伍雪梅，楊 新，原亞杰，尹艷玲，賴 鵬，宋軍科，史懷平，趙光輝,3*

(1. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100； 3. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

隱孢子蟲(spp.)是一類重要的人獸共患寄生原蟲，主要寄生于人和多種動物的消化道，引起以腹瀉為主要癥狀的隱孢子蟲病，嚴重威脅著人和動物的健康。目前，已報道了47個隱孢子蟲有效種和100多個基因型，宿主范圍包括人和260余種動物。隱孢子蟲主要通過直接接觸、食源性和水源性途徑傳播，使得其在人、動物以及自然環(huán)境中廣泛存在。隱孢子蟲感染對宿主造成的危害與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫功能正常的宿主感染隱孢子蟲?？梢鸺毙宰韵扌愿篂a，而免疫功能缺陷的宿主(如艾滋病患者和器官移植患者)或免疫功能低下的幼齡兒童和新生動物感染隱孢子蟲會出現(xiàn)持續(xù)性水樣腹瀉，引起宿主嚴重脫水甚至危及生命。針對隱孢子蟲病的治療，目前,僅硝唑尼特獲得了美國食品和藥物安全局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)的批準，但該藥物對于免疫力低下和幼年易感宿主療效甚微。鑒于隱孢子蟲病的發(fā)生和發(fā)展與宿主的免疫狀況密切相關(guān)，弄清宿主抗隱孢子蟲感染的免疫防御機制可為發(fā)掘新的防控隱孢子蟲病藥物靶標和疫苗候選分子提供理論指導。

固有免疫和獲得性免疫應答在宿主早期防御和后期清除隱孢子蟲的過程中發(fā)揮著重要作用。在急性感染初期，固有免疫系統(tǒng)中的腸道上皮細胞、免疫細胞(如單核巨噬細胞、樹突狀細胞和NK細胞)、細胞因子(如γ-干擾素和白細胞介素-18)、趨化因子(如CXCL8和CXCL10)及補體(如MBL和C3b)參與了宿主早期防御和抵抗隱孢子蟲的入侵過程。被激活的固有免疫組分還會觸發(fā)并調(diào)節(jié)宿主獲得性免疫應答。獲得性免疫應答是宿主防御和清除隱孢子蟲的關(guān)鍵，特別是以CD4T細胞為主的細胞免疫應答，其中，Th1、Th2、Th17和Treg細胞亞群及其產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β等細胞因子在隱孢子蟲感染的早期防御、后期清除、炎癥反應和腸道損傷后修復中發(fā)揮作用，共同參與宿主的抗隱孢子蟲感染。但是截至目前，隱孢子蟲感染過程中CD4T細胞的調(diào)控、分化和應答機制尚未完全闡明。作為固有免疫應答的重要組成部分，補體分子可以通過3條激活途徑(經(jīng)典途徑、替代途徑及凝集素途徑)在感染局部發(fā)揮溶解病原、調(diào)理吞噬、介導炎癥、免疫黏附及細胞毒等作用。此外，局部激活的補體成分(如C3b、補體受體CD21/35和C5aR)還可以參與調(diào)節(jié)炎癥和獲得性免疫應答，特別是以CD4T細胞為主的細胞免疫應答，在一定程度上充當了固有免疫和獲得性免疫的樞紐。補體系統(tǒng)激活后，補體C5發(fā)生有限的蛋白水解，釋放過敏毒素C5a。C5a可通過與抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)或/和CD4T細胞上對應的G-蛋白偶聯(lián)受體C5aR結(jié)合，影響抗原的攝取以及共刺激分子、細胞因子、趨化因子等的表達，直接或間接地參與T細胞的激活、增殖、分化和效應過程。例如，在牛分枝桿菌()感染小鼠模型中，被感染小鼠分泌的C5a可與樹突狀細胞C5aR結(jié)合，通過影響IL-12 p70的分泌來參與Th1細胞免疫應答。通過對過敏性哮喘的研究發(fā)現(xiàn)，C5aR缺陷小鼠會出現(xiàn)BMDC過敏原的攝取受損，以及Th2和Th17細胞分化相關(guān)分子(如CD11b、IL-17A)的表達減少，表明C5aR可通過抑制CD4T細胞向Th2和Th17細胞分化來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應。此外，研究發(fā)現(xiàn)C5a在病毒(如流感病毒和登革熱病毒)、細菌(如李斯特菌)及寄生蟲(如瘧原蟲和克氏錐蟲)感染中發(fā)揮了一定的T細胞免疫調(diào)節(jié)作用。

