李樂斌 張景麗 馮 光 舒 駿 林子翔 張建隆 婁建英黃文斌*

（1 溫州市神鹿種業(yè)有限公司，浙江溫州 325014；2 瑞安市神鹿農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江溫州 325200）

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物育種、種子純度鑒定、品種真實性鑒定等方面，而基因組DNA 提取則是其第一步。植物基因組DNA 的提取方法逐漸由繁入簡，一些簡便的提取方法得到快速發(fā)展，如堿煮法（趙國珍 等，2012；李委 等，2018）、濾紙吸附法（Zou et al.，2017；楊璐 等，2019；王沙沙 等，2020）等。濾紙吸附法是近些年開發(fā)的新方法，吸附有DNA 的濾紙片可以直接作為PCR 模板，也可以將其上的DNA 溶出到雙蒸水里再用于PCR 擴(kuò)增?？焖佾@得基因組DNA 有助于分子標(biāo)記技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，比如在苗期快速鑒別蘆筍（L.）的性別。

蘆筍是雌雄異株植物，其性別發(fā)育受到位于Y 染色體上的非重組性別決定區(qū)域影響，其中性別關(guān)鍵基因是（）和（）（Harkess et al.，2017）。在自然環(huán)境下有極少數(shù)的雄株（基因型XY，雄蕊正常、雌蕊敗育）會產(chǎn)生兩性花（雄蕊正常、雌蕊正常），能夠自花或異花授粉結(jié)實，產(chǎn)生XX ♀∶XY ♂∶YY ♂=1∶2∶1的后代，其中YY 雄株（也被稱為超雄株）的花粉具有活力，它是蘆筍全雄品種選育的關(guān)鍵。然而，YY 雄株與XY 雄株在表型上沒有明顯差異，通常采用測交法，從測交后代花期的性狀來判斷父本的基因型（XX × YY → XY，XX × XY → 1XX +1XY），一般需要2～3 年。Y 染色體連鎖的分子標(biāo)記（如MSSTS710、asp1-T7 sp、asp1-T7）的開發(fā)使得測交后代在幼苗期就能檢測性別（Jamsari et al.，2004；Nakayama et al.，2006；Kanno et al.，2014）。周勁松等（2012）使用雄性顯性標(biāo)記asp1-T7 和asp1-T7 sp 在蘆筍幼苗期檢測測交后代的性別，從兩性株自交后代的14 株雄株中篩選出2 株超雄株。蘆筍完成全基因組測序后，周勁松等（2017）以基因為基礎(chǔ)開發(fā)了4 個相關(guān)標(biāo)記，Mitoma 等（2018）針對基因開發(fā)了AspMSD標(biāo)記。但是這些標(biāo)記都是Y 連鎖顯性標(biāo)記，鮮見共顯性標(biāo)記和X 連鎖標(biāo)記的相關(guān)研究報道，且對兩性株自交后代里超雄株的篩選仍需進(jìn)行測交試驗。直至Harkess 等（2020）證實了（）基因位于蘆筍X 染色體上，且Y 染色體上不具有等位基因。那么通過檢測該基因就可能實現(xiàn)XY 雄株和YY 雄株的區(qū)分，從而減少篩選年限。

本試驗應(yīng)用改良的濾紙吸附法（濾紙圓盤法）快速提取蘆筍基因組DNA 并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；通過兩步法來區(qū)分蘆筍兩性株自交后代的不同性別基因型：先使用標(biāo)記aspMSE1-xy 或aspTDF1-y 篩選出雄株（XY 和YY），再使用標(biāo)記aspWIP2/NTT-x剔除XY 雄株，判定剩余的雄株為YY 型。

1 材料與方法

1.1 供試材料

二倍體綠蘆筍XX 雌株、XY 雄株和四倍體紫蘆筍XXXX 雌株、XXXY 雄株的擬葉樣品采集于溫州市神鹿種業(yè)有限公司種質(zhì)資源圃，用于性別連鎖標(biāo)記驗證的YY 雄株擬葉樣品由杭州浙豐農(nóng)業(yè)科技有限公司提供（表1）。

