邵長軒，黨安凱，戰(zhàn)昭含，來振衡，朱永杰，單安山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，哈爾濱150030)

近幾十年來，抗生素在畜牧業(yè)中的不合理使用已導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和畜產(chǎn)品抗生素殘留問題，這些耐藥菌不僅造成了難以治療的畜禽疾病，還能通過動(dòng)物相關(guān)食品傳播到人類，嚴(yán)重威脅人類健康，當(dāng)下新型抗生素的研發(fā)速度相比于耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生和變異的速度已趨于緩慢。早在2006年,歐盟就實(shí)行了“飼料全面禁抗”，而在2019年7月10日，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了第194號(hào)公告，公布了“全面禁止促生長類藥物飼料添加劑”的決議，因此，尋找綠色、安全、高效的抗生素替代品已經(jīng)成為當(dāng)前迫切需要解決的問題。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是宿主先天性免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的小分子多肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌活性以及免疫調(diào)節(jié)功能，還可促進(jìn)上皮傷口愈合，用于人類疾病的治療。根據(jù)當(dāng)前抗菌肽數(shù)據(jù)庫(Antimicrobial Peptide Database，APD)的最新結(jié)果顯示，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過3 000種具有多樣序列和結(jié)構(gòu)的天然AMPs，在微生物、植物、無脊椎動(dòng)物、以及更復(fù)雜的兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等多物種中廣泛存在，其主要的物理破膜殺菌機(jī)制使病原體不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性突變，因此有望成為新一代抗生素替代物。

抗菌肽的分類依據(jù)多樣，例如：根據(jù)物種來源、合成機(jī)制或分子靶標(biāo)等，但較常見的是基于結(jié)構(gòu)的差異將它們進(jìn)行劃分。如圖1所示，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的類型，抗菌肽通常被分為4大類，分別是α-螺旋肽；不含α-螺旋和β-折疊成分但通常富含特定氨基酸(如Gly、Arg、Trp或Pro)的線性延伸結(jié)構(gòu)；由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的β-折疊肽；同時(shí)包含α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的肽。α-螺旋目前是AMPs中研究的最為深入和廣泛的一類二級(jí)結(jié)構(gòu)，但已有研究表明某些α-螺旋肽提取工藝復(fù)雜、細(xì)胞毒性高以及抗菌效力參差不齊，限制了它們的應(yīng)用。而β-折疊肽依靠保守的半胱氨酸殘基之間的分子內(nèi)二硫鍵維持三維結(jié)構(gòu)，在相同條件下這類肽具有更加穩(wěn)定的二級(jí)構(gòu)象甚至更強(qiáng)的抗酶解能力。有研究表明β-折疊肽與具有相同電荷和疏水性的α-螺旋肽相比，具有相近的抗菌活性和更優(yōu)異的細(xì)胞選擇性，而且，當(dāng)穩(wěn)定β-發(fā)卡或β-折疊結(jié)構(gòu)抗菌肽中的二硫鍵被破壞時(shí)，所形成的線狀多肽仍能保持其抗菌特性。由于β-折疊AMPs所含的復(fù)雜二硫鍵合成困難且成本昂貴，其研究并不廣泛，因此β-折疊抗菌肽的研發(fā)對(duì)于未來AMPs的應(yīng)用轉(zhuǎn)化十分關(guān)鍵。

A. α-螺旋結(jié)構(gòu)；B.線性延伸結(jié)構(gòu)；C. β-折疊結(jié)構(gòu)；D. 同時(shí)包含α-螺旋和β-折疊元素A. α-helical structure；B. Linear extension structure；C. β-sheet structure；D. Contain both α-helical and β-sheet elements圖1 天然抗菌肽的常見結(jié)構(gòu)類型[13-14]Fig.1 Common structural classes of naturally occurring AMPs[13-14]

本文介紹了β-折疊抗菌肽的天然來源、分子設(shè)計(jì)及主要抑菌機(jī)理，同時(shí)對(duì)其應(yīng)用的局限性以及相應(yīng)的策略進(jìn)行了綜述，全方位描述了β-折疊抗菌肽的研究進(jìn)展，為該類肽的研發(fā)與利用提供參考。