隱孢子蟲感染會激活宿主補體系統(tǒng)，進而引起C5a/C5aR的上調(diào)表達，并且宿主主要依靠以CD4T細胞為主的細胞免疫應答來抵御隱孢子蟲感染，而補體C5a/C5aR信號可以直接或間接調(diào)控CD4T細胞免疫反應，但目前對于C5a/C5aR信號在隱孢子蟲感染過程中對CD4T細胞免疫反應的調(diào)控作用還不清楚。本研究以人獸共患為研究對象，在建立BALB/c乳鼠和C5aR抑制BALB/c乳鼠感染模型的基礎(chǔ)上，應用實時熒光定量PCR和免疫組織化學技術(shù)檢測感染前后乳鼠回腸組織中C5aR的表達變化，并利用實時熒光定量PCR檢測隱孢子蟲70基因和CD4T細胞亞群Th1、Th2、Th17細胞和Treg細胞主效應細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的轉(zhuǎn)錄變化，通過病理組織切片觀察乳鼠回腸黏膜的損傷情況，進而明確C5a/C5aR信號對隱孢子蟲致病性的影響，以及C5a/C5aR信號對隱孢子蟲感染中宿主CD4T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 蟲株

IIdA19G1亞型蟲株為河南農(nóng)業(yè)大學張龍現(xiàn)教授惠贈，經(jīng)亞型鑒定后由本實驗室保存，并在犢牛體內(nèi)進行傳代。

1.2 實驗動物

從成都達碩實驗動物有限公司購入100只性成熟(7周齡左右)的BALB/c小鼠，飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學實驗動物中心，飼喂SPF級的小鼠飼料，自由飲用無菌水，待其自由交配產(chǎn)出新生小鼠后，取5 d新生乳鼠進行動物試驗。

1.3 主要試劑

甲醛溶液(光華科技，中國)，二甲苯、氯仿和異丙醇(致遠化學，中國)，甲醇(華天生物，中國)，伊紅、蘇木素、吐溫20和DAB顯色試劑盒(索萊寶科技，中國)，TRIzol裂解液和DEPC(康為試劑，中國)， PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)，SP-0023 HistostainTM-Plus Kits (博奧森生物，中國)，C5aR兔多克隆抗體(三鷹生物，中國)，PMX 205(MedChemExpress，美國)。

1.4 微小隱孢子蟲感染BALB/c乳鼠模型的建立

1.4.1 動物感染試驗 將乳鼠禁食12 h，感染組乳鼠經(jīng)口接種1×10個卵囊，對照組乳鼠經(jīng)口灌服相同體積的PBS，并將感染組和對照組乳鼠分區(qū)飼養(yǎng)，防止交叉感染。

1.4.2 組織樣品的采集和處理 感染后(post infection，pi)6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d分別隨機選取感染組和對照組乳鼠各3只，在無菌條件下使用脫頸椎法處死乳鼠，分離回腸段。用PBS清洗兩次后放進無菌研缽，倒入少量液氮速凍后用研磨棒研碎組織，轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌無RNA酶離心管中，加入800 μL TRIzol，劇烈震蕩混勻后保存于-80 ℃用于提取總RNA。此外，收集感染高峰(7 dpi) 的回腸組織，用預冷的PBS洗去殘留血跡后，置于4%多聚甲醛溶液中固定后用于組織病理學觀察；同時收集7 dpi大腸內(nèi)容物置于1.5 mL離心管中，保存于4 ℃用于后續(xù)的改良抗酸染色。