表1 供試蘆筍類型及名稱

蘆筍兩性株自交種子于2020 年8 月采收自溫州市神鹿種業(yè)蘆筍種質(zhì)資源圃編號為48-2 的兩性株，播種后正常發(fā)芽生長的有14 株（48-2-01～48-2-14），后定植于育種材料圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 濾紙圓盤法提取DNA ①濾紙圓盤的制備。濾紙采用Whatman雙圈定性慢速濾紙（鹽城六品商貿(mào)有限公司），使用打孔器制備直徑3 mm的濾紙圓盤，用竹牙簽稍微插入圓盤中間，整個置于玻璃培養(yǎng)皿，包好、滅菌、烘干，用于吸附核酸。

② DNA 提取。按照Zou 等（2017）的方法并適當(dāng)改良：取蘆筍擬葉樣品0.05 g 置于2.0 mL 離心管中，加入2 顆直徑3 mm 的不銹鋼珠，將離心管放入液氮中速凍10 s，取出后快速用SCIENTZ-48高通量組織研磨器破碎（50 Hz、15 s，寧波新芝生物科技有限公司，下同），之后加入1.0 mL DNA裂解液〔20 mmol·LTris（pH 8.0），25 mmol·LNaCl，2.5 mmol·LEDTA，0.05% SDS〕，渦旋混勻約10 s。將準(zhǔn)備好的濾紙圓盤浸入裂解混合物中5 s 吸附核酸，再把圓盤轉(zhuǎn)移到1.0 mL 清洗液〔10 mmol·LTris（pH 8.0），0.1% Tween-20〕中浸泡5 s，以去除表面吸附的雜質(zhì)，然后將圓盤存留于30μL無菌雙蒸水里，即為DNA 溶出液。

1.2.2 試劑盒提取DNA 取蘆筍擬葉樣品0.05 g，用組織研磨器破碎后，按照試劑盒〔DP350，天根生化科技（北京）有限公司〕操作說明書提取DNA，最后用150 μL 無菌雙蒸水洗脫。將該DNA溶液稀釋10 倍作為PCR 模板使用。用于性別連鎖標(biāo)記驗證的蘆筍DNA 均使用試劑盒提取。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測 標(biāo)記asp1-T7sp 的引物依照Nakayama 等（2006）的方法合成；標(biāo)記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 的 引物分別根據(jù)其基因序列使用Primer Premier 5 設(shè)計（表2）。25 μL PCR 反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix Ⅱ 12.5 μL〔KT211，天根生化科技（北京）有限公司〕，上下游引物（5 μmol·L）各1.0 μL，模板〔DNA 溶出液1.0 μL（或3.0 μL）或吸附有DNA 的濾紙圓盤〕，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR 程序均為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，30 個（或35 個）循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

表2 PCR 擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙圓盤法快速提取蘆筍基因組DNA

蘆筍擬葉基因組DNA 可以使用濾紙圓盤法提取，但DNA 濃度較低（圖1）。吸附有DNA 的濾紙圓盤可以直接作為PCR 模板，也可以使用其溶出液作為PCR 模板（圖2-A）。使用溶出液作為模板時，低濃度的DNA 模板會影響PCR 特異DNA片段的濃度（以條帶的相對亮度體現(xiàn)），但不影響PCR 的結(jié)果（表現(xiàn)陽性或陰性）。蘆筍擬葉裂解液在4 ℃存放14 d 后仍能作為模板擴(kuò)增出目的片段（圖2-B）。因此，濾紙圓盤法提取的DNA 可以用于特異DNA 片段的PCR 擴(kuò)增，便于快捷鑒定蘆筍性別基因型。

圖1 試劑盒和濾紙圓盤法提取的蘆筍DNA

圖2 濾紙圓盤及其溶出液的蘆筍標(biāo)記asp1-T7sp PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 蘆筍性別連鎖標(biāo)記的驗證

