祁先宇 張文亮 楊盼盼 徐雷鋒* 明 軍*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

百合（spp.）是具有較高營養(yǎng)價(jià)值的高檔蔬菜，也是觀賞花卉，還是我國重要的藥用植物（龍雅宜和張金政，1998）。京鶴是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的具有自主產(chǎn)權(quán)的賞食兼用型優(yōu)質(zhì)百合品種，不僅抗逆性較強(qiáng)，而且鱗莖營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)含量也較高，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，亟須進(jìn)行大規(guī)模繁殖示范推廣（袁素霞 等，2016）。

分球繁殖和鱗片扦插是百合生產(chǎn)上常用的繁殖方式，但是這些繁殖方式繁殖系數(shù)低，且易積累病毒，影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)（馬生軍 等，2018）。植物組織培養(yǎng)是一種可以保障作物品種優(yōu)良特性的高效、現(xiàn)代化、工廠化原種生產(chǎn)方法。在百合組織培養(yǎng)中，鱗莖不定芽的分化培養(yǎng)是提高百合組培苗繁殖系數(shù)的關(guān)鍵步驟。常規(guī)的不定芽誘導(dǎo)分化是依據(jù)百合品種差異選用不同的細(xì)胞分裂素與生長素，不定芽誘導(dǎo)率較低，介于2.00%～4.88%之間（蘇菁華，2014；Islam et al.，2017；Sharifi et al.，2017；陳姝男，2018；張旭紅 等，2018；Gao et al.，2018；Mohebodini et al.，2018；Sahoo et al.，2018；李茂娟 等，2019；李卓憶，2019；張文婷 等，2019；Royandazagh，2019；符勇耀 等，2020；Patil et al.，2021；Yang et al.，2021）。

草甘膦作為目前使用最廣泛、安全的除草劑之一（Krimsky，2022），雖然其作用機(jī)制的研究已經(jīng)比較清楚（Amrhein et al.，1980；Stephen，2019），但是目前未見草甘膦在百合及其他植物組織培養(yǎng)再生方面的研究報(bào)道。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所百合課題組前期在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因京鶴百合的試驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)低濃度草甘膦對(duì)京鶴鱗片不定芽誘導(dǎo)具有顯著的促進(jìn)作用，且誘導(dǎo)率顯著高于常規(guī)組織培養(yǎng)再生分化體系；本課題組雖然建立了常規(guī)的京鶴不定芽誘導(dǎo)體系，但誘導(dǎo)系數(shù)（4.32）、生根系數(shù)（14.78）仍不高，且沒有進(jìn)行鱗莖增殖方面的試驗(yàn)。因此，本試驗(yàn)首次使用草甘膦為誘導(dǎo)分化劑，以鱗片為外植體，優(yōu)化京鶴高效組培再生體系，以期為百合鱗片不定芽誘導(dǎo)、組培苗生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018 年4 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。供試百合品種京鶴為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所自主培育，所選材料為秋季采收的生長健壯、無病蟲害的種球中層鱗片，種球直徑10～15 cm。試驗(yàn)用草甘膦（Glyphosate）含量為95%（德國，Sigma，P9556-5G）。

1.2 試驗(yàn)方法

采用MS 固體培養(yǎng)基〔MS 基本培養(yǎng)基（含維生素），瓊脂7 g·L，pH 值5.8〕，于121 ℃條件下滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度為（25 ± 1）℃，暗培養(yǎng)。

1.2.1 草甘膦誘導(dǎo)京鶴鱗片不定芽試驗(yàn) 以本課題組已有的京鶴不定芽分化培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+30 g·L蔗糖）為基礎(chǔ)，設(shè)置4 個(gè)草甘膦濃度處理：CK1，0 mg·L；T1，2.5 mg·L；T2，5.0 mg·L；T3，7.5 mg·L。取京鶴健康種球鱗片，洗凈后用10%次氯酸鈉溶液浸泡滅菌15 min，再用無菌蒸餾水清洗3 遍，然后用解剖刀切割成1 cm × 1 cm 的小方塊，接種于添加不同濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基上。每處理3 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)接種30 個(gè)外植體；置于室溫25℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，40 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)系數(shù)。

不定芽誘導(dǎo)系數(shù)=不定芽數(shù)/接種的外植體數(shù)

1.2.2 6-BA、NAA 對(duì)京鶴不定芽增殖的影響 鱗片接種培養(yǎng)40 d 后，將上一試驗(yàn)最佳條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)接到添加不同濃度6-BA 與NAA的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)（MS+30 g·L蔗糖）。設(shè)置6 個(gè)6-BA 與NAA 濃度處理組合：J1，0.5 mg ·L6-BA+0.1 mg·LNAA；J2，0.5 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA；J3，1.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA；J4，1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA；J5，2.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA；J6，2.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)接種30 個(gè)外植體；置于室溫25 ℃、暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，60 d 后統(tǒng)計(jì)再生成的小鱗莖數(shù)，計(jì)算不定芽增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=再生小鱗莖數(shù)/接種外植體數(shù)