1 天然源β-折疊抗菌肽

抗菌肽來源廣泛，作為非特異性天然防御系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道防線。這些廣泛來源的抗菌肽通常有著不同的結(jié)構(gòu)，β-折疊就被包括其中。根據(jù)來源，可以將β-折疊抗菌肽分為哺乳動(dòng)物源、昆蟲源、植物源以及微生物源等大類，在表1中列舉了較為常見的幾種天然β-折疊抗菌肽及其主要特征。

基于半胱氨酸的含量和結(jié)構(gòu)特征，可將β-折疊抗菌肽分為兩類，分別是β-發(fā)卡抗菌肽和α-defensins肽。β-發(fā)卡是反平行β-折疊結(jié)構(gòu)的最簡單形式，由兩個(gè)β-鏈和單個(gè)二硫鍵組成的環(huán)狀區(qū)域定義。β-發(fā)卡抗菌肽尺寸小且生物活性廣泛，在實(shí)際應(yīng)用方面受到研究人員更多關(guān)注，但天然β-發(fā)卡抗菌肽并不豐富，已知的β-發(fā)卡型抗菌肽家族不僅在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上有顯著差異，在生物合成途徑上也有顯著差異。Defensins肽跨越多個(gè)結(jié)構(gòu)類別，α-defensins是一個(gè)亞組，包括三條反向平行的β-側(cè)鏈，側(cè)鏈以“trans”排列與二硫鍵相連(即β鏈末端的兩個(gè)二硫鍵指向相反的方向，并連接兩個(gè)不同的側(cè)鏈)。α-defensins被認(rèn)為是通過基因復(fù)制而進(jìn)化的，存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，具有廣譜抗細(xì)菌、真菌和病毒的活性。這些肽含有保守的鹽橋結(jié)構(gòu)，有研究表明，鹽橋?qū)τ诙嚯牡恼Ｕ郫B和蛋白水解抗性是必需的，但對(duì)抗菌活性而言不是必需的。

表1 不同來源的幾種常見β-折疊抗菌肽

1.1 哺乳動(dòng)物源

哺乳動(dòng)物源抗菌肽已經(jīng)廣泛在動(dòng)物皮膚、腸道、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等多種生理系統(tǒng)和上皮組織表面分離鑒定，主要包括Cathelicidins、Defensins和Histatins 3大家族，研究最廣泛的為Defensins類抗菌肽。APD是一個(gè)集抗菌肽命名、分類、信息搜索、預(yù)測、設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)等多功能于一體的抗菌肽數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，截至目前APD數(shù)據(jù)庫共收錄有26種被明確鑒定為β-折疊結(jié)構(gòu)的哺乳動(dòng)物源AMPs，其中牛乳鐵蛋白Lfcin B和豬源Protegrin 1的研究較為深入。

1.2 昆蟲源

昆蟲免疫防御僅依賴于先天免疫，當(dāng)微生物突破身體的第一道防線時(shí)，昆蟲的先天免疫反應(yīng)就會(huì)被激活，快速產(chǎn)生大量的AMPs，使昆蟲迅速消滅入侵病原體。昆蟲源β-折疊抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、無免疫原性等特點(diǎn)，不僅對(duì)細(xì)菌和真菌有廣譜抗菌活性，對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有殺傷作用。目前,研究較為深入的昆蟲源β-折疊抗菌肽是擁有廣譜抗菌活性的Thanatin，此外還有從長臂天牛體內(nèi)分離出的擁有抗真菌功能的Alo-3。昆蟲作為世界上最大的生物種群，種類繁多，分布廣泛，因此昆蟲源β-折疊抗菌肽還具有巨大的發(fā)掘潛力。

1.3 植物源

植物中存在多種具有藥理作用的分子蛋白，β-折疊抗菌肽就是其中之一。當(dāng)各種病原體入侵時(shí)，多種β-折疊抗菌肽(如從紫花苜蓿中分離出的NCR169)能夠通過干擾細(xì)胞壁或膜脂的生物合成發(fā)揮抗菌活性。此外，植物源β-折疊抗菌肽富含保守的半胱氨酸殘基，擁有極高的穩(wěn)定性且能通過改變非半胱氨酸殘基的序列從而識(shí)別不同的靶點(diǎn)，預(yù)示著它們作為抗菌劑的巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1.4 微生物源

