唐笑 王桂香劉凡 韓碩 宗梅 郭寧 段蒙蒙

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

基因編輯是一種可以在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。目前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)在植物的遺傳基礎(chǔ)理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因功能研究和利用基因的靶向修飾進(jìn)行性狀改良是基因編輯應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，在模式植物和大田作物中都有大量報(bào)道。蔬菜是人們獲取人體所需要的維生素和微量元素的主要來源，基因編輯技術(shù)目前已成功應(yīng)用在多種蔬菜作物中。隨著功能基因組研究日漸深入，通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行功能基因研究和性狀改良是蔬菜分子育種的必然方向。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程

基因編輯的原理就是構(gòu)建一個(gè)人工核酸內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），DSB 在被細(xì)胞內(nèi)的DNA 修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。基因編輯技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵是核酸內(nèi)切酶的使用，常用的核酸內(nèi)切酶能夠有效切割DNA，但它們通常在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行識別和切割，特異性較差。基因編輯的發(fā)展歷程就是研究者對不同類型核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和改造的過程?；蚓庉嫵Ｓ玫暮怂醿?nèi)切酶主要分為四類：巨型核酸酶（meganuclease，MegNs）（Choulika et al.，1995）、鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）（Wah et al.，1998）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）（Zhang et al.，2014）和成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)（clusters of regularly spaced short palindromic repetition systems，CRISPR/Cas）（Cho et al.，2013）。

1.1 巨型核酸酶

在20 世紀(jì)80 年代后期發(fā)現(xiàn)的巨型核酸酶是一種脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，可以識別一段12～40 bp的DNA 序列，這種專一的長序列在DNA 鏈上重復(fù)出現(xiàn)的頻率低，保證了其切割的特異性，但由于其對特定長序列的需求和巨大的酶體，導(dǎo)致其剪切效率低，應(yīng)用難（Silva et al.，2011）。

1.2 鋅指核酸酶

由于巨型核酸酶的缺陷，鋅指核酸酶取代了巨型核酸酶。ZFNs 是一種人工融合蛋白，包括DNA識別域和核酸內(nèi)切酶I。DNA 識別域由一系列Cys-His 鋅指蛋白（zinc-fingers，ZFPs）串聯(lián)組成，每個(gè)ZFP 識別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。Kim等（1996）首次將3 個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域（能夠識別9 個(gè)核苷酸）與I 的C 端內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域通過一段連接蛋白融合，制造出第一個(gè)嵌合型核酸內(nèi)切酶—ZFNs，并在體外證明該酶對靶DNA 具特異剪切能力。ZFNs 的DNA 識別域能識別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由I 構(gòu)成的切割域具有剪切功能，針對目的基因設(shè)計(jì)特異性ZFPs，再將DNA 識別域與I 結(jié)合就可使靶位點(diǎn)產(chǎn)生DSB。細(xì)胞可以通過同源重組（HR）修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)機(jī)制來修復(fù)DNA。HR 修復(fù)有可能會(huì)對靶位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修復(fù)，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變，從而達(dá)到基因改造的目的。

基于ZFNs 的基因編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿Α５悄壳坝?方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣：一是，以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的ZFNs，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；二是，持續(xù)表達(dá)ZFNs 對細(xì)胞有毒性；三是，雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)（李想 等，2017）。

1.3 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶

鑒于ZFN 技術(shù)的局限性，人們致力于尋找更為有效、特異性更強(qiáng)的基因編輯工具。2009 年，兩組研究人員同時(shí)報(bào)道了TALE 蛋白能特異性識別并結(jié)合DNA 序列（Boch et al.，2009；Moscou &Bogdanove，2009），TALEN 技術(shù)由此應(yīng)運(yùn)而生。Christian 等（2010）將TALE蛋白與I核酸內(nèi)切酶融合構(gòu)成人工TALEN 核酸酶，一系列TALEN 蛋白串聯(lián)起來可組成DNA 識別域，每一個(gè)TALEN 蛋白能識別并結(jié)合一段14～20 bp 的堿基序列，I 核酸內(nèi)切酶形成二聚體時(shí)可以切割雙鏈DNA。TALEN 技術(shù)是一種理論上能夠?qū)θ我釪NA目的序列進(jìn)行靶向遺傳修飾的基因編輯技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因敲入或轉(zhuǎn)錄激活等靶向基因組編輯的里程碑。

目前TALEN 技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動(dòng)物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢，設(shè)計(jì)更簡單、特異性更高，但仍然有脫靶效應(yīng)、TALEN 與靶序列的特異性結(jié)合受到染色體位置及鄰近序列影響等問題存在（李想 等，2017）。