隨著蘆筍性染色體研究的深入，新的標(biāo)記逐漸得到開發(fā)應(yīng)用。蘆筍基因、和的研究結(jié)果顯示其均與性別相關(guān)（Murase et al.，2017；Harkess et al.，2017，2020），可以根據(jù)它們的基因序列設(shè)計引物用于蘆筍性別的鑒定。標(biāo)記aspMSE1-xy 在雄株上有472 bp 和261 bp 兩條特異DNA 片段，在雌株上只有1 條261 bp 特異DNA 片段；并且，無論雌雄株，該標(biāo)記在約1 000 bp 處有1 條亮度較淺的DNA 片段，且亮度隨著DNA 模板濃度的增大而增強(qiáng)，但其不影響雌雄株的區(qū)分。標(biāo)記aspTDF1-y 在雄株上有1 條472 bp特異DNA 片段，雌株則沒有該特異DNA 片段。標(biāo)記aspWIP2/NTT-x 在XY 雄株和雌株上有1 條346 bp 特異DNA 片段，而超雄株沒有該特異DNA片段（表2）。這3 個標(biāo)記在二倍體綠蘆筍和四倍體紫蘆筍上均呈現(xiàn)相同的特異性DNA 片段（圖3、4）。通過組合使用aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 能夠區(qū)分蘆筍性別基因型XX、XY、YY。

圖3 標(biāo)記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 在綠蘆筍上的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 標(biāo)記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 在紫蘆筍上的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 兩性株自交后代性別鑒定

14 株兩性株48-2 自交后代用濾紙圓盤法提取DNA，以溶出液（溶出時間為2 h）作為PCR 模板，使用標(biāo)記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 結(jié)果顯示（圖5）：超雄株（YY）有4 株，普通雄株（XY）有7 株，雌株（XX）有3 株。兩性株的性別基因型是XY，自交后代應(yīng)呈YY∶XY∶XX=1∶2∶1 分離；經(jīng)檢驗，YY∶XY∶XX=4∶7∶3，符合1∶2∶1分離比。田間花器官調(diào)查結(jié)果顯示后代48-2-06、48-2-08 和48-2-09 開雌花，其余11 株開雄花，與PCR 結(jié)果相符。說明標(biāo)記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 聯(lián)用可以鑒別蘆筍兩性株自交后代性別基因型。

圖5 48-2 兩性株自交后代PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本試驗驗證了濾紙圓盤法提取的蘆筍DNA 可用于PCR 反應(yīng)，且用該方法提取了兩性株48-2自交后代幼苗的DNA 作為模板，組合使用蘆筍性染色體連鎖標(biāo)記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 來鑒別蘆筍性別基因型，成功從中篩選出了超雄株。

DNA 濾紙吸附法大多使用44 mm × 2 mm 濾紙條，濾紙條被分成40 mm × 2 mm 疏水手柄區(qū)（使用石蠟浸漬）和4 mm × 2 mm 核酸結(jié)合區(qū)。本試驗中，用竹牙簽代替疏水手柄區(qū)，簡化了操作，且滅菌烘干后可長期存放和隨時使用。盡管濾紙圓盤吸附的DNA 較少，但不影響其應(yīng)用于特異性PCR，且其溶出液可用于多次PCR 反應(yīng)。其作為一種快速提取DNA 的方法，適用于現(xiàn)場快檢領(lǐng)域，通常直接使用濾紙圓盤或者短時溶出液作為快速PCR的檢測模板。在操作過程中發(fā)現(xiàn)使用濾紙圓盤直接作為PCR 模板時，不能使用液體石蠟來封閉PCR混合液而要使用帶蓋的PCR 管或者使用熱蓋，因為濾紙圓盤會吸附液體石蠟、破壞封閉效果使得PCR 混合液蒸發(fā)。此外，也會出現(xiàn)濾紙圓盤吸附的DNA 量太少而PCR 結(jié)果呈陰性的現(xiàn)象。高濃度的DNA 溶液可以通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取效果，低濃度的DNA 溶液通常使用看家基因標(biāo)記驗證提取效果。標(biāo)記aspMSE1-xy 在蘆筍雌雄株上均有特異DNA 片段，類似于蘆筍看家基因標(biāo)記，可用于驗證DNA 提取效果，同時又可區(qū)分蘆筍性別。

