液冰上裂解10 min，14 000 r/min、4℃離心20 min提取總蛋白，離心半徑為11.09cm。10%凝膠電泳分離蛋白，280 mA 40 min PVDF膜轉(zhuǎn)膜；PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應(yīng)加入一抗TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。條帶灰度值通過image J軟件分析獲得。

1.4 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學軟件GraphPad 8.0進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài) 對照組細胞呈多邊形或卵圓性，分布均勻；高糖組細胞部分呈現(xiàn)長梭形、胞核呈梭形變；隨著GE劑量的升高，細胞形態(tài)逐漸恢復正常。見圖1。

圖1 各組細胞形態(tài)情況（×200）Fig.1 Cell morphology of each group(×200)

2.2 GE對細胞中纖維化標志物FN、E-cad、COLⅣmRNA水平的影響 與對照組相比，高糖組細胞中FN、COLⅣmRNA水平升高，E-cad mRNA水平降低（P＜0.05）；與高糖組相比，GE 1 μmol/L 組細胞中FN mRNA 水平降低（P＜0.05），GE 10、50、100 μmol/L組細胞中FN、COLⅣmRNA水平降低，E-cad mRNA水平升高（P＜0.05）。見表 1。

表1 6組細胞中FN、E-cad、COLⅣmRNA水平比較（n=6，±s）Tab.1 Comparison of FN，E-cad and COLⅣmRNA levels in 6 groups of cells（n=6，±s）

表1 6組細胞中FN、E-cad、COLⅣmRNA水平比較（n=6，±s）Tab.1 Comparison of FN，E-cad and COLⅣmRNA levels in 6 groups of cells（n=6，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05。

組別 FN E-cad COLⅣ對照組 1.01±0.12 0.99±0.09 0.98±0.09高糖組 3.16±0.31* 0.37±0.04* 2.43±0.25*GE 1 μmol/L 組 2.42±0.25# 0.43±0.04 2.18±0.16 GE 10 μmol/L 組 2.14±0.19# 0.57±0.05# 1.96±0.18#GE 50 μmol/L 組 1.86±0.17# 0.73±0.08# 1.53±0.05#GE 100 μmol/L 組 1.34±0.12# 0.82±0.06# 1.38±0.14#

2.3 GE 對上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與對照組相比，高糖組上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與高糖組相比，GE 1、10、50、100 μmol/L 組上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見表 2。

表 2 6 組上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（n=6，±s）Tab.2 Supernatant of IL-1β、IL-6、TNF-α level comparison in 6 groups of cells（n=6，±s）

表 2 6 組上清液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（n=6，±s）Tab.2 Supernatant of IL-1β、IL-6、TNF-α level comparison in 6 groups of cells（n=6，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05。

組別 IL-1β IL-6 TNF-α對照組 26.46±3.16 49.19± 7.15 116.15±13.69高糖組 86.28±6.98* 136.48±13.96* 348.19±30.18*GE 1 μmol/L 組 67.49±5.86# 86.49± 9.14# 298.48±25.41#GE 10 μmol/L 組 56.66±4.94# 72.46± 7.92# 215.19±13.59#GE 50 μmol/L 組 43.71±4.69# 69.48± 7.18# 158.59±12.59#GE 100 μmol/L 組 34.85±6.15# 62.18± 6.75# 139.29±13.16#

2.4 GE 對細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA蛋白水平的影響 與對照組相比，高糖組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平升高（P＜0.05）；與高糖組相比，GE（1、10、50、100）μmol/L組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖 2、表 3。

圖2 6組細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA 蛋白水平情況Fig.2 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA protein level in 6 groups of cells

表 3 6 組細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA 蛋白水平比較（n=6，±s）Tab.3 Comparison of TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA protein level in 6 groups of cells（n=6，±s）

表 3 6 組細胞中 TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA 蛋白水平比較（n=6，±s）Tab.3 Comparison of TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA protein level in 6 groups of cells（n=6，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05。