1.4 成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是繼ZFN 和TANEN 技術(shù)之后最新發(fā)現(xiàn)的第三代基因編輯技術(shù)，更簡單有效，應(yīng)用前景更廣闊。

CRISPR 是細(xì)菌和古細(xì)菌基因末端的多組DNA序列與反向序列以及30 bp 左右的空格序列（spacer DNA）串聯(lián)成簇的、間隔規(guī)律的短回文重復(fù)序列。該結(jié)構(gòu)最早是在Ishion 等（1987）對大腸桿菌的堿性磷酸酶基因研究中被發(fā)現(xiàn)。隨后，Jansen等（2002）進(jìn)一步研究了原核生物中的該重復(fù)DNA 序列，將該結(jié)構(gòu)命名為CRISPR，同時(shí)確定了4 個(gè)CRISPR相關(guān)基因（-，）。在不同物種中根據(jù)Cas 蛋白不同將CRISPR 系統(tǒng)分為3 大類、10 小類，其中依賴Cas9 蛋白的CRISPR 系統(tǒng)屬于第2 類，最簡單常用（Lino et al.，2018）。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由Cas9 核酸內(nèi)切酶、具有靶向特異性的CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）3 種 元件組成。crRNA 通過堿基配對與tracrRNA 結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，通過人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以將其改造、整合形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（single guide RNA），能引導(dǎo)Cas9 蛋白對DNA 的定點(diǎn)切割（Jinek et al.，2012）。sgRNA的特異識別功能依賴靶序列下游3′末端的一段保守結(jié)構(gòu)—PAM（proto-spacer adjacent motifs），tracrRNA/crRNA 復(fù)合物在PAM 序列上游切割DNA造成DSB，并啟動(dòng)DNA 損傷修復(fù)機(jī)制。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡單，在多基因編輯應(yīng)用方面更簡單高效，僅需設(shè)計(jì)sgRNA，就能同時(shí)進(jìn)行多基因編輯，并且靶向精確、脫靶率低、細(xì)胞毒性低、更廉價(jià)簡便，深受研究人員的青睞。

2 基因編輯技術(shù)在蔬菜中的研究應(yīng)用

目前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)在植物的遺傳基礎(chǔ)理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，植物基因的靶向修飾是基因編輯技術(shù)應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域?；蚓庉嫾夹g(shù)可以通過修飾內(nèi)源基因來幫助設(shè)計(jì)所需的植物性狀，在模式植物和大田作物中都有大量報(bào)道；蔬菜作物種類繁多，基礎(chǔ)研究較大田作物稍落后，主要在茄科、十字花科及葫蘆科這三大科常見蔬菜中研究較多。本文對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行匯總，介紹了基因編輯技術(shù)在以上三大科主要蔬菜作物中的研究概況（表1）。

表1 主要蔬菜作物中的基因編輯研究

續(xù)表

2.1 茄科蔬菜中基因編輯技術(shù)的研究應(yīng)用

茄科蔬菜的基因編輯技術(shù)主要在番茄、馬鈴薯、辣椒上報(bào)道較多。

2.1.1 番茄中基因編輯技術(shù)的研究 番茄（）屬于茄科番茄屬二倍體作物，在全世界廣泛栽培，其基因組已經(jīng)完成測序，遺傳轉(zhuǎn)化方法也比較成熟，是理想的蔬菜基因編輯技術(shù)研究材料。目前在番茄中已有大量基因編輯相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道（張愛萍 等，2022）。

Hilioti 等（2016）首次證實(shí)了基于ZFNs 的基因編輯技術(shù)在番茄上的有效性，通過對番茄--（）基因不同位點(diǎn)的編輯改造，證實(shí)了的DNA 結(jié)合域上游序列的改變可導(dǎo)致包括番茄果實(shí)在內(nèi)的多種表型變異。

Lor 等（2014）首次在番茄基因編輯中成功使用TALEN 技術(shù)，該研究的靶基因（）是番茄中唯一報(bào)道的DELLA 家族基因，而DELLA 蛋白是赤霉素（GA）信號的負(fù)調(diào)控因子。該研究通過基因編輯產(chǎn)生錯(cuò)義突變導(dǎo)致部分活性喪失，從而確定在番茄GA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。