1.4.3 組織樣品總RNA的提取和cDNA的合成 取出保存于TRIzol裂解液中的乳鼠回腸樣品，置于冰盒中自然融化10 min；加入160 μL氯仿，渦旋震蕩15 s，室溫靜置3 min；4 ℃，13 200 r·min離心15 min，吸取上清；加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置30 min；4 ℃，13 200 r·min離心15 min，棄上清；加入1 mL無水乙醇，4 ℃，13 200 r·min離心7 min； 棄上清，重復操作兩次；室溫開蓋晾干沉淀，加入適量DEPC水溶解，靜置5 min；吸取適量RNA樣品，并使用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質(zhì)量檢測，剩余樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆?。參照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書步驟合成樣品cDNA，合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 熒光定量PCR檢測隱孢子蟲70的轉(zhuǎn)錄情況 本試驗采用Garcés等建立的基于隱孢子蟲熱休克蛋白70(70ku heat shock proteins，HSP70)基因的熒光定量PCR方法對乳鼠回腸組織中的微小隱孢子蟲感染情況進行定量分析，以鼠特異性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。熒光定量PCR反應體系(20 μL)：10 μL 2× UltraSYBR Mixture、1 μL Primer mix、5 μL cDNA模板和4 μL RNase-free ddHO。反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，40個 循環(huán)。隱孢子蟲70 mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量用2-ΔΔ表示。

表1 Real-time PCR擴增引物

1.4.5 組織病理學觀察 將回腸樣品置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后依次進行組織修塊、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋和切片。將制作好的石蠟切片經(jīng)蘇木素和伊紅染色后封片，待切片干燥后，置于顯微鏡下進行觀察。每張切片選取5根最長的完整腸絨毛，分別測量絨毛長度、絨毛直徑、隱窩深度和腸黏膜厚度。

1.4.6 隱孢子蟲改良抗酸染色 將保存于1.5 mL 無菌離心管中的大腸內(nèi)容物用研磨棒碾碎；加入1 mL PBS，3 000 r·min離心10 min，棄上清，重復操作兩次；留殘液約200 μL，加PBS至1.5 mL，充分渦旋，靜置至離心管中大顆粒物沉降至管底；在沉淀上方略微渾濁處吸取20 μL液體,涂抹成“2 cm×2 cm” 的涂片；待涂片室溫風干后，滴加甲醇固定5 min， 隨后滴加石炭酸復紅染色液染色10 min， 水洗去浮色；滴加1%鹽酸酒精脫色液，脫色至淡粉色，水洗；滴加10倍稀釋的2%的孔雀綠染液，染色30 s，水洗；涂片經(jīng)室溫風干后置于400倍光學顯微鏡下進行觀察。

1.5 乳鼠回腸組織中C5aR的表達水平分析

1.5.1 C5aR的mRNA表達水平分析 在感染后1、2、3、4、5、6、7、9、10、15和30 d分別采集感染組和對照組乳鼠回腸組織樣本各3份，回腸組織的采集和處理，組織樣品總RNA提取，cDNA合成和熒光定量的反應體系及數(shù)據(jù)處理詳見“1.4.2～1.4.4”。引物序列見表1，引物由生工生物公司合成。

1.5.2 C5aR的蛋白表達水平分析 采集5 dpi乳鼠回腸組織制作石蠟切片，以C5aR兔多克隆抗體(抗體稀釋度1∶200)作為一抗，參照SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫組化染色試劑盒說明書步驟進行免疫組織化學分析，使用Image-Pro Plus對C5aR陽性細胞在乳鼠回腸組織的表達水平進行評估，計算其平均光密度值(平均光密度值=累計光密度值/細胞分布的區(qū)域面積)。

1.6 微小隱孢子蟲感染C5aR抑制乳鼠模型的建立

對于C5aR抑制組的5日齡BALB/c乳鼠，在接種卵囊前6 h，根據(jù)體重經(jīng)口灌喂3 mg·kg的C5aR抑制劑(即PMX 205)，隨后經(jīng)口接種1×10個卵囊，并每隔3 d再依體重補灌PMX 205以建立感染C5aR抑制乳鼠模型。感染后1、2、3、4、5、6、7、9、10、15和30 d，從C5aR抑制組(C5aRa)中隨機抽取3只乳鼠，無菌分離回腸組織。組織樣品的采集和處理、組織樣品總RNA提取和cDNA合成方法詳見“1.4.2～1.4.3”。參照“1.4.4”詳述的操作步驟檢測C5aR抑制組各時間點乳鼠回腸組織中隱孢子蟲70的轉(zhuǎn)錄情況。同時采集C5aR抑制組5 dpi的回腸組織，參照“1.4.5”操作進行組織病理學觀察。