組別 TGF-β1 Smad3 p-Smad3/Smad3 α-SMA對照組 0.43±0.04 0.67±0.07 0.09±0.01 0.06±0.01高糖組 1.21±0.18*0.68±0.08 1.12±0.11* 0.38±0.04*GE 1 μmol/L 組 0.96±0.09# 0.65±0.06 0.89±0.06# 0.26±0.03#GE 10 μmol/L 組 0.45±0.05# 0.65±0.07 0.34±0.06# 0.19±0.04#GE 50 μmol/L 組 0.24±0.05# 0.67±0.08 0.35±0.04# 0.12±0.02#GE 100 μmol/L 組 0.11±0.01#0.68±0.05 0.32±0.04# 0.09±0.01#

3 討論

梔子是茜草科植物梔子的果實，是中國的傳統(tǒng)中草藥，具有瀉火除煩、涼血解毒、清熱利濕、消腫止痛等作用。GE作為梔子重要活性成分，在糖尿病中具有保護胰島β細胞結(jié)構(gòu)，從而達到降血糖目的。在腎小管上皮細胞中是否亦發(fā)揮類似功效抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化進而緩解糖尿病腎病，目前尚不清楚。

腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化是細胞在病理條件下的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能改變現(xiàn)象，與腫瘤轉(zhuǎn)移、細胞修復、臟器纖維化關(guān)系密切，特別是臟器纖維化會引發(fā)腎衰竭[12]。FN、COLⅣ均是細胞外基質(zhì)主要成分，在腎臟疾病早期即可出現(xiàn)，誘導膠原的分泌和沉積，進而促進腎間質(zhì)纖維化過程[13]。正常情況下腎小管上皮細胞通過多種黏附蛋白緊密連接，E-cad作為黏附蛋白，在細胞膜上表達較多，具有維持細胞穩(wěn)定性和完整性作用[14]，E-cad在腎小管上皮細胞上表達降低，腎小管上皮細胞間黏附性喪失，變成單個細胞，促進腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，E-cad是腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化的第一道屏障[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組部分細胞呈長梭形、形態(tài)發(fā)生改變，細胞中FN、COLⅣmRNA水平升高，E-cad mRNA水平降低，提示高糖可誘導腎小管上皮細胞之間的黏附作用降低、腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，且促進膠原的分泌和沉積，促進纖維化過程；與高糖組相比，GE各劑量組均可在一定程度上降低FN、COLⅣmRNA水平，升高E-cad mRNA水平，從而增加腎小管上皮細胞黏附、減少膠原沉積，實現(xiàn)對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的緩解作用。

炎癥損傷是腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵，病理情況下產(chǎn)生各種炎癥因子，炎癥因子又通過旁分泌、自分泌等過程擴大炎癥效應(yīng)，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進糖尿病腎臟疾病的發(fā)展，導致腎纖維化過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，提示高糖可促進腎小管上皮細胞炎癥過程，加速炎癥反應(yīng)。與高糖組相比，GE各劑量組上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，提示GE具有抑炎作用，抑制腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)。

TGF-β1作為細胞增殖、分化的調(diào)控基因，亦可調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)分泌[17]，TGF-β信號通路已經(jīng)公認作為腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵介質(zhì)，在血管內(nèi)皮損傷、腎小管萎縮、足細胞損傷等多方面影響糖尿病腎病[18]，TGF-β信號通路中Smad蛋白亦參與這一過程[19]。α-SMA作為肌成纖維標志蛋白，可促進細胞纖維肌絲的形成，TGF-β可通過Smad過程誘導成纖維細胞標志物α-SMA的表達從而成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化，促進FN、COLⅣ的分泌[20]；TGF-β/Smad通路亦可參與炎癥免疫信號通路過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平升高，提示高糖誘導腎小管上皮細胞TGF-β/Smad通路處于激活狀態(tài)，促進細胞纖維肌絲形成和腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。與高糖組相比，GE各劑量組細胞中 TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA 蛋白水平降低，提示GE可抑制TGF-β/Smad通路，促進細胞間黏附作用、降低炎癥反應(yīng)，從而抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，抑制腎小管間質(zhì)纖維化。

綜上所述，GE可能通過降低FN、COLⅣmRNA水平，升高E-cad mRNA水平，從而增加腎小管上皮細胞黏附、減少膠原沉積，實現(xiàn)對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的緩解，同時抑制腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)，從而抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，抑制腎小管間質(zhì)纖維化。其是否通過其他途徑影響腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，尚需進一步研究。