Brooks 等（2014）首次利用靶向基因（），將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于番茄基因編輯，發(fā)現(xiàn)敲除的番茄突變體植株葉片呈針狀而不是正常的扁平復(fù)葉。?ermák等（2015）比較了TALENs 和CRISPR/Cas9 在番茄上的基因編輯效率，該研究在控制花青素生物合成的基因上游插入一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，導(dǎo)致花青素在番茄組織中過表達(dá)和異位積累。在這次基因編輯中，超過2/3 的插入是精確的，并且沒有檢測到脫靶修飾，TALENs 和CRISPR/Cas9 都以相似的效率實(shí)現(xiàn)了基因靶向編輯。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)逐漸取代了ZFN和TALEN技術(shù)。Danilo 等（2018）以番茄花色苷合成基因?yàn)榘谢颍肅RISPR/Cas9 系統(tǒng)在番茄上實(shí)現(xiàn)了同源介導(dǎo)（homology directed repair，HDR）的外源基因插入。Li 等（2018a）通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在番茄中進(jìn)行多基因編輯，該研究同時(shí)敲除了類胡蘿卜素代謝途徑中的多個(gè)基因，抑制了番茄紅素向α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了番茄紅素的生物合成和積累。隨后，以CRISPR/Cas9 為主的基因編輯技術(shù)就在番茄上廣泛應(yīng)用，在產(chǎn)量、抗病性、非生物脅迫等基因挖掘到性狀改良上都取得了快速進(jìn)展（Shimatani et al.，2019；Pramanik et al.，2021；Tran et al.，2021）。最近，根據(jù)玉米和擬南芥上的研究基礎(chǔ)，Zhong 等（2022）通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)改造（）基因，首次在番茄上創(chuàng)制了單倍體誘導(dǎo)系，揭開了蔬菜倍性育種的新篇章。

2.1.2 馬鈴薯中基因編輯技術(shù)的研究 馬鈴薯（L.）是世界上重要的主食作物之一，屬于茄科茄屬的雜合四倍體作物。目前利用CRISPR/Cas9 技術(shù)已經(jīng)成功在馬鈴薯中實(shí)現(xiàn)了定向誘變。

Veillet 等（2019）采用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功編輯了馬鈴薯的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（granulebound starch synthase，GBSS）基因，使淀粉合成受阻。Sevestre 等（2020）利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了1 個(gè)新發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯淀粉合成酶基因，其結(jié)果顯示：在基因第二外顯子末端有一個(gè)保守序列（GT1），該序列作為靶點(diǎn)在CRISPER/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯中表現(xiàn)出較高的基因編輯效率。

多酚氧化酶類（polyphenol oxidases，PPOs）是一種含銅酶，廣泛分布于高等植物中，能夠催化多種酚類化合物氧化成各自的醌類物質(zhì)。醌類物質(zhì)可以進(jìn)行自聚合，與蛋白質(zhì)中的氨基酸或自由基反應(yīng)，形成深色沉淀物，這一過程即為“酶促褐變”，是水果和蔬菜品質(zhì)降低的原因。González 等（2020）通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除基因，顯著降低了馬鈴薯塊莖的PPOs 活性，褐變程度也明顯減輕。

馬鈴薯是一種高度雜合的四倍體作物，其品種內(nèi)和品種間基因組呈現(xiàn)高度雜合性和多態(tài)性，也是基因編輯策略和設(shè)計(jì)中要重點(diǎn)考慮的技術(shù)難點(diǎn)。Carlsen 等（2022）發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體這類細(xì)胞池水平上的高編輯效率，對在四倍體中實(shí)現(xiàn)全等位基因敲除至關(guān)重要，該研究通過聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)、CRISPR/Cas 核糖核蛋白顆粒（ribonucleoprotein complex，RNP）瞬時(shí)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，獲得編碼葡聚糖水二激酶（GWD）和霜霉病抗性6（-）基因的編輯植株。高編輯效率減少了下游繁瑣而復(fù)雜的離體再生程序，而且用兩個(gè)或多個(gè)RNP 同時(shí)靶向兩個(gè)靶區(qū)中的任意一個(gè)，均對基因編輯產(chǎn)生明顯的正協(xié)同效應(yīng)。這些初步發(fā)現(xiàn)可能會(huì)引發(fā)更大規(guī)模的研究，以促進(jìn)和優(yōu)化植物的精確育種。

2.1.3 辣椒中基因編輯技術(shù)的研究 辣椒（L.）屬于茄科辣椒屬，是亞熱帶和溫帶國家最廣泛栽培的茄科物種。辣椒于2014年完成基因組測序，為其基因編輯技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

