張捷平，林曉暉，陳 勇，鄭燕芳，莊舒婷，江繼超，施 紅*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）是核激素受體超家族成員，主要表達于肝、腸、腎等組織器官，因膽汁酸是其內(nèi)源性天然配體，故又稱為膽汁酸受體［1］。在肝內(nèi)，膽汁酸合成通過2條途徑實現(xiàn)，經(jīng)典途徑是膽汁酸合成的主要途徑，由關(guān)鍵酶膽固醇-7α-羥化酶（cholesterol 7 alpha-hydroxylase，CYP7A1）催化；替代途徑則由甾醇27α羥化酶（sterol 27α-hydroxylase，CYP27A1）、甾醇12α羥化酶（sterol 12αhydroxylase，CYP7B1）介導(dǎo)。近來大量研究顯示：FXR激活后具有多種生物學(xué)效應(yīng)，不僅參與抑制膽汁酸的合成，而且能促進糖脂代謝［2］。因此FXR被認(rèn)為是防治膽汁淤積性肝病、肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的重要靶點。本課題組前期臨床與基礎(chǔ)研究表明：石斛合劑能有效降低2型糖尿病患者及模型動物的血糖，改善高脂血癥，緩解胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［3-7］。本研究以糖尿病模型db/db小鼠為對象，觀察石斛合劑對db/db小鼠肝臟FXR和CYP27A1蛋白表達及脂代謝指標(biāo)的影響，以探討其調(diào)節(jié)膽汁酸代謝與脂代謝的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 7周齡SPF級糖尿病模型的db/db雄性小鼠20只，體質(zhì)量22～28 g和7周齡SPF級db/m雄性小鼠10只，體質(zhì)量18～23 g均購自常州卡文斯實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（蘇）2016-0010，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物飼養(yǎng)室，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。本實驗方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：FJTCM IACUC 2021078）。

1.2 主要藥品與試劑 石斛合劑（組成：石斛15 g，知母10 g，黃芪20 g，丹參15 g，葛根10 g，黃連6 g，五味子10 g，地龍9 g，蒲公英15 g，大黃3 g）中藥飲片均購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院；葡萄糖（FBG）檢測試劑盒（批號：20210915）、糖化血清蛋白（GSP）檢測試劑盒（批號：20210915）、總膽固醇（TC）檢測試劑盒（批號：20210916）、三酯甘油（TG）檢測試劑盒（批號：20210916）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒（批號：20210916）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒（批號：20210916）和總膽汁酸（BA）檢測試劑盒（批號：20210917）均購自南京建成生物技術(shù)有限公司；FXR抗體（貨號：72105）、β-actin抗體（貨號：3700）均購自美國Cell Signal Technology公司；CYP7A1抗體（美國abcam公司，貨號：ab234982）。

1.3 主要儀器設(shè)備 INFINITE 200 PRO型酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；DU730型核酸-蛋白分析儀（美國BACKMAN公司）；Mini Protean垂直電泳-轉(zhuǎn)印裝置、化學(xué)發(fā)光顯像儀均購自美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 石斛合劑制備 將石斛合劑中藥飲片用2倍體積蒸餾水浸泡0.5 h，文火煎煮2 h，過濾濃縮，調(diào)整至含生藥量2 g/mL，滅菌后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以隨機數(shù)字表法將20只db/db小鼠分為模型組、中藥組，每組10只，將10只db/m小鼠設(shè)為正常組。中藥組按照臨床等效劑量換算，按10 mL/（kg·d）灌服2 g/mL石斛合劑；正常組和模型組小鼠灌服與中藥組等體積的生理鹽水。3組均每天2次，連續(xù)灌服4周。

2.3 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束后24 h，小鼠禁食不禁水8 h，以0.3%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉，眼部采集血液，分離血清于-80℃冰箱保存，用于血清學(xué)指標(biāo)檢測。然后脫頸處死小鼠，解剖取3組每只小鼠肝臟右側(cè)肝葉切分為2份，1份置于4%多聚甲醛固定，用于肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察，1份存儲于-80℃冰箱，用于檢測蛋白相對表達量。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.4.1 FBG與GSP檢測 FBG監(jiān)測采用葡萄糖氧化酶法，GSP檢測采用果糖胺法。

2.4.2 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA檢測 均采用以酶法檢測。

2.4.3 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肝組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，予以蘇木素-伊紅染色（HE染色），光鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。

2.4.4 Western blot檢測肝組織FXR和CYP7A1相對蛋白表達量 隨機抽選各組5份標(biāo)本，稱取約100 mg肝組織樣品加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液（含PMSF）冰上勻漿，在4℃條件下，以12 000 rpm離心15 min，取上清即為肝組織總蛋白，用BCA法測定提取液的總蛋白濃度，然后加入5×Loading Buffer，沸水浴10 min使蛋白變性；取30μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗FXR（1∶1 000）、抗CYP7A1（1∶1 000）和抗β-actin（1∶3 000），4℃搖動孵育過夜，洗膜后加二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光，Bio-Rad成像系統(tǒng)對蛋白條帶進行成像。以ImageJ凝膠圖像軟件檢測相應(yīng)區(qū)帶的光密度值（IA）。以IA目的蛋白/IAβ-actin結(jié)果表示目的蛋白質(zhì)的相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 3組小鼠血清FBG和GSP比較 見表1。

