郭德軒，鄭亮，張寧，鄭小會(huì)，吳志軍1，，曹宏偉1，，張華1，

（2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，主要以嘔吐、腹瀉和脫水為特征，感染此病毒的哺乳仔豬死亡率高達(dá)100%[1]。自1971 年英國(guó)首次報(bào)道PED 以來(lái)[2-3]，該病在許多國(guó)家頻繁爆發(fā)。盡管已有部分PEDV 疫苗上市[4-5]，但疫情仍然持續(xù)爆發(fā)，給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，引發(fā)公共衛(wèi)生問題[6]，受到世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)和相關(guān)科研人員的關(guān)注。

PEDV 是導(dǎo)致PED 的病原體[7]。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV屬于冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，具有感染性，其基因組編碼了4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、囊膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N），16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1-nsp16）和ORF3[8]。在PEDV 全基因組中，其所編碼的E 蛋白是病毒最小的結(jié)構(gòu)蛋白，由76 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為8.8 kDa，它是位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，E蛋白決定病毒的形狀并參與病毒的復(fù)制[9]。此外，E 蛋白是一個(gè)離子通道蛋白，具有離子通道（Ion channel，IC）活性，有較強(qiáng)的疏水性[10]。有研究報(bào)道，冠狀病毒E 蛋白可分為三個(gè)不同的氨基酸區(qū)域，分別為NTD區(qū)域、跨膜區(qū)域和CTD 區(qū)域，并且該基因序列的保守性很高，不同冠狀病毒該區(qū)域的氨基酸數(shù)量有較小差別[11-12]。研究表明，PEDV E 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核內(nèi)，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13]。Zheng 等[14]發(fā)現(xiàn)PEDV E 蛋白能夠在IPEC-J2 細(xì)胞中表達(dá)，亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域。在研究中，通過分析PEDV E 蛋白生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，PEDV E 蛋白是具有一個(gè)跨膜區(qū)的跨膜蛋白，該區(qū)域是調(diào)控全長(zhǎng)蛋白的關(guān)鍵氨基酸區(qū)域。所以，推測(cè)該跨膜氨基酸區(qū)域可能在病毒蛋白亞細(xì)胞定位及行使功能過程中起到關(guān)鍵作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)的翻譯重要場(chǎng)所，是蛋白質(zhì)合成的主要細(xì)胞器，一方面選擇性運(yùn)出分泌蛋白和膜蛋白，另一方面保留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白以維持其結(jié)構(gòu)和功能[15]。對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的研究，有助于對(duì)其他細(xì)胞器蛋白定位及運(yùn)輸?shù)奶接慬16]。

為了驗(yàn)證此猜想，研究圍繞跨膜區(qū)氨基酸構(gòu)建了三種重組質(zhì)粒，并驗(yàn)證其正確表達(dá)后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞和IPEC-J2 細(xì)胞，檢測(cè)其重組蛋白分布情況以及亞細(xì)胞定位情況。為進(jìn)一步研究其跨膜區(qū)在E蛋白行使功能過程中起到何種作用奠定了基礎(chǔ)。尤其是對(duì)研究PEDV E 蛋白定位信號(hào)具有指導(dǎo)性，研究將有助于了解PEDV 包裝過程，更有助于進(jìn)一步探索PEDV 的發(fā)病機(jī)理和預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

pCMV-Myc 質(zhì)粒、pCMV-Myc-E 質(zhì)粒由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心509 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。DH5α 感受態(tài)細(xì)胞由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心509 實(shí)驗(yàn)室制備。豬小腸上皮細(xì)胞（IPECJ2）、人胚腎細(xì)胞（HEK-293T）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心509 實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與抗體