Li 等（2020）基于辣椒Zunla-1 參考基因組完成了辣椒全基因組的編輯位點(diǎn)鑒定和特異性分析，確定了辣椒基因組的1 組高度特異的CRISPR/Cas9編輯位點(diǎn)。該套編輯位點(diǎn)具有廣泛的適用性，有助于將辣椒中CRISPR/Cas9 的脫靶率降至最低，有效應(yīng)對CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。

辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化受組織培養(yǎng)條件的限制，不同基因型組織培養(yǎng)能力差距大。Woo 等（2015）發(fā)現(xiàn)Cas9/sgRNA 核糖核蛋白復(fù)合物RNP 直接應(yīng)用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以獲得無外源基因插入的編輯植株，減少了前期組織培養(yǎng)步驟，也是辣椒基因編輯技術(shù)研究的適宜方向。Kim 等（2020）利用來源于葉片和愈傷組織的辣椒原生質(zhì)體做受體，進(jìn)行RNP 轉(zhuǎn)染，在辣椒CM334 和甜椒Dempsey 中實(shí)現(xiàn)了對植物病原尤其是白粉病病原具有廣譜抗性的目標(biāo)基因的編輯。該研究為在一定程度上突破組織培養(yǎng)的限制、實(shí)現(xiàn)RNP 途徑的基因編輯技術(shù)在辣椒上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

盡管目前已有辣椒全基因組序列和基因組編輯工具，但由于缺乏穩(wěn)定的辣椒轉(zhuǎn)化體系，致使辣椒的精確基因編輯仍處于起步階段。為此，Park 等（2021）采用3 種農(nóng)桿菌菌株AGL1、EHA101、GV3101，選擇2 個(gè)辣椒品種辣椒CM334、甜椒Dempsey，選用pBAtC 作為CRISPR/Cas9 基因編輯載體，優(yōu)化了篩選劑磷化氫蓖麻毒素（PPT）濃度，結(jié)果顯示：GV3101 在甜椒Dempsey 中得到了更好的轉(zhuǎn)化編輯效果。

2.2 十字花科蔬菜中基因編輯技術(shù)的研究應(yīng)用

十字花科蔬菜種植最為廣泛的兩個(gè)屬分別是蕓薹屬（）和蘿卜屬（），其中蘿卜屬的基因編輯研究鮮有報(bào)道。蕓薹屬包括多種重要蔬菜作物，主要有3 個(gè)二倍體基本種，即白菜（，2=20，AA）、甘藍(lán)（，=18，CC）、黑芥（，2=16，BB），以及三者之間相互雜交、經(jīng)過不斷選擇進(jìn)化得到的3 個(gè)異源四倍體復(fù)合種，即甘藍(lán)型油菜（，2=38，AACC）、芥菜型油菜（，2=36，AABB）和埃俄比亞芥（，2=34，BBCC）。目前基因編輯研究報(bào)道較多的是在白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜上。

2.2.1 白菜類蔬菜中基因編輯技術(shù)的研究 白菜類蔬菜包括7 個(gè)變種，常見的有大白菜（L.ssp.）、普通白菜（L.ssp.Makino）、菜薹（L.var.Tsen et Lee）等。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，白菜基因組和育種研究都取得了快速的發(fā)展。

大白菜作為一種重要的大宗蔬菜，種植范圍廣泛、歷史悠久。生產(chǎn)者最初選擇了開花晚的大白菜品種來提高產(chǎn)量，但是晚開花的大白菜需要經(jīng)過冷處理數(shù)周才能誘導(dǎo)開花，最終收獲種子。這種晚熟春化誘導(dǎo)開花的特性延長了大白菜的育種年限，阻礙了大白菜相關(guān)遺傳研究的快速開展。為了解決這一問題，Jeong 等（2019）利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將目標(biāo)突變引入（）基因，培育出不需要春化即可早開花的大白菜（和的雙敲除突變體），加快了繁育進(jìn)程。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)和之間存在功能冗余。

硫化氫（hydrogen sulfide，HS）是植物細(xì)胞內(nèi)源信號分子，對植物的生長、發(fā)育和抗逆性具有重要的調(diào)節(jié)作用，而L-半胱氨酸脫巰基酶（L-cysteinedesulfydrase，LCD）是合成內(nèi)源HS的關(guān)鍵酶（尚玉婷 等，2018）。馬曉麗等（2018）采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對大白菜基因進(jìn)行敲除，基因編輯植株中內(nèi)源HS 含量有不同程度的降低，為研究HS 信號在大白菜中的生理作用及育種應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