微生物源β-折疊抗菌肽是由微生物自身分泌的用來保護(hù)自己并殺滅或抑制其他細(xì)菌、真菌的小分子多肽，其主要來源于特定細(xì)菌，通常比抗生素穩(wěn)定，可以承受高溫和極端pH，但在自然和有機(jī)環(huán)境中的生物半衰期較短，主要通過作用于靶細(xì)胞膜來發(fā)揮作用。迄今APD共收錄了15種來自細(xì)菌的微生物源β-折疊抗菌肽，在食品保鮮和微生物感染治療等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

2 β-折疊抗菌肽抗細(xì)菌機(jī)理

大部分β-折疊抗菌肽可以直接作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，但有一些抗菌肽除了引起細(xì)胞膜損傷之外，還被證實(shí)可以通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)并結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)來殺死細(xì)菌，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的胞內(nèi)活動(dòng)。如圖2所示，根據(jù)作用位點(diǎn)的不同，一般β-折疊抗菌肽的抑菌機(jī)理可以分為兩類，分別是肽與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用以及肽與胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用。

圖2 抗菌肽的抗細(xì)菌作用機(jī)理[38]Fig.2 Action mechanism of AMPs against bacteria[38]

2.1 肽與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用

β-折疊抗菌肽與細(xì)胞膜的作用過程，首先陽離子殘基與靶細(xì)胞膜陰離子表面通過靜電相互作用彼此靠近，然后肽的兩親結(jié)構(gòu)域與磷脂雙分子層之間產(chǎn)生疏水相互作用，抗菌肽插入細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲漏和死亡。目前，最為經(jīng)典的抗菌肽膜作用模型有桶壁模型、地毯模型和環(huán)形孔模型，這幾種作用機(jī)制模型并不是相互獨(dú)立的，而在細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞過程中可能同時(shí)存在。由于β-折疊抗菌肽主要通過與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，過程中不涉及特定的靶標(biāo)，這也解釋了細(xì)菌難以產(chǎn)生耐藥性的原因。Bellamy等研究發(fā)現(xiàn)，Lactoferricin B能夠與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂和脂多糖結(jié)合并增加膜的通透性，且伴隨著溶液中鹽離子所帶正電荷的增加抑菌效果顯著降低；Sinha團(tuán)隊(duì)通過將Thanatin與DPC-d膠束相互結(jié)合闡述了Thanatin導(dǎo)致質(zhì)膜結(jié)構(gòu)擾動(dòng)的機(jī)制；Mani等使用F和H自旋擴(kuò)散核磁共振技術(shù)確定了Protegrin 1(PG-1)在陰離子膜和含膽固醇中性膜中的低聚物結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證了PG-1能誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞膜快速通透從而產(chǎn)生殺菌活性。

2.2 肽與胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用

起初人們認(rèn)為β-折疊抗菌肽的跨膜機(jī)制是其作用的唯一模式，但是越來越多的研究提供證據(jù)表明僅出現(xiàn)膜通透性不足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并由此發(fā)現(xiàn)了部分β-折疊抗菌肽存在細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)。例如通過抑制核酸的生物合成和代謝或抑制蛋白合成與折疊，進(jìn)而抑制和殺死病原菌，此外還有些能抑制細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁的生物合成。Leeuw等研究發(fā)現(xiàn)α-防御素類多肽HNP1可以通過與細(xì)胞壁前體脂質(zhì)II相互作用抑制肽聚糖的合成，從而影響細(xì)胞壁合成以及膜功能導(dǎo)致細(xì)菌死亡；在海洋類動(dòng)物的體腔細(xì)胞中分離出來的β-折疊類抗菌肽Arenicin-1可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的增加發(fā)揮抗真菌活性，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程；β-發(fā)卡肽Polyphemusin I通過作用于細(xì)胞內(nèi)與DNA和RNA相關(guān)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)從而造成細(xì)胞死亡。部分β-折疊多肽還可以與細(xì)胞穿透肽結(jié)合從而進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，兩種作用模式之間會(huì)表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系使細(xì)菌對(duì)于此類殺傷機(jī)制更難產(chǎn)生突變抗性。