標(biāo)記aspMSE1-xy 利用了X 染色體上基因（）的第3 個外顯子相對于Y 染色體上基因（）發(fā)生211 bp 的缺失突變，使得XX 雌株具有261 bp 的PCR 產(chǎn)物，XY 雄株具有261 bp 和472 bp 的PCR 產(chǎn)物，但是本試驗ZF01、ZF02 超雄株和兩性株48-2 后代YY 超雄株的PCR產(chǎn)物仍為261 bp 和472 bp，這與預(yù)想的結(jié)果不符（預(yù)想結(jié)果為YY 雄株只具有472 bp 的PCR 產(chǎn)物，通過該標(biāo)記能夠同時區(qū)分XX、XY、YY 基因型）。被認(rèn)為是擬南芥的同源基因，即蘆筍的基因。本試驗PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記aspMSE1-xy 和aspTDF1-y檢測的是同一基因（標(biāo)記aspMSE1-xy 472 bp 的PCR 產(chǎn)物序列與標(biāo)記aspTDF1-y 的PCR 產(chǎn)物序列在NCBI 里進(jìn)行Blast 比對后均指向蘆筍同一個基因，且兩者的PCR 產(chǎn)物序列比對后有340 bp 序列完全一致）。蘆筍的基因（）位于Y 染色體的非重組性別決定區(qū)域，而發(fā)生了3 次插入突變使得其全長至少在30 kb 以上（僅為2.5 kb），且在第2 個內(nèi)含子內(nèi)發(fā)生了大片段插入突變（Murase et al.，2017），這可能導(dǎo)致其第3 個外顯子被擠出與Y 染色體非重組性別決定區(qū)域相對應(yīng)的區(qū)域，進(jìn)而與Y 染色體的可重組區(qū)域發(fā)生了重組，使得標(biāo)記aspMSE1-xy 在ZF01、ZF02 超雄株和兩性株48-2 后代YY 超雄株的PCR 產(chǎn)物中同時具有261 bp 和472 bp 兩條特異性片段，而261 bp DNA 片段在Y 染色體中的具體位置則需進(jìn)一步研究確認(rèn)。已有的研究顯示標(biāo)記asp1-T7 和asp1-T7sp 位于基因周圍（盛文 濤，2020），標(biāo) 記aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和AspMSD 則是基于基因開發(fā)的，在實際應(yīng)用中這兩組標(biāo)記相互配合使用，能夠更準(zhǔn)確地區(qū)分蘆筍的性別。

蘆筍Y 染色體上非重組性別決定區(qū)域被預(yù)測有13 個候選基因，其中有12 個基因在XX 雌性中缺失（周勁松 等，2017），這可能是Y 連鎖顯性標(biāo)記研究發(fā)展較快的原因之一。然而，蘆筍X 染色體連鎖的標(biāo)記開發(fā)進(jìn)展緩慢，Gebler 等（2007）篩選到了一個與雌性連鎖的RAPD 標(biāo)記，盧龍斗等（2006）也鑒定到1 條雌性多態(tài)性擴(kuò)增片段并轉(zhuǎn)化成了SCAR 標(biāo)記，但是這些標(biāo)記通用性差，在育種實踐中難以利用?；蚴钱?dāng)前唯一能被確認(rèn)是蘆筍X 染色體專有的基因，以此開發(fā)的標(biāo)記aspWIP2/NTT-x 能夠區(qū)分出XY 雄株和YY雄株。本試驗中篩選出的YY 雄株也在進(jìn)行測交試驗，以便進(jìn)一步驗證標(biāo)記aspWIP2/NTT-x的可靠性。

蘆筍YY 雄株的獲得除了兩性株自交外，還可以通過花藥培養(yǎng)的方式獲得。XY 雄株的花藥可經(jīng)誘導(dǎo)生成胚狀體，繼而發(fā)育成芽；這些胚狀體或芽包含由性細(xì)胞發(fā)育而成的配子體（單倍體，Y 型或X 型）和由花藥體細(xì)胞發(fā)育而成的孢子體（二倍體，XY 型）。盡管使用染色體計數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法可以區(qū)分出配子體和孢子體，但是配子體內(nèi)的Y型單倍體植株和X 型單倍體植株仍需等到花期才能分辨出來。X 染色體連鎖標(biāo)記和Y 染色體連鎖標(biāo)記的組合使用在胚狀體或芽期就能區(qū)分Y、X 基因型，再對篩選出的Y 型培養(yǎng)物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測或染色體計數(shù)以確定其為雄性單倍體，這將極大地提高花藥培養(yǎng)效率。