姜明亮（2020）選取孤基因（orphan genes）（）及其高度同源基因（）為靶基因，在大白菜中創(chuàng)制高效靶向突變，降低了果糖、葡萄糖和可溶性糖的含量，但蔗糖含量和蔗糖合成酶活性明顯增加，推測可能依賴蔗糖合成途徑影響可溶性糖代謝。該研究為白菜功能基因組的研究提供了重要技術(shù)支撐，同時(shí)對深入研究孤基因影響可溶性糖代謝的作用機(jī)制提供了材料和理論參考。

菜薹又稱菜心，為不結(jié)球白菜類型中以幼嫩花莖為主要食用器官的常規(guī)栽培種，雖然在食用廣度和栽培面積上不如大白菜，但其生育周期短，播種至產(chǎn)品收獲僅需40～60 d，是研究白菜類蔬菜轉(zhuǎn)化技術(shù)的理想材料。國家蔬菜工程技術(shù)研究中心生物技術(shù)室在菜薹原位轉(zhuǎn)化成功的基礎(chǔ)上（Liu et al.，1998），結(jié)合CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，以四九菜心為試材，番茄紅素脫氫酶基因（）為靶基因，采用真空滲透原位轉(zhuǎn)化方法，獲得了無外源片段插入的基因編輯植株（宗梅 等，2022）。

2.2.2 甘藍(lán)類蔬菜中基因編輯技術(shù)的研究 甘藍(lán)類蔬菜為十字花科蕓薹屬的一年生或兩年生草本植物，包括多個(gè)變種，常見的有結(jié)球甘藍(lán)（var.L.）、羽衣甘藍(lán)（var.DC.）、花椰菜（.var.L.）和青花菜（L.var.Plenck）等。甘藍(lán)自交不親和性強(qiáng)，必須通過低溫誘導(dǎo)開花，生育期長，變種內(nèi)遺傳基礎(chǔ)狹窄，基因編輯技術(shù)對高效創(chuàng)制甘藍(lán)的遺傳突變、實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種改良起到重要作用。

Ma 等（2019）設(shè)計(jì)了1 種基于內(nèi)源tRNA 處理的CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對結(jié)球甘藍(lán)的多位點(diǎn)和多基因突變。該研究以番茄紅素脫氫酶基因、S-位點(diǎn)受體激酶基因和雄性不育相關(guān)基因?yàn)榘谢?，采用串?lián)tRNA-sgRNA 結(jié)構(gòu)的載體表達(dá)多個(gè)sgRNA，結(jié)果顯示：基因敲除的植株表現(xiàn)白化矮小，作為可視標(biāo)記直接驗(yàn)證該基因編輯系統(tǒng)的可行性；基因突變完全抑制了結(jié)球甘藍(lán)的自交不親和性，將自交不親和系轉(zhuǎn)化為自交親和系；而基因突變產(chǎn)生了1 個(gè)雄性不育突變體，由于同時(shí)發(fā)生基因突變，該突變體在開花期與其非突變等位基因雜交兼容，從而使該雄性不育系能夠通過蜜蜂介導(dǎo)的異花授粉進(jìn)行繁育。

Sun 等（2018a）首次報(bào)道了CRISPR/Cas9 技術(shù)在羽衣甘藍(lán)上的應(yīng)用，該研究以類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因?yàn)榘悬c(diǎn)，使羽衣甘藍(lán)兩個(gè)同源基因同時(shí)發(fā)生定點(diǎn)突變，為羽衣甘藍(lán)基因功能研究和分子育種提供了技術(shù)支撐。該課題組在此技術(shù)基礎(chǔ)上，對羽衣甘藍(lán)類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（）進(jìn)行編輯，共獲得13個(gè)突變體，突變率高達(dá)81.25%；雙等位基因突變株和純合突變株的總類胡蘿卜素和葉綠素含量均降低，總水平下降了11.89%～36.33%，葉片顏色從綠色變?yōu)辄S色，創(chuàng)制了黃色羽衣甘藍(lán)新種質(zhì)（Sun et al.，2020）。