3 β-折疊抗菌肽的分子設(shè)計(jì)

3.1 天然源β-折疊抗菌肽的改造

天然β-折疊抗菌肽由于具有二硫鍵維持三維結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性相對(duì)會(huì)更高，但是一些二硫鍵較少的天然β-發(fā)卡抗菌肽仍然會(huì)受到高濃度酶的快速降解，從而失去抑菌活性。有部分天然β-折疊抗菌肽擁有足夠的蛋白酶抗性，但缺少強(qiáng)效的抗菌活性，所以當(dāng)面臨這一系列的矛盾時(shí)，天然源抗菌肽的改造是一種有效手段。研發(fā)出具有良好抗菌活性和細(xì)胞選擇性的β-折疊抗菌肽，需要利用現(xiàn)有的生物工程技術(shù)對(duì)這些AMPs的抗菌活性、生物安全性和結(jié)構(gòu)關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)探究解析，近年來，各種優(yōu)化策略和分子設(shè)計(jì)技術(shù)的進(jìn)步為肽性能的合理改良和優(yōu)化提供了參考。目前，該方向的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，常見的改造方法包括氨基酸替換、肽鏈修飾、肽鏈雜合等。

β-折疊抗菌肽的功能及活性往往是由結(jié)構(gòu)所決定的，研究發(fā)現(xiàn)影響這些因素的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)包括凈電荷數(shù)、疏水性、兩親性、序列長度、氨基酸組成等?？傮w帶正電荷使β-折疊抗菌肽能與微生物膜的負(fù)電荷成分產(chǎn)生靜電相互作用，疏水基團(tuán)可以幫助其更深入地滲透細(xì)菌膜，從而決定β-折疊抗菌肽的抗菌效力，兩親性構(gòu)象也是肽具有膜活性不可或缺的，然而研究表明這些參數(shù)體現(xiàn)在構(gòu)效關(guān)系上時(shí)會(huì)有各自的閾值，它們之間縱橫交錯(cuò)、相互影響。因此在改造中不能盲目追求單個(gè)參數(shù)的最佳完美，而是要綜合考慮各個(gè)參數(shù)的影響，以期達(dá)到一個(gè)最優(yōu)的平衡點(diǎn)，使肽的抗菌活性和生物安全性趨向于更加合理。

3.1.1 氨基酸替代 在自然界中，許多生物體能產(chǎn)生天然β-折疊抗菌肽，利用這些肽作為起始模板對(duì)序列進(jìn)行修改，可以達(dá)到提高肽的抗菌活性和細(xì)胞選擇性的目的。氨基酸替代主要是對(duì)肽模板添加、刪除、替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基。Benfield等設(shè)計(jì)了一種新型肽，首先對(duì)Gomesin(GM)骨架進(jìn)行環(huán)化得到一種GM類似物cGM，當(dāng)濃度高于2 μmol·L時(shí)cGM會(huì)產(chǎn)生毒性并破壞癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，后來用D-Arg取代了原本在它第4、10和18位的Arg殘基從而合成了[R/r]cGM，在保留了殺菌功能的同時(shí)蛋白酶抗性明顯提高，并且解決了毒性過大的問題，可作為靶向和抗癌藥物的輸送系統(tǒng)而不損害健康細(xì)胞。另外，Dong等將Protegrin 1(PG-1)的β轉(zhuǎn)角序列添加上幾個(gè)簡單的氨基酸重復(fù)序列，設(shè)計(jì)了一系列末端對(duì)稱肽(XR)H(RX)(=1、2；X代表I、F、W和P；H代表CRRRFC)，并利用治療指數(shù)(therapeutic index，TI)，即最小溶血濃度MHC與最小抑菌濃度MIC幾何平均值的比值，評(píng)估多肽的細(xì)胞選擇性，其中，序列為(IR)H(RI)的β-折疊結(jié)構(gòu)IR2具有最高的TI，顯示出比PG-1更高的抗微生物效力，溶血活性和細(xì)胞毒性顯著低于PG-1。在改造過程中需要注意的是，β-折疊抗菌肽是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子，合理地去除非必須性質(zhì)的部分肽區(qū)域可以獲得較短的活性基序，降低大規(guī)模生產(chǎn)成本和衍生物的毒性或免疫原性，但此方法需要控制在合理范圍，因?yàn)榘被峤M成的輕微改變可能會(huì)改變整個(gè)幾何構(gòu)型甚至物理化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而會(huì)影響這些肽殺滅微生物的能力和對(duì)宿主細(xì)胞的毒性。