1.2.3 蔗糖對(duì)京鶴不定芽鱗莖膨大的影響 在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置4 個(gè)蔗糖濃度處理：Z1，30 g·L；Z2，60 g·L；Z3，90 g·L；Z4，120 g ·L。將上一試驗(yàn)最佳條件下得到的直徑1 cm 左右的小鱗莖轉(zhuǎn)接至不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基中，每處理3 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)接種30 個(gè)小鱗莖；置于室溫25 ℃、暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行鱗莖膨大培養(yǎng)，30 d 后轉(zhuǎn)接1 次，60 d 后統(tǒng)計(jì)各鱗莖的直徑。

1.2.4 NAA 對(duì)京鶴膨大鱗莖生根的影響 在1/2MS+30 g·L蔗糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置4 個(gè)NAA 濃度處理：CK2，0 mg·L；G1，0.1 mg·L；G2，0.2 mg·L；G3，0.3 mg·L。將最佳條件下膨大培養(yǎng)60 d 后的鱗莖接種到添加不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基中，每處理3 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)接種30 個(gè)膨大鱗莖；置于室溫25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計(jì)所有鱗莖的總根數(shù)，計(jì)算生根系數(shù)。

生根系數(shù)=總根數(shù)/接種的鱗莖數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，使用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對(duì)京鶴鱗片不定芽誘導(dǎo)分化的效果

不同濃度的草甘膦對(duì)京鶴鱗片不定芽的誘導(dǎo)分化有顯著影響，鱗片內(nèi)側(cè)密集分化產(chǎn)生了大量小仔球，而常規(guī)的不定芽分化培養(yǎng)基處理（CK1）只是在傷口處形成小仔球（圖1）。

圖1 草甘膦對(duì)京鶴單個(gè)鱗片不定芽的誘導(dǎo)分化

從表1 可以看出，T1 處理的誘導(dǎo)系數(shù)最高，為6.46，顯著高于其他處理；其次是CK1 和T2 處理，T3 處理最低。據(jù)觀察，T2 和T3 處理的部分外植體有褐化死亡的情況，尤其是T3 處理，褐化死亡率較高（圖2）。由此可見，低濃度草甘膦對(duì)京鶴不定芽分化具有顯著的促進(jìn)作用，隨著濃度升高，不定芽誘導(dǎo)受到阻礙，甚至出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象。因此，本試驗(yàn)條件下2.5 mg·L草甘膦最有利于京鶴鱗片誘導(dǎo)不定芽。

圖2 不同濃度草甘膦對(duì)京鶴鱗片不定芽的誘導(dǎo)情況

表1 不同濃度草甘膦誘導(dǎo)分化京鶴鱗片不定芽的效果

2.2 6-BA 和NAA 對(duì)京鶴不定芽的增殖效果

從表2 可以看出，不同濃度的6-BA 和NAA對(duì)京鶴不定芽增殖系數(shù)無顯著影響，表明京鶴在不定芽增殖期對(duì)6-BA 和NAA 不敏感（圖3）。J1 處理不定芽增殖系數(shù)最大，6-BA 與NAA 用量較低，定為本次試驗(yàn)京鶴鱗片不定芽增殖的最適組合。

表2 不同濃度6-BA 和NAA 對(duì)京鶴不定芽增殖的影響

圖3 不同濃度6-BA 和NAA 對(duì)京鶴不定芽增殖的影響

2.3 蔗糖對(duì)京鶴不定芽鱗莖膨大的影響

從表3 可以看出，在蔗糖濃度為30～90 mg·L時(shí)，京鶴不定芽鱗莖直徑隨著蔗糖濃度的提高而增大；當(dāng)蔗糖濃度為90 mg·L時(shí)，平均鱗莖直徑達(dá)2.64 cm；而當(dāng)蔗糖濃度為120 mg·L時(shí)，鱗莖直徑不升反降。以上說明，本試驗(yàn)條件下90 mg·L蔗糖最有利于京鶴不定芽鱗莖的膨大生長。

表3 不同濃度蔗糖對(duì)京鶴不定芽鱗莖膨大的影響

2.4 NAA 對(duì)京鶴膨大鱗莖生根的影響

從表4 可以看出，G2 和G3 處理的京鶴膨大鱗莖（組培苗）生根系數(shù)顯著高于CK2 和G1 處理，其中G3 處理的根也比其他處理更粗壯（圖4）。考慮到組培苗后期移栽種植時(shí)，健康、粗壯的根是必要的條件，所以本試驗(yàn)選擇0.3 mg·LNAA 作為京鶴組培苗生根階段最合適的濃度。