單堿基編輯技術(shù)（base editing）是在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基礎(chǔ)上添加一些酶，實(shí)現(xiàn)對DNA 的單個(gè)堿基進(jìn)行替換，具有高效而又精確的基因編輯能力，可在動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)引入點(diǎn)突變，用于培育具有理想表型的基因編輯動(dòng)植物。例如：Cas9 蛋白與胞嘧啶脫氨酶組成融合蛋白可以實(shí)現(xiàn)胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的單堿基轉(zhuǎn)換，被稱為BE3（APOBEC1-XTEN-nCas9-UGI，第三代堿基編輯器）系統(tǒng)（Tian et al.，2018）；腺嘌呤單堿基編輯器（簡稱ABE），可以對目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效腺嘌呤（A）到鳥嘌呤（G）的單堿基轉(zhuǎn)換（Liu et al.，2022）。北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所生物技術(shù)研究室在花椰菜基因編輯技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，通過BE3 系統(tǒng)對花椰菜的乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）基因和著絲粒特異組蛋白變體（centromerespecific histone H3 variant）基因進(jìn)行單堿基編輯突變，突變率為22%～87%，創(chuàng)制了高抗除草劑的花椰菜新種質(zhì)（Wang et al.，2022）。

2.2.3 甘藍(lán)型油菜中基因編輯技術(shù)的研究 甘藍(lán)型油菜（L.）作為重要的油料作物，基因組和基因編輯相關(guān)研究較多，在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、花色、育性等多種性狀中都有研究報(bào)道（楊文文等，2021）。通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，Karunarathna等（2020）同時(shí)敲除甘藍(lán)型油菜中含油量相關(guān)的和兩個(gè)基因，獲得了種子含油量明顯增加的突變體植株；Khan 等（2021）敲除CYP78A6 家族基因，突變體植株角果和種子變小，但單株種子數(shù)量和質(zhì)量增加；Sriboon等（2020）敲除開花調(diào)控基因的5 個(gè)拷貝，發(fā)現(xiàn)敲除其中1 個(gè)拷貝（）后，植株出現(xiàn)早花表型，而敲除其他拷貝，則對開花時(shí)間沒有明顯影響；Liu 等（2020a）發(fā)現(xiàn)，敲除甘藍(lán)型油菜中兩個(gè)參與類胡蘿卜素合成的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因和，改變了花瓣中類胡蘿卜素的積累，紫黃素含量降低，葉黃素含量升高，從而導(dǎo)致了橘色花的產(chǎn)生；Xin 等（2020）發(fā)現(xiàn)，敲除Y127 株系中的Ms5 基因或敲除Westar 株系中的Ms5 基因，均會(huì)導(dǎo)致雄性不育，進(jìn)一步研究顯示，Ms5 通過與Ms5 或Ms5 形成無功能的異源二聚體而顯性抑制Ms5 或Ms5 的功能，從而導(dǎo)致雄性不育。

Wu 等（2020a）利用基于鼠源胞嘧啶脫氨酶的單堿基編輯器BE3，將基因197 位密碼子上的C 轉(zhuǎn)化為T，獲得的P197S 油菜突變體表現(xiàn)出耐除草劑苯磺隆的表型。Cheng 等（2021）利用基于人源胞嘧啶脫氨酶的單堿基編輯器，突變油菜基因，發(fā)現(xiàn)和的P197F（根據(jù)擬南芥的ALS 序列編號）突變均能賦予油菜抗苯磺隆除草劑的能力。且這兩個(gè)拷貝同時(shí)突變的油菜植株比突變單個(gè)拷貝的植株能夠耐受更高濃度的除草劑，說明突變介導(dǎo)的除草劑抗性具有一定的劑量效應(yīng)。

2.3 葫蘆科蔬菜中基因編輯技術(shù)的研究應(yīng)用

葫蘆科是世界上重要的可食用植物科之一，其重要性僅次于禾本科、豆科和茄科，其中包括黃瓜、南瓜、絲瓜、西瓜等常見的蔬菜和瓜果。然而，這些作物中大多數(shù)尚未建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。葫蘆科蔬菜中基因編輯的研究報(bào)道大多在黃瓜和西瓜上。

2.3.1 黃瓜中基因編輯技術(shù)的研究 黃瓜（L.）屬于葫蘆科黃瓜屬的二倍體蔬菜作物，其基因編輯的相關(guān)報(bào)道大都是利用CRISPR/Cas9技術(shù)。

以色列科學(xué)家采用CRISPR/Cas9 技術(shù)首次在黃瓜中開展抗病毒研究（Chandrasekaran et al.，2016）。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA，以黃瓜（真核翻譯起始因子4E）基因?yàn)榘谢?，獲得了一系列靶點(diǎn)缺失和插入突變的植株。用黃瓜葉脈黃化病毒（CVYV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）和番木瓜環(huán)斑型花葉病毒（PRSV-W）接種突變株和野生型黃瓜植株，基因編輯純合突變株表現(xiàn)出廣泛的病毒抗性。