3.1.2 肽鏈修飾 β-折疊抗菌肽常見的肽鏈修飾方法主要有環(huán)化、聚乙二醇修飾、膽固醇修飾、末端區(qū)域修飾(乙酰化或酰胺化)等，這些肽鏈修飾策略的可行性已被廣泛證實(shí)，不僅能夠用于提高肽的活性、穩(wěn)定性和溶解性，提供更長的半衰期，也可以調(diào)節(jié)分子內(nèi)相互作用和疏水性甚至改變多肽呈現(xiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Lei等將人α-defensin 5(HD5)的末端進(jìn)行了十四烷酸(肉豆蔻酸)修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的肉豆蔻?；疕D5在體外具有顯著增強(qiáng)的廣譜殺菌活性，并且穩(wěn)定性明顯提高；Imura等將聚乙二醇連接到β-折疊肽Tachyplesin I的N端，發(fā)現(xiàn)多肽聚乙二醇化后膜通透性并沒有改變，而且抗菌活性顯著減弱，但細(xì)胞毒性顯著降低；Chan等采用固相化學(xué)合成法合成了環(huán)狀β-折疊抗菌肽Gomesin，與天然Gomesin相比，環(huán)化提高了Gomesin的體外穩(wěn)定性，增強(qiáng)了其對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用以及抗瘧疾活性。相比于其他改造方法，肽鏈修飾策略能夠賦予β-折疊抗菌肽更多本身所不具備的性能，甚至定向賦予某項(xiàng)特性，更加可控與便捷，是一種性價(jià)比很高的肽設(shè)計(jì)方法。

3.1.3 肽鏈雜合 肽鏈雜合是將不同優(yōu)勢肽或優(yōu)勢肽段通過某種方式組合成新的嵌合肽的一類方法，這種方法通常將有效但毒性相對(duì)較大的肽序列與活性較低但毒性較低的肽序列融合，同樣是設(shè)計(jì)新型β-折疊肽的一種簡單有效策略，研究表明，嵌合肽活性的增加歸因于每種肽組分同時(shí)作用于細(xì)菌的獨(dú)特機(jī)制。為了優(yōu)化具有較強(qiáng)細(xì)胞特異性和抗炎活性的抗菌肽，Liu等設(shè)計(jì)了基于Progetrin 1、Bovine lactoferricin的雙發(fā)卡雜合肽，發(fā)現(xiàn)合成的雜合肽LB-PG不僅對(duì)多種微生物表現(xiàn)出較高的選擇性，細(xì)胞毒性和溶血活性變低，還能抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。雖然研究表明了雜合肽比親本肽更有效，但雜合后導(dǎo)致肽鏈長度增加從而帶來的合成成本增加的問題也是不容忽視的，因此需要綜合考慮多種因素的影響。

3.2 全新設(shè)計(jì)

在抗菌肽幾十年的發(fā)展過程中，為進(jìn)一步降低抗菌肽的生產(chǎn)成本，研發(fā)活性高、序列短且組成簡單的β-折疊抗菌肽，抗菌肽的全新設(shè)計(jì)成為了研究的熱門，常見的方法有模板確立法和數(shù)據(jù)庫過濾篩選技術(shù)。