1.7 熒光定量PCR測定CD4+ T細胞亞群細胞因子的mRNA表達量

選取對照組、感染組、C5aR抑制組1、2、3、4、5、6、7 dpi回腸組織cDNA樣品，以鼠特異性作為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR檢測Th1、Th2、Th17和Treg細胞主效應細胞因子基因-γ、-4、-17和-β的轉(zhuǎn)錄情況。引物序列和退火溫度見表1，引物均由生工生物公司合成。反應體系和操作均參照“1.4.4”所述。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件，采用Student’s檢驗進行統(tǒng)計學差異分析。當>0.05時，差異不顯著；當0.01<<0.05時，差異顯著；當<0.01時，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 C. parvum感染BALB/c乳鼠模型的建立

利用基于隱孢子蟲70基因的實時熒光定量PCR進行感染情況的檢測發(fā)現(xiàn)，在6 hpi即可檢測到70基因的轉(zhuǎn)錄，持續(xù)到25 dpi，感染高峰出現(xiàn)在7 dpi(圖1A)。采集7 dpi的感染組乳鼠大腸內(nèi)容物進行改良抗酸染色，發(fā)現(xiàn)大量玫瑰紅色或暗紅色卵囊(圖1B)。通過對7 dpi的感染組和對照組乳鼠回腸組織進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，感染組的乳鼠回腸組織中出現(xiàn)隱孢子蟲寄生和中性粒細胞及炎性細胞浸潤(圖1C)，并伴隨著回腸絨毛脫落、萎縮和斷裂，回腸末端黏膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞、上皮細胞損傷和細胞間隙變寬(圖1D)。

A. C. parvum感染乳鼠回腸組織中微小隱孢子蟲HSP70相對轉(zhuǎn)錄量分析；B. C. parvum感染乳鼠(7 dpi)大腸內(nèi)容物抗酸染色結(jié)果(400×)，箭頭所指為微小隱孢子蟲卵囊；C. C. parvum感染乳鼠(7 dpi)回腸組織HE染色結(jié)果(400×)，a，c. 對照組乳鼠，b，d. 感染組乳鼠，感染組回腸紋狀緣有微小隱孢子蟲(箭頭處)，固有層有淋巴細胞(星形)和中性粒細胞(三角形)浸潤；D. C. parvum感染乳鼠(7 dpi)回腸組織病理變化的統(tǒng)計分析結(jié)果。*.P<0.05，**.P<0.01A. Analysis of relative transcription levels of C. parvum HSP70 in ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; B. Acid-fast staining results for contents in large intestines of suckling mice (7 dpi) infected with C. parvum (400×), with the arrow indicating C. parvum oocyst; C. HE staining results of ileum tissues of suckling mice (7 dpi) infected with C. parvum (400×), a, c. Suckling mice in control group, b, d. Suckling mice in infected group, C.parvum (arrow) in the striated border of ileum in infected group, and lymphocyte (star) and neutrophils (triangle) infiltration in lamina propria; D. Statistical analysis of pathological lesions in ileum tissues of suckling mice (7 dpi) infected with C. parvum; *. P<0.05，**. P<0.01圖1 微小隱孢子蟲感染BALB/c乳鼠模型的建立Fig.1 Establishment of a BALB/c suckling mouse model infected with C. parvum

2.2 C. parvum感染乳鼠回腸組織中C5aR的表達分析

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，感染引起乳鼠回腸組織中C5aR轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化，感染組C5aR的 mRNA水平在4、5、7、15和30 dpi均顯著高于對照組(<0.05)，并在5 dpi達到峰值(圖2)。同時，采用免疫組織化學技術(shù)對5 dpi乳鼠回腸組織C5aR的蛋白水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)C5aR主要分布于腸上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞表面(圖3A)，并且感染組C5aR的蛋白水平也顯著高于對照組(<0.01)(圖3B)。

*.P<0.05; **P<0.01圖2 C. parvum感染乳鼠回腸組織中C5aR的 mRNA轉(zhuǎn)錄分析Fig.2 Analysis of the mRNA expression of C5aR in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum

A. 乳鼠回腸組織C5aR的免疫組化染色結(jié)果(5 dpi)，a和e. 陰性對照組(對照組)，b和f. 試驗組(對照組)，c和g. 陰性對照組(感染組)，d和h. 試驗組(感染組)；B. 乳鼠回腸組織在400倍鏡下5個隨機視野中C5aR平均陽性強度的統(tǒng)計分析結(jié)果(5 dpi),*.P<0.05，**.P<0.01A. Immunohistochemical staining results for C5aR in ileum tissues of sucking mice (5 dpi), a and e. Negative control group (control group), b and f. Experimental group (control group), c and g. Negative control group (infected group), d and h: Experimental group (infected group); B. Statistical analysis of C5aR average positive expression intensity in ileum tissues of suckling mice in five random fields under 400 times microscope (5 dpi), *. P<0.05, **. P<0.01圖3 C. parvum感染乳鼠回腸組織中C5aR的表達分析Fig.3 Analysis of C5aR expression in ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum

2.3 C5a/C5aR信號對C. parvum感染乳鼠回腸組織中CD4+ T細胞亞群細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用

2.3.1 C5a/C5aR信號對Th1細胞主效應因子-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示，感染組乳鼠回腸組織Th1細胞主效應分子-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在多數(shù)時間點(2、4、5、6和7 dpi)顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)，并在6 dpi達到高峰(圖3A)。與感染組乳鼠相比，C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在2、4、6 dpi出現(xiàn)顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)(圖4A)。

A. C. parvum感染乳鼠回腸組織中IFN-γ轉(zhuǎn)錄量的變化情況；B. C. parvum感染乳鼠回腸組織中IL-4轉(zhuǎn)錄量的變化情況；C. C. parvum感染乳鼠回腸組織中IL-17轉(zhuǎn)錄量的變化情況；D. C. parvum感染乳鼠回腸組織中TGF-β轉(zhuǎn)錄量的變化情況。柱上的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)A. Changes in the transcription of IFN-γ in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; B. Changes in the transcription of IL-4 expression in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; C. Changes in the transcription of IL-17 expression in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum; D. Changes in the transcription of TGF-β expression in the ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum. Different lowercase letters above the bars indicated significant differences (P<0.05)圖4 C5a/C5aR信號對C. parvum感染乳鼠CD4+ T細胞亞群相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用Fig.4 Regulatory effect of C5a/C5aR signaling on cytokines related to CD4+ T cell subsets in suckling mice infected with C. parvum

2.3.2 C5a/C5aR信號對Th2細胞主效應因子-4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 熒光定量PCR結(jié)果表明，感染組乳鼠回腸組織中Th2細胞主效應因子-4的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，在2、3 dpi顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄，但在4、7 dpi又顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)(圖4B)；C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-4轉(zhuǎn)錄量相較于感染組在2、4和6 dpi顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)。

2.3.3 C5a/C5aR信號對Th17細胞主效應因子-17 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 乳鼠回腸組織中Th17細胞主效應因子-17的熒光定量PCR結(jié)果顯示，感染組-17 mRNA轉(zhuǎn)錄量僅在3 dpi顯著高于對照組(<0.05)，而在5、6 dpi顯著低于對照組轉(zhuǎn)錄水平(<0.05)(圖4C)；而C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-17 mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平在2、3、4和5 dpi顯著高于感染組(<0.05)(圖4C)。

2.3.4 C5a/C5aR信號對Treg細胞主效應因子-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用熒光定量PCR測定感染乳鼠回腸組織中Treg細胞主效應因子-β mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，-β在多數(shù)時間點(1、2、4、5、6和7 dpi)顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)(圖4D)，而有趣的是，C5aR抑制組乳鼠回腸組織中-β在4、6和7 dpi也顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(<0.05)， 僅在1、3 dpi相較于感染組轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)(<0.05)(圖4D)。