TRIzol 試劑（101002）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Rnase H-）、限制性內(nèi)切酶、Ex Taq 聚合酶均購(gòu)自Takara 公司；轉(zhuǎn)染試劑LippfectamineTM2000（11668019）購(gòu)自Invitrogen 公司；質(zhì)粒小提試劑盒（D6943-02）和膠回收試劑盒（D2500-02）購(gòu)自O(shè)mega 公司。小鼠抗Myc 標(biāo)簽單克隆抗體（TA-01）、TRITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（ZF-0313）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表在GenBank 網(wǎng)站中的PEDV CV777毒株基因序列報(bào)道，設(shè)計(jì)具有特異性的E 基因上下游引物，上游序列：5’-CCGGAATTCGGATGCTACAATTAGTGAATGATA-3’（EcoR I）和下游引物：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTACGTCAATAACAGTAC-3’（Not I）。E 蛋白截短基因E-T1 上下游引物，上游序列：5’-CCGGAATTCGGATGCTACAATTAGTGAATGATA-3’（EcoR I）和下游引物：5’-GGGGTACCCAGTTAACCAATTGGACGAAGGTA-3’（Kpn I），E 蛋白截短基因E-T2 上下游引物，上游序列：5’-CCGGAATTCGGATACTTTGGCTTTTCGTACT-3’（EcoR I）和下游 引 物：5’-GGGGTACCCAGTTAACCAATTGGACGAAGGTA-3’（Kpn I），E 蛋白截短基因E-T3 上下游引物，上游序列：5’-CCGGAATTCGGTGCTTCACTTGTCACCGGTTGTGTA-3’（EcoR I）和下游引物：5’-GGGGTACCTACGTCAATAACAGTACTGGGGAGGG-3’（Kpn I）。將E 基因插入到pCMV-Myc 的EcoR I/Not I 位點(diǎn)，將E-T1、E-T2、E-T3 基因插入到pCMVMyc 的EcoR I/Kpn I 位點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 的提取

采用TRIzol 法提RNA，從-80 ℃冰箱取出病變豬小腸，將組織用液氮研磨，收集在DEPC 水浸泡過高壓滅菌烘干（無(wú)RNA 酶）的1.5 mL 的離心管中，并加入500 μL 的Trizol 溶液，劇烈搖晃1 min 左右，靜置10~15 min，使組織充分裂解。取200 μL 的三氯甲烷溶液加入離心管中，立刻上下顛倒15 s，靜置12 min。13 200 r·min-1低溫高速離心10 min。離心后上下分層，吸取上清到新的DEPC 水浸泡過高壓滅菌烘干（無(wú)RNA 酶）1.5 mL 離心管中，再取600 μL 的異丙醇溶液加入管中，緩慢地上下顛倒15 s，放在冰盒中靜置12 min。13 200 r·min-1低溫高速離心15 min。吸棄掉600 μL 上清，吸取600 μL 的75%乙醇溶液到離心管，上下顛倒混勻，冰盒中靜置5 min，10 500 r·min-1低溫高速離心5 min。棄掉大部分上清，4 ℃離心，13 200 g 離心1 min。吸棄掉剩余液體，吹干酒精5 min，再加入20 μL 的DEPC 水，靜置15 min，使RNA 充分溶解。溶解后，檢測(cè)其總RNA 濃度標(biāo)記好，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR

取DEPC 水浸泡過高壓滅菌烘干（無(wú)RNA 酶）PCR 管，體系如下：模板0.5 μg，10 mM Oligo（dT）1 μL，DEPC 水2 μL。RT-PCR 的溫度設(shè)置：70 ℃運(yùn)行10 min，4 ℃保存。一個(gè)循環(huán)后放在冰中3 min 冷卻。之后向上述PCR 管中分別加入如下體系：5×MMLV buffer 2 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL，RTase M-MLV 0.5 μL，DEPC水1.5 μL。PCR 儀設(shè)置程序：30 ℃運(yùn)行10 min，42 ℃運(yùn)行60 min，70 ℃運(yùn)行15 min，4 ℃保存，一個(gè)循環(huán)后取出，放在冰上冰2 min。得到cDNA 樣品作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR 或于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

以cDNA 為模板進(jìn)行配置，體系如下：模板1 μL，dNTP 2.0 μL，10×PCR buffer 3.0 μL，上下游物各0.2 μL，Taq 酶0.13 μL，用ddH2O 補(bǔ)足20 μL。放到PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)行期間，配置1%瓊脂糖凝膠，待膠凝固后，點(diǎn)樣跑膠。跑完膠后切下帶有目的條帶的膠，進(jìn)行膠回收后，直接連接或保存在-20 ℃。

1.2.4 轉(zhuǎn)化

取出在16 ℃水浴鍋中的連接產(chǎn)物，置于DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，再放進(jìn)冰中冰浴30 min。時(shí)間結(jié)束之后，42 ℃熱激90 s，立刻放入冰中，靜置3 min。加入900 μL 無(wú)抗性LB 培養(yǎng)液，37 ℃搖晃復(fù)蘇30~60 min。復(fù)蘇后，5 000 r·min-1離心3 min，涂布于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，隨后倒置放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天觀察菌落，若有菌落出現(xiàn)，挑下菌落對(duì)應(yīng)抗性的培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，隨后使用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