3.2.1 基于模板的設(shè)計(jì) 經(jīng)過幾十年的發(fā)展，抗菌肽模板的研究已經(jīng)越來越全面。模板序列可以通過比較已知的天然肽序列并篩選出對(duì)功能重要的參數(shù)獲得，與傳統(tǒng)的序列修飾方法相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)是其減少了為獲得理想結(jié)果而需要合成的肽的數(shù)量，從而在保持序列信息的同時(shí)降低研發(fā)成本。Shao等使用一種預(yù)測算法設(shè)計(jì)了最簡單的反平行β-發(fā)卡抗菌肽模板RWYXYZZRWYXY-NH，由兩條含有陽離子(X=Arg、Lys、His)和疏水殘基(Y=Val、Ile、Leu、Phe)的非共價(jià)鍵β-側(cè)鏈，通過剛性轉(zhuǎn)向區(qū)域(ZZ=Pro-Gly、D-Pro-Gly、Asn-Gly)連接而成，研發(fā)出的WKF-PG(RWFKFPGRWFKF-NH)和WRF-NG(RWFRFNGRWFRF-NH)可以通過直接的抗菌效果和抑制機(jī)體炎癥來治療細(xì)菌感染。Wu等設(shè)計(jì)了基于(XYXY)為模板的一系列肽，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)的水溶性多肽(IKIK)-NH和(IRIK)-NH對(duì)包括真菌在內(nèi)的多種微生物表現(xiàn)出強(qiáng)殺滅作用，同時(shí)保持低毒并具有中和內(nèi)毒素的能力，是真菌性角膜炎藥物的理想候選者。

3.2.2 數(shù)據(jù)庫過濾篩選 數(shù)據(jù)庫過濾篩選技術(shù)是一種利用數(shù)據(jù)庫對(duì)具有某種特定功能多肽的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行多步篩選，從而最終設(shè)計(jì)出具有目標(biāo)活性、性能更優(yōu)的全新肽的方法(圖3)。與傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)方法相比，該方法可以在最短的時(shí)間內(nèi)篩選出最優(yōu)序列，不僅節(jié)省大量成本,還可以用來預(yù)測或進(jìn)一步增強(qiáng)多肽的抗菌活性。隨著近年來大數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)的發(fā)展，基因組、蛋白質(zhì)組和功能信息的數(shù)據(jù)庫已逐漸成為抗菌藥物研發(fā)不可或缺的工具。Cherkasov等迭代構(gòu)建了兩個(gè)由9個(gè)氨基酸組成的隨機(jī)大型肽庫，通過Artificial Neural Networks(一種強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù))隨機(jī)預(yù)測超過10萬條虛擬肽的活性，篩選出的肽比目前最先進(jìn)的臨床候選抗菌肽更加有效，并且能有效殺滅超級(jí)耐藥細(xì)菌；Fjell等使用遺傳算法的啟發(fā)式搜索方法生成候選肽序列，它在識(shí)別新型高抗菌能力多肽方面有很大提高。盡管這種方法被認(rèn)為是有效的，但目前仍沒有明確的研究使用該方法設(shè)計(jì)全新β-折疊抗菌肽。

圖3 數(shù)據(jù)庫過濾篩選技術(shù)[69]Fig.3 Database filtering technology[69]

4 β-折疊抗菌肽的應(yīng)用策略

抗生素一直是人類抗擊致病菌最重要的武器，但由于無節(jié)制的使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)重，每年都有數(shù)以萬計(jì)的人和動(dòng)物因耐藥菌感染而死亡，因此世界上許多國家對(duì)抗生素的使用提出了嚴(yán)格限制。由于優(yōu)良的生物學(xué)活性、低毒性、豐富的化學(xué)多樣性和天然來源的可得性，抗菌肽成為抗生素的理想替代品。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，抗菌肽已逐漸應(yīng)用到畜牧、食品、化學(xué)、醫(yī)藥等許多行業(yè)。為使β-折疊抗菌肽得到更加合理的應(yīng)用，切實(shí)有效的策略是必不可少的，以下論述針對(duì)目前的研究熱點(diǎn)，從現(xiàn)實(shí)角度出發(fā)，介紹了β-折疊抗菌肽能夠在未來應(yīng)用轉(zhuǎn)化的兩個(gè)候選方向，分別是肽與納米載體的結(jié)合、肽與抗生素的協(xié)同應(yīng)用。