Hu 等（2017）利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯了抑制黃瓜心皮發(fā)育的基因，成功獲得了全雌系材料，提高了產(chǎn)量。短瓜基因編碼1 種葫蘆科特異的環(huán)型E3 連接酶，其突變可導(dǎo)致自身泛素化和降解增強(qiáng)，同時(shí)造成乙烯合成速率限制酶ACS2 的積累，Xin 等（2019）成功通過CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了和這2 個(gè)基因的編輯突變體，并研究了其調(diào)控乙烯合成和黃瓜果實(shí)伸長的分子機(jī)制。Zhang 等（2020a）成功實(shí)現(xiàn)了對短瓜基因的CRISPR/Cas9 編輯，驗(yàn)證了通過促進(jìn)細(xì)胞增殖調(diào)控黃瓜果實(shí)伸長。基因?qū)儆赥CP（PROLIFERATING CELL FACTORS）基因家族，Yang 等（2020）成功獲得基因的CRISPR/Cas9 突變體，揭示了基因通過直接調(diào)控乙烯的合成來控制黃瓜莖卷須的形態(tài)和攀緣。

毛狀根誘導(dǎo)系統(tǒng)因其生長快、遺傳穩(wěn)定性高，可作為研究基因表達(dá)和功能的有效方法，也被證實(shí)是評估CRISPR/Cas9 系統(tǒng)用于基因組編輯活動(dòng)的有效工具（Jacobs &Martin，2016）。Nguyen 等（2022）對黃瓜根瘤菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，為驗(yàn)證植物轉(zhuǎn)化載體、CRISPR/Cas9 構(gòu)建活性以及選擇黃瓜基因編輯的靶向gRNA 提供了有效工具，建立的毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為黃瓜和其他植物基因組的編輯技術(shù)優(yōu)化和進(jìn)一步研究提供了重要信息和新的思路。

2.3.2 西瓜中基因編輯技術(shù)的研究 西瓜（）屬于葫蘆科西瓜屬一年生蔓生藤本植物。西瓜是葫蘆科中第2 個(gè)基因組編輯成功的物種（Tian et al.，2017，2018）。

Tian 等（2017）采用CRISPR/Cas9 技術(shù)對西瓜的（phytoene desaturase）基因進(jìn)行精確編輯。該研究獲得的轉(zhuǎn)化苗幾乎達(dá)到了100%的編輯效率，所有的轉(zhuǎn)基因西瓜植株都帶有S 突變，并表現(xiàn)出明顯的或鑲嵌式的白化表型。隨后，Tian等（2018）利用基于CRISPR/Cas9 的單堿基編輯器特異性突變乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）基因的Pro190 位點(diǎn)，獲得了抗除草劑苯磺隆的西瓜新種質(zhì)。Zhang 等（2020c）采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除了編碼植物磺肽素（Phytosulfokine，PSK）前體的基因，以增強(qiáng)西瓜對尖孢鐮刀菌（，F(xiàn)ON）的抗性。

雖然西瓜遺傳轉(zhuǎn)化取得了一些進(jìn)展，但從組織培養(yǎng)到再生仍然具有挑戰(zhàn)性。Feng 等（2021）根據(jù)小麥中的研究結(jié)果，通過共表達(dá)生長調(diào)節(jié)因子4（GRF4）和GRF-相互作用因子1（GIF1），改善西瓜再生，在西瓜中實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)化，并與基因組編輯工具相結(jié)合，在西瓜中實(shí)現(xiàn)了高效的基因編輯，成功地創(chuàng)制了二倍體無籽西瓜。該研究為今后西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究和育種提供了有力的理論基礎(chǔ)。

3 總結(jié)與展望

基因編輯技術(shù)作為生命科學(xué)的顛覆性技術(shù)，已在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。CRISPR-Cas 系統(tǒng)的出現(xiàn)加速了基因編輯技術(shù)的發(fā)展，基因編輯工具的開發(fā)和應(yīng)用日新月異，具有更廣泛的目標(biāo)、更高的效率和特異性，以及更高的精度。目前，基因編輯技術(shù)已被應(yīng)用于植物中各種可遺傳的基因組修飾，例如：隨機(jī)插入/缺失（InDels），點(diǎn)突變或核苷酸替換，同源基因和多基因突變，堿基編輯器（base editor），先導(dǎo)編輯器（prime editor），HDR 介導(dǎo)的基因替換、點(diǎn)突變、DNA 插入和刪除，以及有針對性的染色體重排等（Liu et al.，2022）。在技術(shù)的持續(xù)拓展及延伸下，基因編輯將在更廣泛的領(lǐng)域帶來更大的社會(huì)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蔬菜作為人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚氖澄镏?，是提供人體必需的多種維生素和礦物質(zhì)的主要來源。蔬菜中的VK、VC、有機(jī)硫化物和硝酸鹽對慢性疾病的預(yù)防有益，鉀、鎂、膳食纖維、類胡蘿卜素等成分有利于預(yù)防心腦血管疾病。針對蔬菜的這些特征定向育種，對一些優(yōu)良性狀進(jìn)行聚合和改良，提高蔬菜的產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)和口感一直是育種家和消費(fèi)者共同追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)育種方法不但易受種間生殖隔離的限制、不良基因連鎖的影響，而且育種年限很長?；蚓庉嫾夹g(shù)優(yōu)勢明顯，可以克服以上困難，在性狀改良上表現(xiàn)出良好的靶向性和易用性，發(fā)展空間巨大，應(yīng)用前景廣闊。