將HEK-293T 和IPEC-J2 細(xì)胞進(jìn)行傳代，每孔500 μL 鋪板到24 孔板中，第二天觀察細(xì)胞長(zhǎng)到每孔的80%左右時(shí)，轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化得到的質(zhì)粒。先向離心管中加入適量的無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基，之后按照每孔800 ng 質(zhì)粒和每孔1 μL 脂質(zhì)體Lippfectamine TM2000 分別加進(jìn)去，靜置5 min。將裝有質(zhì)粒與脂質(zhì)體LippfectamineTM2000 的溶液混合，靜置20 min，將混合液加入到相應(yīng)的孔中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后將不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基換成10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）鑒定

待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h 后，從溫箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗細(xì)胞培養(yǎng)孔兩遍，多聚甲醛加入到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔500 μL，固定10 min。時(shí)間結(jié)束后，吸棄多聚甲醛，用PBS 清洗細(xì)胞孔三遍，15 min 換液洗一遍。每孔加入0.1%Trion-100（曲拉通）500 μL，透膜放置20 min，用PBS 清洗細(xì)胞孔三遍，15 min 換液洗一遍。每孔加入500 μL 的5%BSA封閉2 h，用PBS 清洗細(xì)胞孔三遍，15 min 換液洗一遍。用鼠源抗Myc 單克隆抗體（1∶500）作為一抗，室溫孵育2 h，用PBS 清洗細(xì)胞孔三遍，15 min 換液洗一遍。用TRITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶500）作為二抗室溫避光孵育2 h，用PBS 清洗細(xì)胞孔三遍，15 min換液洗一遍。用免疫熒光顯微鏡觀察PEDV E 以及E-T1、E-T2、E-T3 的蛋白表達(dá)，待正確表達(dá)后，用熒光封片劑DAPI 進(jìn)行壓片染核。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV E 基因、E-T1 基因、E-T2 基因和E-T3基因的擴(kuò)增

在感染PEDV 的病變豬小腸中含有PEDV 全基因組，所以研究利用Trizol 裂解法提取病變的豬小腸總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄的將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，用設(shè)計(jì)好的PEDV E 基因、E-T1 基因、E-T2 基因和E-T3 基因的上下游引物（含雙酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。已知PEDV E 蛋白的15-37 氨基酸區(qū)域是跨膜區(qū)域，研究圍繞此跨膜區(qū)構(gòu)建不同截短基因，最終得到對(duì)應(yīng)大小的PEDV E 基因、E-T1基因、E-T2 基因和E-T3 基因的片段，符合預(yù)期結(jié)果，結(jié)果如圖1。

圖1 PEDV E 基因、E-T1 基因、E-T2 基因和E-T3 的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of PEDV E gene，E-T1 gene，E-T2 gene and E-T3

2.2 E 基因、E-T1 基因、E-T2 基因、E-T3 基因及載體的雙酶切

利用對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I/Not I 切割E 基因以及pCMV-Myc 載體片段，用EcoR I/Kpn I 切割E-T1 基因、E-T2 基因、E-T3 基因片段，通過常規(guī)PCR 電泳得到相對(duì)應(yīng)的基因和載體的雙酶切條帶，符合預(yù)期結(jié)果，結(jié)果如圖2。

圖2 PEDV E 基因、E-T1 基因、E-T2 基因和E-T3 基因雙酶切Fig.2 Double restriction digestion of PEDV E gene，E-T1 gene，E-T2 gene and E-T3 gene

2.3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

經(jīng)過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒后，取重組質(zhì)粒pCMV-Myc-E 加入EcoR I/Not I 兩種限制性內(nèi)切酶、Myc-E-T1、Myc-E-T2 和Myc-E-T3 加入EcoR I/Kpn I 兩種限制性內(nèi)切酶，最后放入37 ℃水浴鍋酶切12 h 或過夜進(jìn)行雙酶切鑒定。通過常規(guī)PCR 電泳得到基因和載體相對(duì)應(yīng)片段的雙酶切鑒定條帶，符合預(yù)期結(jié)果，結(jié)果如圖3。

圖3 PEDV E 基因、E-T1 基因、E-T2 基因和E-T3 基因雙酶切鑒定Fig.3 Identification of PEDV E gene，E-T1 gene，E-T2 gene and E-T3 gene by double restriction digestion