4.1 肽與納米載體的結(jié)合

無論是天然還是人工合成的β-折疊抗菌肽，大多數(shù)都具有廣譜抗菌活性。傳統(tǒng)觀點(diǎn)通常認(rèn)為抗菌肽所擁有的抗菌譜越廣，其應(yīng)用范圍就會(huì)越大，其實(shí)不然。當(dāng)一些活性較強(qiáng)的β-折疊抗菌肽應(yīng)用到機(jī)體尤其是被動(dòng)物采食進(jìn)入胃腸道之后，除了起到殺滅病原微生物的功效以外，還可能會(huì)不分青紅皂白地殺死體內(nèi)益生菌，造成機(jī)體菌群失調(diào)，甚至破壞健康微生物區(qū)系和免疫系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡。此外，當(dāng)β-折疊抗菌肽進(jìn)入體內(nèi)后，盡管分子內(nèi)二硫鍵的存在會(huì)使它們的穩(wěn)定性有所提高，但仍然需要面臨唾液、胃黏膜、血液和組織中存在的鹽離子和蛋白酶等影響，使其生物半衰期降低。而且，β-折疊抗菌肽在體內(nèi)的擴(kuò)散率也有限，運(yùn)輸效率相對(duì)較差，致使大多數(shù)給藥方法都需要高劑量。所以如果有一種能夠更加穩(wěn)定地將肽靶向運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)特定病原體附近而又不會(huì)殺滅益生菌的方法，將會(huì)極大緩解這些問題，無疑會(huì)更好地加速β-折疊抗菌肽的應(yīng)用進(jìn)展。

近年來，傳遞和釋放生物分子的納米生物技術(shù)得到快速發(fā)展。目前，已有的肽遞送納米載體材料提供了一種有效方法，這些納米載體材料往往尺寸小、比表面積大、靶向能力強(qiáng)、毒性低，它們通過包裹、持續(xù)釋放和延長活性來穩(wěn)定以及更好地保護(hù)β-折疊抗菌肽不受酶降解的影響，利用載體固有的靶向特點(diǎn)將β-折疊抗菌肽運(yùn)送至特定目標(biāo)以防止對(duì)有益菌造成殺傷。因此β-折疊抗菌肽結(jié)合納米材料后在體內(nèi)可能會(huì)具有長效的抗菌活性、更低的毒性和更高的穩(wěn)定性。一些納米顆粒(如納米纖維)，它們有很大的接觸面，可以攜帶幾個(gè)單層或多層抗菌肽并將其引導(dǎo)到特定的目標(biāo)，是β-折疊抗菌肽制劑理想的輸送系統(tǒng)。此外，一些無機(jī)納米材料(如金屬納米顆粒、磁性納米顆粒)以及一些有機(jī)納米材料(如脂質(zhì)體納米材料、聚合物納米材料等)，均可作為β-折疊抗菌肽良好的遞送載體。直徑<10 nm的顆粒會(huì)通過腎迅速代謝排出體外，>70 nm的顆粒在體內(nèi)滯留時(shí)間較長，最終會(huì)到達(dá)脾被吞噬細(xì)胞清除，因此納米顆粒的尺寸范圍也極大地降低了這些顆粒從體內(nèi)清除時(shí)所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。

新的納米制劑策略的有效性仍受到生產(chǎn)技術(shù)、苛刻溶劑的使用以及肽的各種物理化學(xué)性質(zhì)的限制。而且，用于生產(chǎn)這種納米載體的材料要求必須無毒、生物兼容、在加工過程中穩(wěn)定且適合與肽一同使用，因此，尋找用作納米載體的新型材料也是一項(xiàng)需要克服的任務(wù)。