表4 不同濃度NAA 對(duì)京鶴膨大鱗莖生根的影響

圖4 不同濃度NAA 對(duì)京鶴膨大鱗莖生根的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 草甘膦在京鶴鱗片不定芽分化中的作用

前人已經(jīng)建立了多種百合的組織培養(yǎng)再生體系，如金黃花滇百合（張文婷 等，2019）、歐洲百合（張旭紅 等，2018）、蘭州百合（Yang et al.，2021）、毛百合（張艷波，2013）、亞洲百合（楊薇紅 等，2004）、Caesars Palace（李茂娟 等，2019）、東方百合Starfighter（Youssef et al.，2019）、白花百合（Royandazagh，2019；Patil et al.，2021）等，并且在百合不定芽誘導(dǎo)研究中一般使用細(xì)胞分裂素與生長素。

本試驗(yàn)在進(jìn)行百合鱗片不定芽誘導(dǎo)、分化時(shí)，在常規(guī)培養(yǎng)組分6-BA、NAA 與蔗糖基礎(chǔ)上，首次使用草甘膦作為誘導(dǎo)分化劑。結(jié)果表明，低濃度（2.5 mg·L）草甘膦對(duì)京鶴不定芽的誘導(dǎo)分化效果顯著高于常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)外植體都能分化不定芽，誘導(dǎo)系數(shù)達(dá)到6.46，顯著優(yōu)于前人的試驗(yàn)結(jié)果（楊薇紅 等，2004；張艷波，2013；蘇菁華，2014；Bakhshaie et al.，2016；馬生軍等，2018；Mohebodini et al.，2018；張文婷 等，2019；符勇耀等，2020；Patil et al.，2021）；并且，本試驗(yàn)中使用不同濃度6-BA、NAA 與30 g·L蔗糖的常規(guī)誘導(dǎo)結(jié)果，也比有些使用細(xì)胞分裂素或生長素組合與不同濃度蔗糖的試驗(yàn)誘導(dǎo)系數(shù)高（Sahoo et al.，2018；Lestari et al.，2019；Youssef et al.，2019；Deswiniyanti &Lestari，2020；Filippova et al.，2020）。

3.2 草甘膦在百合鱗片分化中的可能機(jī)制及應(yīng)用

已有研究表明，植物體內(nèi)存在一種重要的合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑，在莽草酸途徑中，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）與莽草酸-3-磷酸（S3P）生成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，這步反應(yīng)需要5-稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶（EPSPS）的催化，才能進(jìn)行之后的反應(yīng)并最終形成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（Amrhein et al.，1980）。草甘膦可以通過與磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)合并形成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，競(jìng)爭(zhēng)性的抑制EPSPS，阻斷苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成來達(dá)到殺死雜草的效果（Jaworski，1972；Stephen，2019）。天然植物生長素活性成分IAA 的合成分為依賴色氨酸和非依賴色氨酸兩條途徑，依賴色氨酸的合成途徑又分為吲哚乙醛肟途徑、吲哚丙酮酸途徑、色胺途徑和吲哚乙酰胺途徑，在這些依賴色氨酸的途徑中，色氨酸作為合成IAA 的重要前體物質(zhì)，經(jīng)過一系列酶的催化合成吲哚-3-乙醛肟、色胺、吲哚-3-丙酮酸等中間產(chǎn)物，并最終合成IAA，色氨酸的缺失會(huì)影響植物體內(nèi)生長素的合成（王家利 等，2012）。本試驗(yàn)中，草甘膦的加入可能阻斷了京鶴百合鱗片內(nèi)部色氨酸的合成，進(jìn)而使生長素合成受阻，導(dǎo)致內(nèi)源細(xì)胞分裂素和生長素的比值升高，促進(jìn)了鱗片不定芽的分化，其相關(guān)作用機(jī)制尚需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

草甘膦常用于轉(zhuǎn)基因材料的抗性篩選，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)安全問題。草甘膦是否也可以促進(jìn)其他百合品種不定芽的分化有待進(jìn)一步研究。

綜上，本試驗(yàn)建立了草甘膦誘導(dǎo)京鶴鱗片不定芽分化的高效方法，獲得最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+2.5 mg·L草甘膦+30 g·L蔗糖），誘導(dǎo)系數(shù)達(dá)到6.46，顯著高于常規(guī)培養(yǎng)基；并以此為基礎(chǔ)，獲得了最佳繼代增殖培養(yǎng)基（MS+0.5 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+30 g·L蔗糖）、鱗莖膨大培養(yǎng)基（MS+90 g·L蔗糖）以及生根培養(yǎng)基（1/2MS +0.3 mg·LNAA+30 g·L蔗糖），建立了優(yōu)良百合品種京鶴的高效再生體系，為百合鱗片不定芽誘導(dǎo)、組培苗生產(chǎn)提供了新的思路。