蔬菜作物種類繁多，基因組學(xué)研究基礎(chǔ)差距大，較大田作物在遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯研究上都相對滯后。但基因編輯工具是相通的，最新的基因編輯工具已經(jīng)很快應(yīng)用到蔬菜作物中，如花椰菜和西瓜中的單堿基編輯器（Tian et al.，2018；Wang et al.，2022），番茄和甘藍(lán)型油菜上的同源基因和多基因編輯（Zhai et al.，2020；Tran et al.，2021），同源介導(dǎo)基因編輯的外源基因插入（Danilo et al.，2018），以及RNP的應(yīng)用（Kim et al.，2020），等等。雖然蔬菜基因編輯研究上取得了很多亮點(diǎn)，但在一些蔬菜中還存在缺乏高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的瓶頸問題，如辣椒、西瓜、南瓜、白菜、茄子等，缺乏適用于多種基因型的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)可用于編輯的功能基因研究也是核心問題。

圍繞當(dāng)前基因編輯技術(shù)在蔬菜作物中存在的問題，無轉(zhuǎn)化體系的蔬菜作物應(yīng)盡快建立適宜的轉(zhuǎn)化體系。首先可以根據(jù)不同蔬菜作物的特性，研究建立不同外植體、不同轉(zhuǎn)化途徑的技術(shù)體系。例如：番茄以子葉、葉片和下胚軸為外植體，花椰菜以下胚軸和花序軸為外植體都有成功的轉(zhuǎn)化體系建立（Brooks et al.，2014；Hilioti et al.，2016；Wang et al.，2022）。對一些難以轉(zhuǎn)化和再生的作物，如辣椒、茄子、西葫蘆等，可探索以大孢子、小孢子、原生質(zhì)體、花粉粒等為受體的轉(zhuǎn)化編輯體系。同時(shí)不依賴遺傳轉(zhuǎn)化、直接獲得無外源基因插入的基因編輯材料顯得更具優(yōu)勢，例如：通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因的瞬時(shí)表達(dá)（Iaffaldano et al.，2016；Chen et al.，2018b），以及RNP 原生質(zhì)體侵染等（Woo et al.，2015；Murovec et al.，2018）。本課題組也在蕓薹屬菜薹上探索不依賴組織培養(yǎng)的原位轉(zhuǎn)化編輯體系，并取得了一些進(jìn)展（宗梅 等，2022）。因此，建立和完善不同蔬菜作物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，努力探索不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因途徑是蔬菜作物基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用的研究方向。

另外，隨著基因組的大規(guī)模測序，蔬菜功能基因組的研究也迅速發(fā)展。通過基因組測序和大數(shù)據(jù)分析，根據(jù)大田和模式作物的研究基礎(chǔ)快速高效鑒定蔬菜中對應(yīng)的功能基因，針對蔬菜作物性狀特點(diǎn)結(jié)合正向遺傳和反向遺傳明確農(nóng)藝性狀的控制基因，再結(jié)合基因編輯技術(shù)鑒定基因功能和作用機(jī)制。可編輯的功能基因研究和基因編輯技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用是相互促進(jìn)、相輔相成的。

雖然基因編輯技術(shù)在蔬菜上的研究已經(jīng)取得了大量進(jìn)展，但在不同種類蔬菜作物上的廣泛應(yīng)用還有很多問題需要解決。隨著蔬菜基因組研究的逐漸深入和發(fā)展，技術(shù)的不斷完善和延續(xù)，基因編輯技術(shù)作為最具潛力的基因組改造工具必將在蔬菜作物功能基因研究和分子育種應(yīng)用中發(fā)揮重大作用。