2.4 免疫熒光鑒定重組質(zhì)粒的表達(dá)情況

將pCMV-Myc-E 質(zhì)粒、Myc-E-T1、Myc-E-T2和Myc-E-T3 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293T、IPEC-J2 細(xì)胞系24 h 后，利用間接免疫熒光方法檢測(cè)其核分布情況，結(jié)果顯示，在HEK-293T 細(xì)胞系內(nèi)，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-E 質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到了PEDV E 蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)上，并且發(fā)現(xiàn)Myc-E-T1 和Myc-E-T2分布在細(xì)胞質(zhì)中，與Myc-E 的分布極其相似；而Myc-E-T3 的細(xì)胞定位在整個(gè)細(xì)胞中，其中在細(xì)胞核的區(qū)域較多，在細(xì)胞質(zhì)的區(qū)域中較少，在IPEC-J2 細(xì)胞系內(nèi)有同樣的結(jié)果，結(jié)果如圖4。

圖4 PEDV E、T1、T2、T3 蛋白的間接免疫熒光檢查Fig.4 PEDV E，T1，T2，T3 protein indirect immunofluorescence（IFA）

2.5 亞細(xì)胞定位

轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-E 質(zhì)粒、Myc-E-T1、Myc-E-T2和Myc-E-T3 質(zhì)粒到HEK-293T、IPEC-J2 細(xì)胞系24 h 后，利用間接免疫熒光的方法檢測(cè)其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位情況，發(fā)現(xiàn)PEDV E 蛋白能夠定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，而T1 和T2 能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生強(qiáng)烈的共定位現(xiàn)象，與E 蛋白相似，但T3 則未見此定位情況，結(jié)果如圖5。綜上結(jié)果說明T1 和T2 可能行使著與E 蛋白類似的功能，而T3 則沒有。

圖5 PEDV E、T1、T2、T3 蛋白亞細(xì)胞定位Fig.5 PEDV E，T1，T2，T3 protein subcellular localization

3 討論

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的傳染性腸疾病，以嘔吐，腹瀉和脫水為病癥基本特征。20 世紀(jì)80 年代后該病在中國(guó)廣泛傳播，從那時(shí)起，PEDV 成為引起腹瀉最常見的病毒之一。2010 年10 月，由PEDV 變異毒株引起的PED大規(guī)模暴發(fā)，給全國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[17]。目前，PED 是中國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)最大威脅之一。PEDV 的高變異性越加復(fù)雜異構(gòu)，對(duì)高效疫苗的發(fā)展構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)，PEDV 的研究也將會(huì)越來(lái)越廣泛和深入。

E 蛋白是構(gòu)成PEDV 的結(jié)構(gòu)蛋白之一，能夠參與病毒囊膜的形成并且在病毒復(fù)制與出芽過程中發(fā)揮重要作用[18]。Xu 等[19]發(fā)現(xiàn)PEDV E 蛋白能夠在IEC細(xì)胞中表達(dá)，亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，產(chǎn)生非折疊蛋白，激活細(xì)胞中GRP78 的蛋白表達(dá)；同時(shí)，PEDV E蛋白對(duì)p65 蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)。PEDV E 蛋白跨膜區(qū)16-20AA 缺失和L25P 突變的新變異進(jìn)一步上調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)的產(chǎn)生，改善了IL-6 和IL-8 的表達(dá)，并在體外促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[20]。余麗蕓等[21]通過把PEDV 的E 基因?qū)爰撞《据d體系統(tǒng)，構(gòu)建成攜帶PEDV 的E 基因的重組SFV 病毒顆粒。

通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)[22]，PEDV E 蛋白是一個(gè)具有一個(gè)跨膜區(qū)的跨膜蛋白，推測(cè)跨膜區(qū)可能在蛋白行使功能中占有重要的地位。以PEDV E蛋白作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)通過其跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)建三個(gè)不同的截短基因，經(jīng)通過克隆技術(shù)后得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒Myc-E-T1、Myc-E-T2 與pCMV-Myc-E 蛋白類似，定位在細(xì)胞質(zhì)上并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生共定位，而Myc-E-T3 則沒有。說明T1 與T2 行使著與E 蛋白相同的功能。后續(xù)研究會(huì)更加深入地了解PEDV 生物學(xué)以及致病機(jī)制，并為開發(fā)有效疫苗和控制策略提供理論基礎(chǔ)。