2.4 C5a/C5aR信號對C. parvum在乳鼠回腸組織中增殖的影響

利用基于隱孢子蟲70基因的實時熒光定量PCR對C5aR抑制組乳鼠回腸組織中的微小隱孢子蟲感染情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，與單純感染組相比，C5aR抑制組乳鼠回腸組織中隱孢子蟲70的 mRNA轉(zhuǎn)錄量僅在2、3、4和5 dpi顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄，且在3 dpi達到高峰值，而在其余多數(shù)時間點(1、6、7、9、10、15和30 dpi)均顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(圖5)。此外，通過采集對照組、感染組和C5aR抑制組的乳鼠回腸組織(5 dpi)進行組織病理學觀察，發(fā)現(xiàn)感染組和C5aR抑制組乳鼠回腸絨毛刷狀緣有隱孢子蟲寄生(圖6A)；同感染組相比，C5aR抑制組回腸絨毛長度顯著縮短、萎縮(<0.01)，絨毛變細(<0.05)且黏膜厚度明顯變薄(<0.05)，但絨毛長度與隱窩深度比值差異不顯著(>0.05)(圖6B)。

*.P<0.05; **.P<0.01圖5 C. parvum感染C5aR抑制乳鼠回腸組織中HSP70轉(zhuǎn)錄分析Fig.5 Analysis of HSP70 expression level in ileum tissues of suckling mice treated with C5aR inhibitor during C. parvum infection

A. C. parvum感染乳鼠(5 dpi)回腸組織HE染色結(jié)果(400×)；B. C. parvum感染乳鼠(5 dpi)回腸組織病理變化的統(tǒng)計分析結(jié)果。*.P<0.05，**.P<0.01，ns.P>0.05；箭頭指示的為微小隱孢子蟲卵囊A HE staining results of ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum at 5 dpi (400×); B. Statistical analysis of changes in ileum tissues of suckling mice infected with C. parvum at 5 dpi. *. P<0.05, **. P<0.01, ns. P>0.05; the arrow indicates C. parvum oocyst圖6 C5a/C5aR信號對C. parvum在乳鼠回腸組織中增殖的影響Fig.6 Effect of C5a / C5aR signal on the proliferation of C. parvum in the ileum tissues of infected suckling mice

3 討 論

隱孢子蟲病是由隱孢子蟲感染引起的一種人獸共患原蟲病，嚴重威脅著人類的健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。然而，目前尚缺少有效防控隱孢子蟲病的藥物和疫苗，主要是由于對隱孢子蟲致病機制和宿主免疫防御機制的認識有限。為了更有效地闡明蟲體與宿主的互作機制，人們構(gòu)建了多種感染動物模型，包括多品系的小鼠、犢牛、仔豬和羔羊等，其中最常用的動物模型是新生犢牛模型和小鼠模型。近年來，已有多種感染小鼠模型(如地塞米松免疫抑制的SCID小鼠、BALB/c小鼠和KM小鼠模型以及T和B細胞免疫缺陷的SCID小鼠)被成功構(gòu)建并廣泛應用于隱孢子蟲病的免疫學研究和抗微小隱孢子蟲的藥物篩選。本研究針對幼年動物對的高度易感性，構(gòu)建了一種感染BALB/c乳鼠模型，模型研究結(jié)果表明,在6 hpi即可在BALB/c乳鼠的回腸組織中檢測到隱孢子蟲70基因的表達，一直持續(xù)到25 dpi，感染高峰出現(xiàn)在7 dpi，感染可以引起乳鼠的腸道病理損傷和炎癥反應。與其他隱孢子蟲感染模型相比，本研究建立的BALB/c乳鼠模型在感染過程中不需要使用地塞米松進行免疫抑制，可以模擬幼年動物的自然感染過程，通過對感染結(jié)果的定性定量監(jiān)測，可以更加真實地反映出感染對幼年動物的影響，為深入研究蟲體與宿主的互作機制提供了候選模型。

研究表明，固有免疫和獲得性免疫應答在宿主抵御和清除隱孢子蟲的感染中發(fā)揮重要作用，尤其是以CD4T細胞為主的細胞免疫應答。感染可以通過經(jīng)典途徑和凝集素途徑來激活宿主的補體系統(tǒng)。當補體系統(tǒng)被激活后，一方面，補體可以作為固有免疫系統(tǒng)的重要成分來發(fā)揮免疫效應；另一方面，補體激活后通過有限的蛋白水解釋放過敏毒素C5a，C5a通過結(jié)合固有免疫細胞或/和獲得性免疫細胞上的特異性受體C5aR來調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應和獲得性免疫應答，進而參與抗感染免疫反應。通過對感染BALB/c乳鼠模型的進一步研究，作者發(fā)現(xiàn)感染可以引起B(yǎng)ALB/c乳鼠回腸組織中C5aR表達水平的動態(tài)改變，并且在大多數(shù)時間點呈現(xiàn)上調(diào)表達，這與之前報道的感染可以引起小鼠脾和小腸淋巴組織中C5aR表達水平的動態(tài)變化相符，提示C5a/C5aR信號可能參與了宿主與隱孢子蟲的相互作用過程。