表1 3組小鼠血清FBG和GSP比較（±s） mmol/L

表1 3組小鼠血清FBG和GSP比較（±s） mmol/L

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常組模型組中藥組n 10 10 10 FBG 5.31±0.28 20.58±3.261）12.67±2.351）2）GSP 1.89±0.18 3.58±0.311）2.68±0.321）2）

3.2 3組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA比較 見表2。

表2 3組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA比較（±s）

表2 3組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常組模型組中藥組n 10 10 10 TC/（mmol/L）3.86±0.30 9.15±0.621）5.61±0.491）2）TG/（mmol/L）1.13±0.21 3.78±0.461）2.37±0.321）2）LDL-C/（mmol/L）2.04±0.18 6.15±0.441）3.95±0.411）2）HDL-C/（mmol/L）1.92±0.12 1.45±0.161）1.78±0.211）2）BA/（μmol/L）35.80±2.68 95.85±7.561）56.63±5.131）2）

3.3 3組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)比較 光鏡下可見，正常組肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉清晰，無明顯脂肪樣變性的細(xì)胞；模型組肝細(xì)胞排列不規(guī)則，肝小葉的邊界不清，可見大量玻璃樣、氣球樣性改變細(xì)胞，累及肝小葉約1/2；中藥組肝細(xì)胞排列較整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，可見少量氣球樣改變的肝細(xì)胞，并以小空泡為主，累及肝小葉約1/3。見圖1。

圖1 3組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)HE染色圖（×200）

3.4 3組小鼠肝組織FXR和CYP7A1相對蛋白表達量比較 見圖2。

圖2 3組小鼠肝組織FXR和CYP7A1相對蛋白表達量比較

4 討 論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇。飲食、勞欲、稟賦、情志等因素失衡，均可導(dǎo)致人體氣機郁結(jié)，積熱傷陰化燥，出現(xiàn)“消渴”。痰、熱、瘀、毒等是糖尿病常見的病理因素，本課題組以滋陰清熱、化瘀解毒為治療原則，運用清熱活血祛毒方石斛合劑治療糖尿病及其并發(fā)癥，取得較好療效。方中石斛、知母滋陰潤燥，壯水制火；黃芪補脾肺之氣；丹參活血祛瘀；黃連清熱利濕；五味子、葛根斂肺滋腎生津；地龍通經(jīng)活絡(luò)；蒲公英利濕清熱；大黃瀉熱逐瘀。

高脂血癥、肝脂肪變等是糖尿病常見臨床并發(fā)癥［8］。肝生成的膽汁酸作為乳化劑，能促進食物脂質(zhì)的消化與吸收，對高脂血癥與脂肪肝的發(fā)生有重要影響［9］。在膽汁酸生成的經(jīng)典途徑過程中，CYP7A1是膽汁酸轉(zhuǎn)化的限速酶，受FXR介導(dǎo)信號通路調(diào)控。當(dāng)肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)FXR與配體結(jié)合，能激活下游小異二聚體伴侶，誘導(dǎo)肝受體同源物l及肝核受體4α形成復(fù)合物，結(jié)合到CYP7A1基因調(diào)控序列從而抑制基因表達，減少膽汁酸生成；反之，當(dāng)FXR信號被抑制時，則促進膽汁酸生成［10］。

db/db小鼠是由于4號染色體的瘦素受體基因突變所引起的2型糖尿病模型動物，目前廣泛應(yīng)用于2型糖尿病及并發(fā)癥的實驗研究［11-12］。在本實驗中，模型組db/db小鼠與正常組比較，肝FXR相對蛋白表達量下降，CYP7A1相對蛋白表達量增加，血BA含量增加，這可能是TC、TG、LDL-C升高與肝細(xì)胞脂肪樣變性的重要原因之一。經(jīng)過4周石斛合劑的治療，與模型組比較，中藥組小鼠肝FXR相對蛋白表達量顯著增加，CYP7A1相對蛋白表達量減少，血BA含量下降，使TC、TG、LDL-C明顯下降，肝細(xì)胞脂肪樣變性減少。結(jié)果表明石斛合劑可能通過增加db/db小鼠肝FXR蛋白表達，抑制CYP7A1蛋白表達，減少BA生成，從而改善糖尿病模型小鼠的血脂紊亂，減輕肝組織脂肪樣變性。

由于FXR在體內(nèi)分布廣泛，參與眾多基因表達的調(diào)節(jié)，本實驗觀察到石斛合劑能增加糖尿病模型動物的肝FXR蛋白表達，為以FXR為靶點，深入探討中藥防治糖尿病及其并發(fā)癥提供新思路與可能性。