4.2 肽與抗生素的協(xié)同應(yīng)用

很長一段時(shí)間來，研究人員對(duì)抗菌肽的研究主要集中在提純和鑒定抗菌肽、闡明各種肽的作用機(jī)制、生產(chǎn)類似的合成肽并檢測其生物物理特性以及對(duì)合成的抗菌肽進(jìn)行修飾來獲得具有更強(qiáng)殺菌性能的多肽等方面，但目前抗菌肽的商業(yè)化仍然存在許多障礙。在對(duì)抗菌肽研究中出現(xiàn)的一個(gè)新理念是抗菌肽與常規(guī)抗生素的協(xié)同作用。雖然許多肽本身具有顯著的抗菌活性，但要使肽在體內(nèi)發(fā)揮有效的活性往往需要更高的濃度。多肽與抗生素的混合物被發(fā)現(xiàn)能夠極大地提高抗微生物效果，而且導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌出現(xiàn)的概率更低，這樣就同時(shí)避免了肽的大量使用和抗生素的高劑量使用，從而降低了成本并減少了耐藥性產(chǎn)生，因此肽與抗生素之間的協(xié)同作用備受關(guān)注。目前，這一策略在β-折疊抗菌肽領(lǐng)域已經(jīng)有了成功的例子，Kim等設(shè)計(jì)了一種序列為FKVKFKVKVK-NH的β-折疊肽，他們將肽固定在聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂上合成了多肽-樹脂結(jié)合物，當(dāng)該結(jié)合物與萬古霉素和四環(huán)素混合使用時(shí)，發(fā)現(xiàn)溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的殺滅效果顯著增強(qiáng)；劉又銘等將LfcinB分別與土霉素、慶大霉素和阿莫西林聯(lián)合使用，驗(yàn)證了LfcinB和阿莫西林聯(lián)合作用的協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)，而與土霉素協(xié)同效應(yīng)最差，同時(shí)發(fā)現(xiàn)LfcinB與抗生素的協(xié)同作用對(duì)于革蘭陰性菌的抑制效果要優(yōu)于革蘭陽性菌。

目前，要完全放棄使用抗生素是不現(xiàn)實(shí)的，但可以將抗菌肽或擬肽類藥物與抗生素的優(yōu)勢結(jié)合起來，相輔相成。在未來，β-折疊抗菌肽與抗生素優(yōu)勢的結(jié)合可能會(huì)成為對(duì)抗耐藥細(xì)菌的有效手段，在減少細(xì)菌耐藥性降低成本方面發(fā)揮更大的作用。

5 小 結(jié)

過去幾十年，抗生素的過度和不當(dāng)使用導(dǎo)致了藥物殘留和細(xì)菌耐藥性問題出現(xiàn)，構(gòu)成了嚴(yán)重的全球健康問題，隨著各國政府一系列禁抗法令的頒布，給畜牧生產(chǎn)等行業(yè)造成極大沖擊，迫切需要尋求新的抗生素替代物質(zhì)。抗菌肽因?qū)Χ喾N細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和包膜病毒具有廣泛的活性，受到了越來越多的關(guān)注。盡管結(jié)構(gòu)上的一些優(yōu)勢讓?duì)?折疊抗菌肽被認(rèn)為是很有前途的飼用抗生素替代品，但是動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境高濃度的蛋白酶、生理濃度鹽離子等因素仍會(huì)造成一些短鏈β-發(fā)卡抗菌肽快速失活，此外β-折疊抗菌肽還面臨著活性差異大、生產(chǎn)成本高等問題，阻礙其在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。目前的方法，一方面可以通過對(duì)天然β-折疊抗菌肽進(jìn)行改造或者全新設(shè)計(jì)解決β-折疊抗菌肽活性低、毒性和成本高等問題，另一方面可通過與納米載體的結(jié)合或與抗生素的協(xié)同來提高其應(yīng)用潛力。這些研究進(jìn)展對(duì)于促進(jìn)β-折疊抗菌肽的應(yīng)用起到了一定的推動(dòng)作用，但關(guān)于β-折疊抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用方法和應(yīng)用效果均有待進(jìn)一步探究。相信隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和各學(xué)科的交叉融合，在不遠(yuǎn)的將來，β-折疊抗菌肽會(huì)成為替代抗生素的新一代飼料添加劑，為畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供新的動(dòng)力。