過敏毒素C5a可與C5aR結(jié)合啟動C5a/C5aR信號，進而誘導CD4T細胞亞群的分化和效應，對T細胞免疫應答起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),隱孢子蟲感染引起宿主CD4T細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β等細胞因子，共同參與宿主抗隱孢子蟲感染過程。本研究以感染的BALB/c乳鼠為研究對象，分析了感染對CD4T細胞亞群分化的影響，發(fā)現(xiàn)感染主要引起乳鼠回腸組織中Th1細胞主效應因子-γ的顯著上調(diào)表達，表明隱孢子蟲感染乳鼠主要誘導了Th1型免疫效應，而之前的研究表明-γ敲除的C57BL/6小鼠表現(xiàn)出對更易感，這提示感染可以誘導Th1細胞亞群分化，進而在宿主抗隱孢子蟲感染中發(fā)揮作用。在使用PMX 205抑制C5aR后，感染乳鼠回腸組織中Th1細胞主效應因子-γ和隱孢子蟲70均先顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄(1～5 dpi)后顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄(6～7 dpi)，提示C5a/C5aR信號在感染乳鼠過程中可能通過調(diào)節(jié)Th1細胞主效應因子IFN-γ的產(chǎn)生來影響在乳鼠回腸中的增殖，這種調(diào)節(jié)作用與C5a/C5aR信號通路在腦瘧疾和弓形蟲感染小鼠模型中引起的Th1細胞主效應因子IFN-γ的上調(diào)作用一致。感染可以刺激宿主Th2細胞亞群分泌IL-4，IL-4在后期清除隱孢子蟲中有重要作用，但在本研究中感染乳鼠及C5aR抑制乳鼠回腸組織-4 mRNA水平均呈動態(tài)變化，無明顯變化趨勢，表明C5a/C5R信號在微小隱孢子蟲感染乳鼠中對Th2細胞主效應因子IL-4的調(diào)節(jié)作用并不明顯。此外，研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞效應因子-17和Treg細胞效應因子-β在感染中除具有炎癥調(diào)節(jié)和抗感染作用外，還可減輕對宿主腸上皮細胞的損傷。通過口服C5aR抑制劑的方式對BALB/c乳鼠的C5aR進行抑制，發(fā)現(xiàn)抑制C5aR可引起感染乳鼠早期(1～5 dpi)回腸組織中Th17細胞和Treg細胞主效應細胞因子-17和-β在多數(shù)時間點顯著上調(diào)表達，同時，抑制C5aR還可顯著改善感染引起的乳鼠回腸組織的絨毛直徑和黏膜厚度變化，提示C5a/C5aR信號可能通過上調(diào)IL-17和TGF-β的產(chǎn)生以改善隱孢子蟲感染引起的腸道損傷，降低隱孢子蟲感染引起的腸道屏障破壞。綜上，C5a/C5aR信號可能通過動態(tài)調(diào)節(jié)CD4T細胞亞群主效應細胞因子的表達來參與宿主與隱孢子蟲相互作用的過程，但對其具體的調(diào)控機制以及C5a/C5aR信號在隱孢子蟲與宿主互作中發(fā)揮的作用還需要進一步的深入探討。

4 結(jié) 論

在建立了一種感染BALB/c乳鼠模型的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)感染可以引起B(yǎng)ALB/c乳鼠回腸組織中C5aR的上調(diào)表達，并且主要誘發(fā)宿主Th1型免疫效應。進一步的研究表明，C5a/C5aR信號可能通過動態(tài)調(diào)節(jié)CD4T細胞亞群主效應細胞因子的表達來參與宿主與隱孢子蟲相互作用的過程。